Исследование микробиоты (сообщества микробов организма, которые представляют собой резидентную микрофлору) проводится уже более 300 лет, но недавно (в 2001 г.) было введено другое понятие — микробиом, т.е. совокупность геномов микроорганизмов, составляющих микробиоту. В 2011 г. было проведено первое исследование микробиома глазной поверхности (ГП) методом секвенирования рДНК, что расширило представление о микробиальном сообществе ГП, так как количество микроорганизмов, выявляемых с помощью метагеномного исследования, было значительно больше того, которое ранее определяли с помощью культурального метода [1].

За последние годы возросло число опубликованных материалов исследований, посвященных изучению микробиоты и микробиома ГП. Как известно, микроорганизмы, колонизирующие различные органы и слизистые оболочки организма, такие как кишечник, ротовая полость и слизистые оболочки половой системы, оказывают значительное влияние на поддержание гомеостаза и иммунной защиты [2]. В некотором приближении можно говорить о том, что представление о значимости влияния комплекса микроорганизмов на состояние ГП было унаследовано из работ, рассматривающих другие органы, в частности кишечник. Сейчас нет сомнений, что изменения в кишечной микробиоте могут способствовать развитию таких состояний, как ожирение, сахарный диабет, онкологические заболевания, воспалительные заболевания кишечника [3—5]. Полученные данные вызвали большой интерес к исследованию других локальных сообществ микроорганизмов для поиска взаимосвязи между изменением количественного и качественного состава микробиоты и возникновением патологических состояний. Поиски такой взаимосвязи происходят и в исследованиях по изучению микробиома ГП, однако однозначное мнение относительно ее основной микробиоты до сих пор не сформировано [6].

Понятие «нормальная микрофлора ГП» очень условно. В большинстве случаев этот термин определяет состав микрофлоры в отсутствие заболеваний непосредственно органа зрения и его придаточного аппарата, и это сразу порождает вопрос, включать ли в ограничительный список, например, рефракционные искажения или не затронувшие орган зрения системные заболевания. Очевидно, что вариабельность данных о составе микрофлоры ГП отчасти будет связана с некорректными ограничениями базовой выборки исследуемых лиц. Ряд исследователей приходят к выводам, что к изменениям в составе глазной микробиоты чаще всего приводят следующие состояния: ношение мягких контактных линз (МКЛ), синдром «сухого глаза» (ССГ), сахарный диабет [7—10]. Также известно, что эти состояния являются факторами, способствующими развитию воспалительных заболеваний ГП. В настоящем обзоре, посвященном преимущественно «нормальной» микрофлоре ГП, мы вынужденно коснемся этих сопутствующих состояний. Помимо строгого подхода к формированию выборки здоровых лиц, являющихся источником вещественного материала для исследования, влияние на качественное и количественное представление о микробиальном составе ГП будет оказывать выбранный метод исследования.

В данном обзоре проводится сравнительный анализ доступных материалов исследований, посвященных изучению ГП разными бактериологическими методами (культуральный, микроскопические, молекулярно-генетические) для выявления закономерностей в различии получаемых данных, определения состава микробиома здоровой ГП. Дополнительно проанализированы источники, в которых описано влияние использования МКЛ на состав микроорганизмов, колонизирующих ГП. Также даны характеристики различных «визуализирующих» методов оценки микробиологического сообщества в пределах ГП. Впервые совокупность микроорганизмов, характерная для условно здоровой ГП и выявляемая культуральным, молекулярно-генетическим и микроскопическим методами, представлена в виде удобных таблиц с таксономической и фенотипической классификацией.

Исследование микробиологического разнообразия здоровой глазной поверхности

Культуральный метод

Исторически основным способом исследования микроорганизмов являлся традиционный культуральный метод. У него есть свои преимущества и недостатки. К положительным сторонам относится его высокая доступность. Ограничениями же представляются длительность ожидания результатов исследования (5—7 сут) и неуверенность в том, что все виды живых микроорганизмов, присутствовавших в пробе, дали рост или, наоборот, что случайная контаминация образца в процессе забора материала не оказалась представлена в качестве легитимного результата анализа.

