Инсульт остается второй ведущей причиной смерти в мире и основной причиной стойкой нетрудоспособности у выживших пациентов [1]. В зависимости от этиологии выделяют острый ишемический инсульт и внутричерепное кровоизлияние (геморрагический инсульт). Геморрагический инсульт, уступая ишемическому по частоте встречаемости, ассоциирован с более высокой летальностью и ограниченным арсеналом возможных терапевтических вмешательств [2].

Независимо от типа инсульта, развивающийся дисбаланс между метаболическими потребностями центральной нервной системы и их обеспечением инициирует каскад повреждения мозговой ткани и гибель нейронов. В основе патогенеза ишемического инсульта лежит снижение мозгового кровотока вследствие окклюзии церебральных артерий или системной гипоперфузии. При геморрагическом инсульте метаболическая недостаточность выступает следствием разрыва сосудистой стенки и кровопотери [3].

Патофизиологические механизмы ишемического и геморрагического инсульта имеют как общие черты (окислительный стресс, нейровоспаление и пр.), так и существенные различия. Для повреждения при ишемическом инсульте особую значимость имеют эксайтотоксичность и внутриклеточная перегрузка ионами кальция [4, 5]. Для геморрагического инсульта характерно развитие первичного повреждения от самого кровоизлияния (масс-эффект), а также вторичного повреждения вследствие токсического воздействия компонентов крови — ионов железа и тромбина и развития отека [6].

Мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат) — российский лекарственный препарат, обладающий антигипоксической, антиоксидантной и мембраностабилизирующей активностью [7]. Показано, что Мексидол подавляет развитие глутаматной эксайтоксичности, ингибирует нейровоспаление, апоптоз и стимулирует нейропластичность [8, 9]. В многочисленных доклинических исследованиях была доказана эффективность и безопасность Мексидола в комплексной терапии ишемического инсульта [7, 9].

В многоцентровом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании при длительной последовательной терапии у пациентов в остром и раннем восстановительном периодах полушарного ишемического инсульта Мексидол статистически значимо по сравнению с плацебо улучшал жизнедеятельность пациентов по mRS, уменьшал неврологический дефицит при тестировании по шкале NIHSS и способствовал статистически значимому повышению качества жизни (опросник EQ-5D) и снижению количества пациентов с симптомами депрессии (шкала Бека) [10].

В другом проспективном международном многоцентровом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании в параллельных группах была показана более значимая эффективность терапии с использованием препаратов Мексидол и Мексидол ФОРТЕ 250 по сравнению с плацебо у пациентов в остром и раннем восстановительном периодах ишемического инсульта средней степени тяжести в отношении снижения степени инвалидизации пациентов, выраженности неврологического дефицита, расширения двигательных возможностей и повышения уровня мобильности [11].

В то же время лишь в единичных исследованиях оценивалась возможность применения Мексидола в терапии геморрагического инсульта [12, 13]. Учитывая разные звенья патогенеза геморрагического и ишемического инсульта, необходима комплексная доклиническая и клиническая оценка эффективности Мексидола при данной патологии.

Цель исследования — оценка нейропротективного потенциала Мексидола при его системном введении в различных лекарственных формах на модели геморрагического инсульта.

Материал и методы

Исследование выполнено на 130 аутбредных крысах-самцах массой 180—200 г в возрасте 7—8 нед. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен комиссией по биоэтике (протокол №134 от 06.06.2023).

Все животные были распределены в три серии: 1-я серия — внутривенное введение Мексидола, 2-я серия — внутримышечное введение Мексидола, 3-я — внутрижелудочное введение Мексидола. В 1-й и 2-й сериях было по 4 группы: 1-я группа — интактные животные, 2-я группа — контроль, животные, которым моделировали патологию и вводили эквивалентный объем физиологического раствора, 3-я и 4-я группы — введение Мексидола в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг соответственно.

