Инсульт — заболевание, приводящее к развитию неврологического дефицита, инвалидизации пациентов и даже к летальному исходу. Считается, что каждая минута ишемии приводит к гибели 1,9 млн нейронов [1]. Заболеваемость инсультом в Российской Федерации в 2010 г. составляла 3,27 случая на 1000 населения, смертность — 0,96 на 1000 населения. К 2014 г. заболеваемость инсультом снизилась до 2,85 на 1000 населения (по сравнению с 2009 г. — на 30%), смертность составила 0,4 на 1000 населения [2]. Подходы к лечению инсульта за последние 25 лет претерпели существенные изменения. Нейропротекция и реваскуляризация на данный момент считаются основными методами терапии ишемического инсульта (ИИ) [2].

Мексидол (этилметилгидроксипиридина сукцинат) — оригинальный российский антиоксидант и антигипоксант, обладающий выраженной нейропротективной активностью [3]. В многочисленных клинических исследованиях, в том числе рандомизированных плацебо-контролируемых [4, 5], была доказана эффективность Мексидола в терапии ИИ. В метаанализе 11 исследований (2 — рандомизированные контролируемые, 9 — нерандомизированные незаслепленные когортные) было показано позитивное влияние Мексидола на течение ИИ у взрослых пациентов в виде статистически значимого при сопоставлении с группой сравнения уменьшения значений по шкале NIHSS на 7—10 и 21—24-е сутки и по модифицированной шкале Рэнкина (МШР) на 5—7 и 10—14-е сутки. Показан накопительный эффект препарата: разница значений по шкале NIHSS росла по мере увеличения длительности наблюдения. Эффект влияния Мексидола на показатели по шкале NIHSS был тем более значим, чем выше была исходная выраженность неврологического дефицита [6]. Во всех данных исследованиях Мексидол применялся у пациентов, которым не проводилась тромболитическая терапия.

Для проведения клинических исследований по оценке эффективности и безопасности совместного применения Мексидола и тромболитических препаратов первоначально необходимо проведение доклинических испытаний.

Цель исследования — изучение в опытах in vitro влияния препарата Мексидол на фибринолитическую активность препаратов актилизе, метализе и фортелизин.

Материал и методы

Лабораторные животные. Исследование было одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО «РязГМУ им. акад. И.П. Павлова» (выписка №101 от 16.12.2024). В работе использовали плазму и тромбы, полученные из цельной крови 50 крыс-самцов Wistar массой 400—500 г. Животные содержались в условиях конвенционального вивария с системой «чистого» и «грязного» коридоров, автоматической сменой дневного и ночного периодов (08:00—20:00 — «день», 20:00—08:00 — «ночь») и как минимум 10-кратной сменой воздушного объема комнаты в 1 ч. Стандарты содержания животных определены Директивой 2010/63/EU по защите животных, используемых в научных целях. В качестве приемлемых границ параметров микроклимата в комнатах содержания животных приняты границы, определенные руководством The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington D.C., 2010). Крысы содержались группами по 5 особей в клетках на подстиле. В комнате, где содержались животные, поддерживались температура 21—24 °C и влажность 55—65%.

Под золетил-ксилазиновым наркозом (20—30 и 5—10 мг/кг в/м) у крыс из нижней полой вены забирали кровь в пробирки типа вакутейнер с прокоагулянтом (красная крышка) или цитратом (голубая крышка).

Дизайн исследования. Выбор концентраций тромболитических препаратов, использованных в исследовании, был обусловлен их концентрацией в плазме крови человека после внутривенного введения в терапевтических дозах. В качестве контроля использовали плазму крови, содержащую 1% физраствора по объему. На каждую концентрацию каждого препарата было по 3 повторения.

Мексидол вводили в концентрациях 0,1, 1, 10 мкг/мл; актилизе (алтеплаза) — 0,5, 2 и 15 мкг/мл [7]; метализе (тенектеплаза) — 0,1, 1 и 10 мкг/мл [8]; фортелизин — 0,5, 1,5 и 5 мкг/мл [9].