По мере появления новых открытий в микробиологии происходило расширение филогенетической, морфологической и биохимической классификаций микроорганизмов [11]. Появились селективные питательные среды, биохимические тесты и специальные условия для культивирования, что увеличило диагностическую ценность метода и повысило производительность выполнения теста, однако не решило проблему медленнорастущих микроорганизмов. Попытки специального исследования «нормальной» микрофлоры не включают протоколов длительного культивирования, которые применяются при воспалительных заболеваниях ГП. Кроме этого, идентификация микроорганизмов сложна при малом количестве биологического материала, которое характерно при заборе с условно здоровой ГП.

В большинстве случаев данные о нормальной микрофлоре поступают из исследований, для которых набирают «группу контроля». Иными словами, представление о нормальной микрофлоре является побочным продуктом изучения патологических состояний глаза. По этой причине алгоритмы, принятые для исследований воспалительных заболеваний глаза, будут оказывать влияние на данные о микробиальном составе здоровой ГП.

В идеализированном варианте (который редко реализуется на практике) бактериологическое исследование включает в себя следующие этапы: преаналитический, аналитический и постаналитический [12]. В первом, преаналитическом этапе непосредственное участие принимает врач-клиницист, который задает траекторию дальнейшего исследования, поскольку именно он определяет место и способ забора биологического материала, хранение и транспортировку полученных образцов и предполагает возможный инфекционный агент [13, 14]. Это, в свою очередь, оказывает влияние на выбор микробиологом питательных сред и условий, необходимых для исследования материала [14, 15]. Забор проб для посева с ГП обычно производится врачом-офтальмологом и зависит от локализации воспалительного очага. Стерильным ватным зондом-тампоном биологический материал собирают из нижнего свода конъюнктивы (конъюнктивит), с роговичного инфильтрата (кератит), из слезного мешка (каналикулит, дакриоцистит), с края век (блефарит) [16—18]. Затем собранные образцы помещают в пробирку с жидкой питательной средой для дальнейшей транспортировки в бактериологическую лабораторию [19]. Таким образом, продуктивное взаимодействие между клиницистом и микробиологической лабораторией является залогом успешного исследования.

Результаты изучения микробиологического разнообразия здоровой глазной поверхности культуральным методом

При анализе источников литературы, в которых приводятся результаты исследований микробиоты ГП традиционным культуральным методом, выделенные с образцом микроорганизмы относятся в основном к типам Firmicutes и Actinobacteria и являются грамположительными (табл. 1). Намного реже встречаются бактерии, относящиеся к Proteobacteria и Bacteroidetes. Основные роды бактерий, которые были выделены со здоровой ГП: Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Micrococcus, Corynebacterium [6], [20—26]. Также с нормальной ГП были выделены грибы, наиболее представленными среди которых были Aspergillus, Penicillium, Nigrospora, Candida, Fusarium (табл. 2). Однако в статьях, посвященных изучению микробиоты глаза при ношении МКЛ, результаты посева отличаются. Увеличивается доля микроорганизмов, которые относятся к типам Proteobacteria и Bacteroidetes, появляются условно-патогенные роды бактерий: Pseudomonas, Klebsiella, Moraxella, Proteus [27—29]. В связи со стремительно развивающейся практической офтальмологией и появлением новых методов коррекции аметропий важным остается вопрос, какое влияние на состав микрофлоры ГП оказывают нарушения рефракции. Кроме того, не до конца изучено, насколько быстро меняется состав микрофлоры после перехода от контактной коррекции к хирургическим или бесконтактным методам и на каких сроках после отказа от контактной коррекции микробиом можно считать снова «нормальным».

Таблица 1. Виды и типы бактерий, выделенные с нормальной ГП культуральным методом

Примечание. *c (cocci) — коккоморфные микроорганизмы; dc (diplococci) — диплококки; b (bacilli) — палочковидные с умеренным удлинением, неспорообразующие; sfb (spore-forming bacilli) — палочковидные с умеренным удлинением, спорообразующие; pb (polymorphic bacilli) — палочковидные с умеренным удлинением, неспорообразующие, полиморфные.

Таблица 2. Грибковая флора, характерная для ГП в норме

Примечание. КЛТ — культуральное исследование; МГМ — молекулярно-генетические исследования.