В 3-й серии было сформировано 5 групп: 1-я группа — интактные животные, 2-я группа — контроль, животные, которым моделировали патологию и вводили эквивалентный объем физиологического раствора, 3-я, 4-я и 5-я группы — введение Мексидола в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно. В каждой группе было по 10 крыс. Мексидол использовался в виде субстанции (ООО «НПК «Фармасофт», России) и разводился стерильным физиологическим раствором (ООО «Мосфарм», Россия). Животных распределяли в группы случайным образом, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальная масса животных не отличалась более чем на 10% от средней массы животных в эксперименте.

Острый аутогеморрагический инсульт моделировали в области внутренней капсулы правого полушария. Операцию выполняли в условиях общей анестезии (хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг). По достижении глубокого наркоза проводили забор крови с помощью шприца из хвостовой вены крысы. Затем проводили линейный разрез кожи головы в теменной области. Разрез выполняли во фронтальной плоскости с последующим проведением гемостаза, длина разреза составляла 1,0 см. В дальнейшем выполняли скелетирование кости и отделение надкостницы. С помощью стоматологического бора делали трепанационное отверстие в правой теменной области диаметром 2 мм. В дальнейшем с помощью пункционной иглы и стереотаксиса вводили пункционную иглу в область внутренней капсулы (координаты: H=4 мм, L=3 мм, А=1,5 мм от брегмы по атласу G. Paxinos) на глубину 3 мм. Затем в стерильных условиях вводили аутокровь в объеме 0,05 мл/кг веса. Введение крови осуществляли струйно. Эффективность введения определяли по наличию стволовых судорог. После чего пункционную иглу извлекали, рану осушали и производили ушивание раны с контролем гемостаза. После операции животных помещали в большие клетки с чистыми опилками по 5 особей. Ложнооперированным животным воспроизводили все манипуляции, только вместо аутокрови в мозг вводили физиологический раствор. Введение Мексидола или физиологического раствора начинали после того, как животные выходили из наркоза (через 30 мин после моделирования инсульта).

Через сутки после операции проводили клинический осмотр всех животных с целью регистрации клинического проявления инсульта по шкале оценки неврологического дефицита (Stroke-Index McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной) [14], после чего животных выводили из эксперимента и выполняли томографию головного мозга.

Микро-КТ головного мозга крыс выполняли в Центре доклинических исследований ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет). Для этого мозг крыс фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 2 дней. После фиксации производили проводку в этаноле восходящей концентрации (50%, 70%, 80%, 90%, 96%). Время экспозиции органа в каждом растворе — 1 ч. Затем мозг помещали в 1% раствор йода в 96% спирте на 14 ч. Образцы отмывали от йода в 96% спирте в течение часа. Для сканирования образцы помещали в пластиковый контейнер, заполненный 96% спиртом. Сканирование производили при параметрах: 90kV, 200uA, фильтр Al+Cu. Реконструкция производилась в программе NRecon, интегрированной с томографом Bruker. Рендеринг производился в программе 3DSlicer. Образцы просматривали в классическом черно-белом режиме. Оценку повреждений мозга производили на основе измерения размеров области повреждении.

Статистический анализ проводился с помощью программы GraphPad Prism v. 8.1.2. Данные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение (M±SD). Статистическую значимость различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. Различия при p<0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

В первые сутки после операции все крысы имели клинические симптомы инсульта. Суммарный балл неврологических нарушений составил 1,55±0,37 (таблица).

Влияние внутривенного введения Мексидола на выраженность клинических симптомов и площадь очага поражения при геморрагическом инсульте (M±SD)

Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001; **** — p<0,0001 — статистически значимые различия по сравнению с контролем; ^# — p<0,05; ^## — p<0,01; ^### — p<0,001 — статистически значимые различия по сравнению с ложно-оперированными животными (дисперсионный анализ ANOVA, post-hoc-критерий Тьюки).