Оценка тромболитической активности [10, 11]. Цельную кровь разливали в три разные пробирки типа вакутейнер объемом 5 мл с прокоагулянтом (пробирки с красной крышкой) по 1,5 мл и крови давали свернуться при комнатной температуре в течение 10 мин. Пробирки закрывали крышками, чтобы избежать загрязнения и гемолиза в результате испарения воды. После этого пробирки инкубировали на водяной бане с регулируемой температурой при 37 °C в течение 3 ч, чтобы обеспечить полное формирование тромба и его отделение от краев пробирок. После формирования тромбов сыворотку осторожно удаляли с краев пробирки пастеровской пипеткой, не нарушая образования сгустка.

В заключение пробирки были полностью высушены с помощью фильтровальной бумаги. Вес сгустка вместе с пробиркой определяли с помощью электронных весов. Вес тромба рассчитывали путем вычисления разницы между весом пробирки, содержащей тромб, и весом пустой пробирки. Пробирки с тромбом были надлежащим образом промаркированы для дальнейших экспериментов. Для сравнения эффективности тромболитика и комбинации тромболитика с Мексидолом использовались тромбы, полученные от одного и того же животного.

Приготовление объединенной плазмы. У крыс забиралась кровь в пробирки типа вакутейнер с цитратом натрия (с голубой крышкой) объемом 4,5 мл. Сразу после взятия крови образцы центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость центрифугировали при 1200 g в течение 15 мин. Полученная плазма от разных животных пулировалась в пробирке на 50 мл, а затем разливалась по центрифужным пробиркам по 15 мл и хранилась при –80 °C до выполнения анализа.

Оценка фибринолитической активности веществ. К пробиркам с тромбом добавляли 1 мл цитратной плазмы с растворенными в ней веществами или физиологическим раствором (контроль) и инкубировали на водяной бане при температуре 37 °C в течение 3 ч. Затем плазму забирали в микроцентрифужную пробирку после осторожного встряхивания сгустка. Плазму центрифугировали при 1200 g в течение 5 мин, а надосадочную жидкость переносили в две пробирки типа эппендорф (одна аликвота была запасной) и хранили при –80 °C до определения D-димера. После удаления плазмы тромбы взвешивали, исходя из разницы веса пробирки до и после инкубации (вес разрушенного тромба=вес пробирки, содержащей тромб до инкубации, – вес пробирки, содержащей тромб после инкубации).

В плазме крови крыс после инкубации с тестируемыми веществами анализировали концентрации D-димера методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов для крыс CEA506Ra ELISA Kit for D-Dimer («Cloud-Clone», КНР).

Поскольку на крови крыс фортелизин не проявил фибринолитической активности, дополнительно были выполнены эксперименты по оценке безопасности взаимодействия Мексидола и фортелизина на человеческой крови (была получена от здорового донора из центра переливания крови, подписавшего информированное согласие).

Статистический анализ — полученные результаты обрабатывались с помощью программы GraphPad Prism версии 8.1.2. Данные представлены как среднее арифметическое (M)±стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость различий при сравнении более двух групп оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Даннетта (сравнение выполнялось с контролем). Для сравнения двух групп использовали t-критерий Стьюдента. Значения p<0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Для оценки эффективности тромболитических препаратов, Мексидола и их комбинаций анализировали процент изменения массы тромба при его инкубации с тестируемыми веществами в течение 3 ч при 37 °C. Мексидол во всех протестированных концентрациях 0,1—10 мкг/мл статистически значимо не влиял на массу тромба. Данный показатель не отличался от значений контроля (табл. 1).

Таблица 1. Влияние Мексидола и его комбинации с тромболитиками на массу тромба (M±SD)

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: * — p<0,05, ** — p<0,01, *** — p<0,001 — статистически значимые различия с контролем.