Отрицательные результаты посевов биологических образцов варьируют от одной статьи к другой (от 1,0 до 90,0%). Такие расхождения могут быть связаны с методическими различиями. Забор образцов проводится из разных тканей (инфильтраты роговицы, удаленный хрусталик) и с поверхности контактировавших с глазом объектов, таких как край века, своды конъюнктивы, МКЛ, слезная жидкость и раствор для хранения МКЛ. Наибольший процент отрицательных посевов наблюдается при заборе материала непосредственно с поверхности роговицы, конъюнктивы и из слезной жидкости. В этих случаях подавленный рост может быть связан с тем, что ГП постоянно омывается слезной жидкостью, содержащей антибактериальные компоненты, такие как лизоцим, лактоферрин, β-лизин [30]. Этим же отчасти можно объяснить различия в видах и количестве выделенных из образцов бактерий. В ряде публикаций сообщается о выделении нескольких видов микроорганизмов из одного образца (обычно не более четырех), однако в большинстве случаев описан мономикробный рост.

Кроме того, очевидно, что культивирование сильно зависит от выбранных сред. Например, статистический анализ показал более высокий рост грамположительных кокков в сердечно-легочном бульоне по сравнению с кровяным агаром с 5% овечьей кровью [21]. В ряде исследований забранные образцы сначала помещали в жидкую питательную среду, а затем осуществляли субкультивирование на твердые питательные среды, а другие авторы использовали либо только жидкие, либо только твердые среды для посева [6, 22, 27].

Методы микроскопии первичного материала

С давних времен помимо культивирования предпринимались попытки микроскопии мазков соскобов и блоков удаленной ткани в качестве низкоспецифической экспресс-диагностики. Преимуществами данной методики считаются скорость получения результатов, непосредственный визуальный контроль, относительно несложный процесс пробоподготовки. В настоящее время выделяют два основных вида микроскопии: световая и электронная.

Световая микроскопия позволяет исследовать морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов [31]. Используют следующие методы окрашивания: по Граму, по Гимзе, по Цилю—Нильсену (выявление кислотоустойчивых микроорганизмов), метенамином серебра по Гомори, фиксацию раствором гидроксида калия, окрашивание лактофенолом хлопковым голубым [32].

При изучении нормальной микробиоты ГП в некоторых исследованиях для визуального контроля колонизирующих микроорганизмов использовалась микроскопия первичного материала с окрашиванием по Граму [26]. Однако в основном методы микроскопии используются в исследованиях, направленных на диагностику воспалительных заболеваний роговицы [33]. В частности, много исследований посвящено оценке применения микроскопического исследования с различными методами окрашивания при грибковых инфекциях переднего отрезка глаза. Оцениваются их чувствительность и специфичность, положительная и отрицательная прогностическая ценность при выявлении инфекционного агента. При микроскопическом исследовании визуализируются гифы, мицелий, конидии, грибковые клетки. Также нашла применение флюоресцентная микроскопия, в частности окраска калькофлюором белым для визуализации дрожжеподобных и нитевидных грибов, так как данный краситель имеет высокую тропность к хитину их клеточной стенки [34]. По визуальным признакам можно определить, к какой группе относятся грибы: нитевидные (гифальные), дрожжи или дрожжеподобные. Чувствительность окрашивания по Граму, окрашивания лактофенолом хлопковым голубым, метода фиксации раствором гидрооксида калия и окрашивание калькофлюором белым составила 73; 78; 81,2; 93,7%, а специфичность — 97; 95; 83,8; 83,8%, положительная и отрицательная прогностическая ценность — 92 и 89%, 89 и 90%, 68,4 и 91,2%, 71,4 и 96,9% соответственно[32—35]. Несмотря на доступность гистохимических методов окрашивания для световой микроскопии, мы не нашли специальных исследований первичного материала, полученного с условно здоровой ГП, которые были бы охарактеризованы этим способом.

В офтальмологии классическая сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) нашла свое применение в исследовании морфологии и строения тканей на ультраструктурном уровне [36, 37]. Ранее она практически не применялась в диагностике воспалительных инфекционных заболеваний ГП. Это обусловлено тем, что пробоподготовка представляла собой трудоемкий и длительный процесс, включающий в себя работу с токсичными веществами, что вызывало трудности при большом количестве образцов в рутинной практике. Обязательным условием при подготовке образцов для электронной микроскопии ранее являлись фиксация, дегидратация, напыление металла. Относительно недавно была предложена методика контрастирования биологических проб с применением одного из лантаноидов — хлорида неодима [38, 39]. Время пробоподготовки значительно сокращается и составляет в среднем 30 мин. Образцы, подготовленные таким образом, отличаются более высокой контрастностью изображений биологических образцов [40].