Внутривенное введение Мексидола в дозе 100 мг/кг приводило к статистически значимому снижению выраженности клинических симптомов через 24 ч после операции по сравнению с контрольными животными — на 54,8% (p=0,0012). Неврологический дефицит у животных данной группы не отличался от значений у крыс, подвергнутых ложной операции. Внутримышечное введение Мексидола также вызывало снижение неврологического дефицита: в дозе 50 мг/кг — на 31,25% (p=0,0231), в дозе 100 мг/кг — на 46,88% (p=0,0004). В то же время изучаемый показатель у животных, получавших обе дозы Мексидола, статистически значимо (p<0,05) превосходил показатель у животных, подвергнутых ложной операции.

Внутрижелудочное введение Мексидола в дозе 100 мг/кг и 200 мг/кг вызывало уменьшение выраженности неврологического дефицита по сравнению с контрольными животными на 43,75% (p=0,0014) и 62,5% (p<0,0001) соответственно. Неврологический статус животных при введении Мексидола в дозе 200 мг/кг не отличался от неврологического статуса животных, подвергнутых ложной операции (p>0,05). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Мексидол при разных способах введения (внутривенном, внутримышечном и внутрижелудочном) оказывает дозозависимое нейропротективное действие на модели внутримозгового кровоизлияния.

Дополнительно в рамках настоящего исследования оценивалось влияние разных способов введения Мексидола на размер очага поражения в головном мозге крыс через 24 ч после моделирования патологии по данным микро-КТ (таблица).

На КТ-изображении головного мозга животных контрольной группы, получавших внутривенно физиологический раствор, при моделировании острого фокального инсульта наблюдался очаг кровоизлияния на уровне базальных ядер объемом 0,155±0,053 мм³, при внутримышечном введении — 0,156±0,047 мм³, при внутрижелудочном введении — 0,164±0,033 мм³. При внутривенном введении Мексидола в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг очаг поражения в головном мозге крыс статистически значимо не отличался от такового у контрольных животных, имелась лишь тенденция к снижению объема поражения при введении в дозе 100 мг/кг — на 30,96% (p=0,092). При этом у животных данной серии объем очага поражения достоверно не отличался от значений у животных, которым выполнялась ложная операция и в мозговую ткань вводился физиологический раствор.

Внутримышечное введение Мексидола во всех дозах не влияло на объем очага поражения, его значения статистически значимо не отличались от значений в контрольной группе (p>0,05) и одновременно превышали значения у животных, подвергнутых ложной операции.

Внутрижелудочное введение Мексидола в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг также не влияло на объем очага поражения, его значения статистически значимо не отличались от значений у контрольных животных (p>0,05) и превышало значения у животных, подвергнутых ложной операции. Однако введение Мексидола в дозе 200 мг/кг приводило к статистически значимому снижению объема очага поражения — на 35,37% (p=0,0123) по сравнению с контролем (до уровня ложнооперированных животных, с их значениями отсутствовали достоверные различия) (рисунок).

Микро-КТ головного мозга крысы.

а — ложнооперированная крыса; б, в, г — внутрижелудочное введение Мексидола в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно. Очаг острого фокального инсульта показан внутри окружности.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что внутривенное и внутрижелудочное введение Мексидола в высоких доза может способствовать уменьшению объема очага поражения.

Обсуждение

Несмотря на значительный прогресс в терапии острого ишемического инсульта, результаты лечения внутримозговых кровоизлияний остаются неутешительными. Неблагоприятный прогноз при данной патологии детерминируется такими факторами, как объем гематомы и ее локализация. В рандомизированных клинических исследованиях оценивалась возможность ограничения размера и распространения кровоизлияния путем гемостаза, снижения артериального давления и хирургического вмешательства [15]. Однако, за исключением хирургической эвакуации гематомы у тщательно отобранной группы пациентов [16], ни одно другое вмешательство не продемонстрировало улучшения функциональных результатов.