Актилизе в концентрации 15 мкг/мл вызывала уменьшение тромба на 27,68±9,45% (p<0,0001 по сравнению с показателями контроля), а в концентрации 2 мкг/мл — на 15,72±4,38% (p=0,0011). В концентрации 0,5 мкг/мл актилизе существенного эффекта на массу тромба не оказала (процент лизиса 4,58±1,57, p=0,322). Комбинирование актилизе и Мексидола во всех протестированных концентрациях достоверного влияния на эффективность тромболитика не оказало, процент лизиса тромба между группами изолированного применения актилизе и комбинации актилизе и Мексидола не отличался (см. табл. 1).

Метализе в концентрации 10 мкг/мл вызывала уменьшение тромба на 22,53±2,83% (p<0,0001 по сравнению с показателями контроля), в концентрации 1 мкг/мл — на 9,57±2,31% (p<0,0001), в концентрации 0,1 мкг/мл — на 3,76±1,04% (p=0,0115). Комбинирование метализе и Мексидола во всех протестированных концентрациях значимого влияния на эффективность тромболитика не оказало, процент лизиса тромба между группами изолированного применения метализе и комбинации метализе и Мексидола существенно не отличался (см. табл. 1).

Фортелизин во всех протестированных концентрациях статистически значимо не уменьшал массу тромба. Комбинирование фортелизина и Мексидола во всех протестированных концентрациях достоверного эффекта на действие тромболитика не оказало, процент лизиса тромба между группами изолированного применения фортелизина и комбинации фортелизина и Мексидола не отличался (см. табл. 1).

При изучении влияния тромболитиков и их комбинаций с Мексидолом на концентрацию D-димера были получены следующие результаты. Мексидол во всех протестированных концентрациях (0,1—10 мкг/мл) при инкубации с тромбом в течение 3 ч достоверно не влиял на уровень D-димера, его величина от показателей контроля статистически значимо не отличалась (табл. 2).

Таблица 2. Влияние Мексидола и его комбинации с тромболитиками на уровень D-димера, нг/мл (M±SD)

Актилизе в концентрации 15 мкг/мл вызывала увеличение концентрации D-димера по сравнению с контролем на 70,9% (p=0,055), а в остальных концентрациях статистически значимого эффекта не оказала (p>0,05). Комбинирование актилизе и Мексидола во всех протестированных концентрациях достоверного влияния на эффективность тромболитика не оказало, уровень D-димера между группами изолированного применения актилизе и комбинации актилизе и Мексидола достоверно не отличался (см. табл. 2).

Метализе в концентрации 10 мкг/мл вызывала увеличение концентрации D-димера по сравнению с контролем на 37,4% (p=0,0022), а в остальных концентрациях статистически значимого эффекта не оказала (p>0,05). Комбинирование метализе и Мексидола во всех протестированных концентрациях достоверного влияния на эффективность тромболитика не оказало, уровень D-димера между группами изолированного применения метализе и комбинации метализе и Мексидола достоверно не отличался (см. табл. 2).

Фортелизин в концентрациях 5 и 1,5 мкг/кг при длительности воздействия 3 ч статистически значимо не влиял на уровень D-димера. Комбинирование фортелизина и Мексидола во всех протестированных концентрациях достоверного влияния на эффективность тромболитика не оказало, уровень D-димера достоверно между группами изолированного применения фортелизина и комбинации фортелизина и Мексидола не отличался (см. табл. 2).

Поскольку на плазме крови крыс фортелизин не проявил фармакологической активности, дополнительно были выполнены эксперименты по оценке безопасности взаимодействия Мексидола и фортелизина на человеческой крови. В ходе исследования было установлено, что фортелизин в концентрации 5 мкг/мл вызывал уменьшение массы тромба на 39,69±15,97% (p<0,001 по сравнению с показателями контроля), в концентрации 1,5 мкг/мл — на 33,12±2,48% (p=0,001), в концентрации 0,5 мкг/мл — на 17,79±5,24% (p=0,078). Комбинирование фортелизина и Мексидола во всех протестированных концентрациях достоверного влияния на эффективность тромболитика не оказало, процент лизиса тромба достоверно между группами изолированного применения фортелизина и комбинации фортелизина и Мексидола не отличался (табл. 3).