При исследовании нормофлоры ГП методом СЭМ с «лантаноидным контрастированием» визуализируется довольно высокое разнообразие микроорганизмов [41] (табл. 3). Фенотипически можно выделить коккоморфные и палочковидные микроорганизмы, причем первые чаще аффилированы с клеточной поверхностью кератоцитов. Контрастирование подчеркивает метаболическую активность, функционирование флагеллярных моторов и эффлюкс-систем бактериальных клеток. Хорошо описываются разнообразные признаки примитивных грибов.

Таблица 3. Морфологические характеристики микроорганизмов, которые визуализируются на нормальной ГП, и их потенциальная принадлежность роду по данным других методов

Примечание. с (cocci) —коккоморфные микроорганизмы; dc (diplococci) — диплококки; b (bacilli) — палочковидные с умеренным удлинением, неспорообразующие; sfb (spore-forming bacilli) — палочковидные с умеренным удлиненнием, спорообразующие; pb (polymorphic bacilli) — палочковидные с умеренным удлинением, неспорообразующие, плеоморфные; lb (long bacilli) — палочковидные, удлиненные, неспорообразующие; МТС — метагеномное секвенирование; ПЦР — полимеразная цепная реакция.

Молекулярно-генетические методы

С внедрением молекулярно-генетических методов исследования взгляд на микробиальное сообщество локальных участков организма изменился. Появилось понятие «микробиом», под которым подразумевают совокупность геномов микроорганизмов, составляющих микробиоту. Первое исследование микробиома ГП методом секвенирования рДНК было проведено в 2011 г. Перечень микроорганизмов, получаемый с помощью метагеномного исследования, значительно шире, чем полученный с использованием культурального метода [1]. Кроме того, метагеномный анализ менее требователен к объему биологической пробы, что может оказаться актуальным в плане изучения микробного сообщества ГП.

В последнее время неуклонно увеличивается количество научных исследований, в которых применяют такие методы, как метабаркодинг гена 16s рибосомальной РНК (рРНК), секвенирование последнего поколения и полимеразная цепная реакция. При этом в публикациях приводятся разные методики пробоподготовки, модели секвенаторов и информационные платформы для анализа данных. Чаще всего встречается метабаркодинг гена 16s рРНК. Сейчас с применением этого метода активно изучается микробиом здоровой ГП, анализируются причины изменений в локальном микробиальном сообществе [42—44]. Происходит поиск корреляций между микробным составом и разными паталогическими состояниями ГП с использованием статистической обработки полученных данных с помощью анализа основных координат.

В большинстве исследований Proteobacteria является основным типом бактерий, идентифицируемых на ГП молекулярно-генетическими методами и относящихся к грамотрицательным микробам [45—47]. Реже встречаются Firmicutes, Bacteroidetes и Actinobacteria [25, 48]. Род Staphylococcus наиболее часто выделяется культуральным методом (хотя встречается и при культурально-независимых методах исследования), но не является доминирующим по сравнению с другими видами.

Среди тканей организма, находящихся в непосредственном контакте с внешней средой, конъюнктива и роговица считаются наименее заселенными микроорганизмами. Несмотря на это проводятся попытки описать основную, или коровую, микробиоту, которая была бы специфична именно для ГП. Однако в литературе нет единого мнения не только о составе коровой микробиоты, но и о самом факте ее существования, поскольку в ряде исследований не удалось обнаружить сквозного микроорганизма, характерного для всей популяции [22]. Вероятно, микробиальное сообщество ГП является изменчивым, что обусловлено непосредственным взаимодействием с различной окружающей средой, индивидуальными свойствами слезной жидкости и режимом мигательных движений век.

С другой стороны, часть авторов все же выделяют основную микробиоту ГП и относят к ней микроорганизмы родов Pseudomonas, Enhydrobacter, Brevibacterium, Acinetobacter, Klebsiella, Serratia, Staphylococcus и Propionibacterium [1, 6, 46, 47], которые являются одновременно и условно-патогенным бактериями, и характерными для окружающей среды сапрофитами [48]. В другой научной публикации предлагается термин «тип состояния глазного сообщества» в качестве концепции для выделения различных профилей бактериальных сообществ глазной поверхности [49]. Проведенное типирование микробиома здоровой глазной поверхности было основано на его разделении на девять типов, которые различались по родам и соотношению их распределения.