Не менее важное значение в течении и отдаленных исходах внутричерепного кровоизлияния играет вторичное повреждение головного мозга. Различные компоненты крови активируют цитотоксические, эксайтотоксические, окислительные и воспалительные пути. Тромбин, железо и гемоглобин из гематомы являются основными факторами, способствующими вторичному повреждению головного мозга после внутричерепного кровоизлияния. Геморрагический инсульт сопровождается развитием нейровоспаления, ведущего к отеку мозга и нарушению целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) под воздействием нейротоксических агентов, таких как тромбин, фибрин и эритроциты.

Накопление эритроцитов, в частности, способно активировать микроглию через Toll-подобные рецепторы 4 (TLR4), стимулируя высвобождение TNFα и IL-1β. Развивающийся воспалительный ответ сопровождается рекрутированием лейкоцитов посредством молекул адгезии, что усугубляет повреждение эндотелия и плотных контактов ГЭБ, а также привлекает дополнительные иммунные клетки. Микроглия и макрофаги участвуют в фагоцитозе эритроцитов и клеточного детрита [3]. Воспаление после внутримозгового кровоизлияния может приводить к образованию большого количества свободных радикалов, что провоцирует усиление повреждения головного мозга. Активация нейтрофилов сопровождается нарушением работы дыхательной цепи, высвобождением большого количества активных форм кислорода и азота, что в конечном итоге приводит к активации перекисного окисления липидов. Чрезмерное окисление липидов изменяет физические свойства клеточных мембран и может вызывать модификацию белков и нуклеиновых кислот, приводя к повреждению головного мозга. Продукты распада клеток крови, такие как ионы железа и гем, могут напрямую приводить к повреждению мозга, образуя большое количество свободных радикалов [17].

В настоящем исследовании оценивалась эффективность разных доз препарата Мексидол при разных способах введения (внутривенном, внутримышечном и внутрижелудочном) при моделировании внутричерепного кровоизлияния. Экспериментальным животным вводили примерно 10 мкл крови в область внутренней капсулы головного мозга, что соответствует 4,4 мл крови в головном мозге человека, если учесть общий объем мозга 2,7 мл у крысы [18] и 1200 мл у человека [19]. Данная модель внутримозгового кровоизлияния имитирует небольшие остаточные гематомы после хирургического удаления тромба у пациентов [20]. Например, только 58% пациентов, перенесших операцию в рамках исследования MISTIE III, достигли заранее установленной хирургической цели — объема остаточного тромба ≤15 мл [21].

В ходе настоящего исследования было показано, что внутривенное, внутримышечное, внутрижелудочное введение Мексидола улучшает неврологическое состояние животных и уменьшает площадь очага поражения. Препарат оказывал дозозависимое действие: статистически значимый эффект проявлялся при введении Мексидола в максимальных дозах. Выраженная эффективность Мексидола может быть обусловлена тем, что он влияет на основные патогенетические звенья повреждения мозга при внутричерепном кровоизлиянии. В частности, показано что Мексидол проявляет выраженную антиоксидантную активность, оказывает мембраностабилизирующее действие, улучшает энергопродукцию при гипоксии, а также оказывает противовоспалительное действие, подавляет апоптоз и стимулирует нейрорегенерацию [7—9].

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при небольших внутричерепных гематомах, в том числе остающихся, например, после хирургического удаления первоначальной гематомы, Мексидол оказывает выраженное нейропротективное действие, уменьшая выраженность неврологического дефицита при всех способах введения, а также уменьшая объем гематомы при внутривенном и внутрижелудочном введении. Таким образом, комбинированная терапия с применением Мексидола после хирургического удаления гематомы может быть перспективным направлением лечения геморрагического инсульта.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Щулькин А.В.; эксперименты на животных — Черных И.В., Щулькин А.В.; написание текста — Абаленихина Ю.В., Правкин С.К.; научное редактирование — Щулькин А.В., Абаленихина Ю.В., Правкин С.К.

Authors contribution: research concept and design — Shchulkin A.V.; animal experiments — Chernykh I.V., Shchulkin A.V.; text writing —Abalenikhina Yu.V., Pravkin S.K.; scientific editing — Shchulkin A.V., Abalenikhina Yu.V., Pravkin S.K.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.