Таблица 3. Влияние фортелизина и его комбинации с Мексидолом на процент лизиса тромба в человеческой крови

Обсуждение

В рамках настоящего исследования в опытах in vitro впервые была оценена возможность комбинации Мексидола и тромболитических препаратов (актилизе, метализе и фортелизин), применяющихся при реперфузионной терапии пациентов с ИИ. Реваскуляризационная терапия на данный момент является самым эффективным способом лечения ИИ. Так, в метаанализе, включающем 10 рандомизированных клинических исследований (6887 пациентов), было показано, что применение алтеплазы в течение 6 ч после начала ИИ снижает риск летального исхода или инвалидизации (ОШ 0,84; 95% ДИ 0,77—0,93, p=0,0006) и что эффект является наибольшим в течение первых 3 ч (ОШ 0,68; 95% ДИ 0,53—0,87, p=0,002) [12].

В рандомизированном клиническом исследовании FRIDA (n=385) было показано, что применение в первые 4,5 ч от момента развития ИИ фортелизина в дозе 10 мг ассоциировано с благоприятным функциональным исходом (МШР 0—1 балл) через 90 дней у 50% пациентов в сравнении с 40% пациентов, которым вводилась алтеплаза в дозе 0,9 мг/кг (p<0,0001) [13].

В метаанализе, включавшем 2842 пациента с ИИ, было показано, что достижение оптимального функционального результата (МШР 0—1 балл) у пациентов, получивших тенектеплазу в дозе 0,25 мг/кг, значимо не различалось с алтеплазой в дозе 0,9 мг/кг (ОШ 1,17, 95% ДИ 0,98—1,39; p=0,08) [14].

В настоящем исследовании было установлено, что Мексидол не оказал самостоятельного фибринолитического действия: масса тромбов и уровень D-димера после воздействия тестируемого вещества не изменялись. В то же время актилизе и метализе вызывали лизис тромба. При этом метализе проявляла фармакологическую активность в более низких концентрациях, поэтому метализе применяется в виде болюса, а актилизе — болюса+инфузии. При введении актилизе (10 мг болюс за 2 мин, затем 50 мг за 1 ч) поддерживается равновесная концентрация вещества от 3,31 до 2,2 мг/л [15], а при внутривенном болюсном введении метализе в дозе 50 мг ее концентрация падает за 120 мин с примерно 10 до 1 мкг/мл [16].

Интересно, что фортелизин практически не влиял на массу тромба крыс (процент лизиса тромба <5), что может быть связано с видоспецифическим действием препарата. Например, показано, что низкая фибринселективность тромболитика у собак обусловлена замедленным ингибированием α2-антиплазмином плазмин-стафилокиназного комплекса [17].

При изучении фибринолитической активности актилизе и метализе при их комбинировании с Мексидолом было показано, что Мексидол во всех протестированных концентрациях не влияет на способность тромболитиков лизировать тромбы, анализируемую по проценту уменьшения массы тромба и уровню D-димера. Следовательно, Мексидол может безопасно комбинироваться с данными лекарственными препаратами для реперфузионной терапии. При оценке фибринолитической активности фортелизина на тромбах людей было показано, что тромболитик эффективно лизировал тромбы, а Мексидол достоверно не влиял на его активность, что свидетельствует о безопасности их совместного назначения.

Заключение

Таким образом, в ходе настоящего исследования было показано, что Мексидол во всех протестированных концентрациях не влияет на способность изучаемых тромболитических препаратов (актилизе, метализе и фортелизин) лизировать тромбы, анализируемую по проценту уменьшения массы тромба и уровню D-димера.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.