Как и при культуральном методе исследования, место забора образцов для молекулярно-генетического анализа влияет на конечный результат. A. Matysiak и соавторы проводили исследование микробиома здорового глаза, разделив исследуемых на две группы [25]. У первой группы испытуемых забор материала осуществлялся с роговицы, у второй — с конъюнктивы. Было обнаружено, что в роговичном микробиоме преобладали бактерии типа Proteobacteria (преобладающие роды: Alcanivorax, Pseudoalteromonas), а в конъюнктиве — Firmicutes (Staphylococcus).

Смещение микробиального паттерна при ношении мягких контактных линз

Остается открытым вопрос: насколько, с точки зрения микробиологии, можно считать здоровой ГП при ношении контактных линз, даже если нет клинических проявлений измененного состояния? Для того чтобы это установить, необходимо рассмотреть случаи очевидного смещения микробиального паттерна. Наиболее частыми осложнениями при использовании МКЛ считаются аллергический конъюнктивит и микробный кератит [28, 29]. Рассмотрим несколько работ, посвященных исследованию микробиального окружения ГП у носителей МКЛ с симптомами, которые можно отнести к аллергическим реакциям, не сопровождающимся воспалением роговицы. В статье, посвященной микробиомному анализу многофункциональной жидкости из футляров для хранения МКЛ и слезной жидкости участников исследования с аллергическими симптомами (АС) на фоне ношения МКЛ и без АС (контрольная группа), исследование проводилось двумя методами — культуральным и секвенированием гена 16s рДНК [29]. Результаты посевов из жидкости для хранения МКЛ не показали каких-либо статистически значимых различий между носителями МКЛ с АС и без АС, а рост из материала, взятого из слезной жидкости, наблюдался только у одного участника (Staphylococcus capitis). В то же время метагеномный метод исследования показал повторяющиеся результаты для слезной жидкости и раствора из футляров для хранения МКЛ. Детальный популяционный анализ показал, что количество грамположительных бактерий в микробиомах растворов для ухода за КЛ, используемых участниками с АС, было выше, чем у бессимптомных (42,24±9,47% против 16,85±22,76%). Среди них доминирующим родом был Streptococcus (численность 12,1—18,3%). Также в подтверждение вовлеченности Streptococcus был проведен вестерн-блот анализ IgE слезной жидкости к Streptococcus и к Staphylococcus. Слезный IgE у всех испытуемых с АС реагировал со стрептококком, но не со стафилококком. L. Raksha и соавторы также проводили исследование микробиома носителей МКЛ с наличием таких симптомов, как покраснение, ощущение песка, сухость, и без них, используя только культуральный метод исследования. Забор биологического материала осуществлялся с конъюнктивы, МКЛ и футляра для хранения МКЛ [27]. В этой работе микроорганизмы Pseudomonas, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, non-albicans Candida были выделены только от носителей МКЛ с АС. Такое расхождение в статьях со сходным дизайном может объясняться тем, что различались места забора материала и использовались разные питательные среды.

Распространено мнение, что ношение МКЛ является фактором риска развития микробного кератита. Есть несколько гипотез, которые отражают взаимосвязь между ношением МКЛ и развитием кератита. Одна из таких гипотез — это изменения в микробиоте ГП у носителей МКЛ, выражающиеся в снижении защитной функции комменсальных микроорганизмов и увеличении доли условно-патогенной флоры [50]. Кроме того, микроорганизмы склонны адгезироваться на поверхности МКЛ, образуя бактериальные биопленки. Биопленкообразование повышает резистентность микроорганизмов, в том числе и к антибактериальным агентам [51, 52]. При исследовании факторов риска возникновения роговичных инфильтратов при длительном ношении силикон-гидрогелевых линз обнаружилась взаимосвязь с большей бактериальной бионагрузкой на МКЛ и курением [53].

В ставшей классической работе H. Shin и соавт. методом секвенирования 16s рРНК показано, что микробиота ГП носителей МКЛ сходна с микробиотой кожи и в ней преобладают Pseudomonas, Acinetobacter, Methylobacterium и Lactobacillus, в то время как представленность Haemophilus, Streptococcus, Staphylococcus и Corynebacterium была снижена [7]. В то же время J. Andersson и соавт. не обнаружили изменений в микробиоте ГП у носителей МКЛ, а в качестве источника кератита, ассоциированного с ношением МКЛ, выявили условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав микробиоты ГП [28]. При механических микроповреждениях роговицы у носителей МКЛ формируются входные ворота для условно-патогенных микроорганизмов, участвующих в формировании микробиального окружения ГП.

Сравнение результатов исследования нормальной микробиоты глазной поверхности различными методами

Перекрестный анализ первичного материала

Наиболее чистым сравнительным экспериментом можно считать исследование биологического материала испытуемого разными методами. Появляется возможность оценить соответствие и различие получаемых результатов. В статьях, посвященных исследованию микробиома здоровой ГП одновременно двумя методами (культуральным и молекулярно-генетическим), часто обнаруживается несовпадение получаемых результатов [6, 22, 25]. Это выражается в том, что при перекрестном анализе образцов, полученных от одного исследуемого, молекулярно-генетическими методами идентифицируется более высокое микробиологическое разнообразие микроорганизмов ГП и увеличение доли бактерий, характерных для окружающей среды (вода, почва, растения), ротовой полости, кишечника.

Несоответствие данных, получаемых разными методами исследования, может быть связано с тем, что у них есть определенные недостатки, т. е. особенности самих методов исследования обусловливают разницу конечных результатов. Одним из достоинств культурального метода является то, что с его помощью обнаруживаются только те микроорганизмы, которые были живы на момент забора материала, при этом достаточно даже одной живой клетки. Однако при этом нельзя исключить загрязнение образцов во время забора. Кроме того, существует вероятность того, что микроорганизмы, обитающие на слизистой оболочке глаза, могут требовать неких специфических условий культивирования, что приводит к ложноотрицательным результатам.

Что касается молекулярно-генетических методов исследования, то их недостатком можно считать появление в результатах анализа микроорганизмов, клетки которых были не активны или даже разрушены на момент забора биологического материала. Кроме того, возможно появление загрязняющих последовательностей в процессе проведения геномного секвенирования.

Существует очень небольшое количество публикаций, по данным которых можно сравнить результаты культурального метода и микроскопии. Было обнаружено расхождение результатов при исследовании проб у пациентов с кератитом и дакриоциститом: методом микроскопии визуализировалось большее количество микроорганизмов, тинкториальные и морфологические свойства которых не полностью совпадали с результатами идентификации выделенных микроорганизмов [33].

Одна из причин, по которой микроскопическое исследование нормальной микрофлоры ГП обычно не проводится, заключается в том, что оно не дает видового представления о совокупности микроорганизмов, а результаты зависят от опыта исследователя. Также ограничением данного метода является возникновение артефактов. Однако современные визуализирующие методы способны расширить взгляд на микробиоту ГП, поскольку позволяют обнаружить бактерии, которые трудно поддаются культивированию, а также исключить микроорганизмы, появившиеся в результате контаминации образца. В отношении грибковой флоры микроскопические методики также представляют собой ценный инструмент, так как показывают высокую чувствительность и специфичность при исследовании возбудителей кератомикозов. В то же время при посеве на селективные питательные среды рост грибов происходит в течение 1—2 нед и требует разных температурных режимов для филаментозных и дрожжевых грибов, что при исследовании нормофлоры может послужить ограничивающим фактором.

Различие результатов, получаемых на уровне субпопуляции, по данным литературы

Более широкий взгляд на расхождение данных разных методов микробиологического анализа можно получить из совокупности источников, в которых уже был предпринят сравнительный анализ на уровне субпопуляции.

Так, во многих культуральных исследованиях количество выделяемых микроорганизмов на одного участника составляет не более четырех, но большинство показывают мономикробный рост [6, 22, 25, 29]. При этом большее количество микроорганизмов на одного участника и меньше отрицательных по посеву результатов наблюдается в тех исследованиях, где забор биологического материала осуществлялся с МКЛ, а не непосредственно с ГП.

Одной из причин ложного многообразия микрофлоры по данным метагеномного секвенирования может являться порок биоинформатических методов анализа. При непрямых методах прочтения каждый микроорганизм характеризуется количеством сравнений с эталонными последовательностями в геномной базе данных. При этом каждому положительному результату сравнения присваивается одна оперативная таксономическая единица (ОТЕ), представляющая собой аналог видовой принадлежности микроорганизмов в культурально-независимых исследованиях. Как правило, количество и разнообразие оперативных таксономических единиц на один образец в десятки раз превышает количество видов, выделенных из этого же образца.

Различия проявляются уже на самом высоком таксономическом ранге — в типовой принадлежности выявленных микроорганизмов. При диагностике культуральным методом в основном доминирует сигнал бактерий типов Firmicutes и Actinobacteria, а при молекулярно-генетическом анализе — Proteobacteria и Bacteroidetes. Отчасти это связано с тем, что клеточная стенка грамположительных бактерий более устойчивая и прочная, чем грамотрицательных, что, в свою очередь, вызывает трудности при извлечении ДНК в ходе метагеномного анализа и может приводить к ложному снижению представленности микроорганизмов типов Firmicutes и Actinobacteria.

В качестве обобщения можно сказать, что чаще всего одновременно разными методами были выделены грамположительные коккоморфные микроорганизмы родов Staphylococcus, Micrococcus, Kocuria, Streptococcus, Enterococcus; грамположительные спорообразующие бациллы родов Bacillus, Paenibacillus; грамположительные неспорообразующие палочковидные бактерии с включениями Corynebacterium, без включений Propionibacterium, Microbacterium; грамотрицательные неспорообразующие палочковидные микроорганизмы Moraxella, Serratia (табл. 4). Наблюдаются совпадения и по микотической флоре (роды Malassezia, Aspergillus, Rhodotorula, Candida), которая также была идентифицирована при использовании культурально-зависимых, микроскопических и метагеномных исследований [8, 54—57].

Таблица 4. Роды бактерий, характерные для нормального микробиома ГП, идентифицированные разными методами

Примечание. «+» — микроорганизмы обнаружены соответствующим методом; «—» — микроорганизмы не обнаружены соответствующим методом.

Потенциальными загрязнителями проб могут быть микроорганизмы, выявляемые только молекулярно-генетическими методами: Fusibacter, Sphingobium, Mesorhizobium, Herbaspirillum, Ottowia, Pseudochrobactrum, Cohaesibacter, Alcanivorax, Nitrosomonas, Pseudoalteromonas, Mucinivorans, Erwinia, Salinivibrio, Anaerophaga. Они не были ранее выделены из тканей и слизистых оболочек человека, но характерны для окружающей среды.

Целью данного обзора не являлось обсуждение возможного влияния на состав микробиома географических, возрастных и половых особенностей, но мы позволим себе кратко коснуться ключевых работ в этом направлении. В большинстве научных публикаций указывается на то, что пол практически не влияет на состав микробного сообщества ГП. Только в некоторых публикациях описываются различия; так, H. Shin и соавторы получили следующие результаты: количество микрорганизмов Acinetobacter и представителей семейства Enterobacteriaceae было увеличено, а количество микроорганизмов Anaerococcus — снижено в глазной микробиоте испытуемых женского пола по сравнению с испытуемыми мужского пола [7]. Другие авторы в своем исследовании показали разницу в индексе Шеннона (коэффициент равной представленности разных видов): у мужчин данный показатель был значительно выше, чем у женщин [22].

Также противоречивые результаты касаются положения об изменении микробного сообщества ГП с возрастом. K. Cavuoto и соавторы выявили значительное снижение микробиологического разнообразия в образцах взрослых по сравнению с образцами детей [45]. Другие же исследователи пришли к выводам, что, наоборот, с возрастом происходит увеличение количества микроорганизмов на ГП [23].

Что касается такого фактора, как географическое расположение, то в большей степени влияние на микробиоту ГП оказывают климатические условия и сезонные изменения. В период большего количества осадков снижаются богатство и разнообразие микроорганизмов по сравнению с периодами низкой влажности [58]. Также в странах с тропическим климатом встречается значительно больше случаев грибкового кератита, что обусловлено благоприятными условиями для их роста [59]. В развитых странах с умеренным климатом изменения микрофлоры ГП обусловлены более высоким уровнем использования МКЛ как метода коррекции аметропии [60].

Заключение

Генерализованные данные, представленные в виде таблиц и приведенные в обзоре, можно рассматривать в качестве референса для оценки отклонений в составе микробиома при изучении различных клинических состояний ГП. Можно рекомендовать пользоваться перекрестными методами анализа при идентификации микроорганизмов. Проблема достоверности «слепой» идентификации указывает на актуальность разработки и внедрения новых прямых визуализационных методов для определения состава микробиома ГП. В дальнейшем такие технологии смогут служить способом верификации данных «высокотехнологичных» методов анализа и методов классической микробиологической диагностики.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.