Микрофлора глазной поверхности играет весьма значимую роль в противостоянии инвазии болезнетворных микроорганизмов, оказывая значительное влияние на местную иммунологическую активность и барьерный эффект по отношению к внешней среде, от воздействия факторов которой орган зрения имеет различные виды защиты — механической, химической, иммунной. При этом важнейшее значение принадлежит комменсальным микроорганизмам, колонизирующим поверхность глаза и представляющим собой совокупность представителей нормальной микрофлоры. Последняя помогает иммунной системе определять патогенные грамположительные и грамотрицательные микробы. Сообщество резидентных микроорганизмов, которое населяет помимо глазной поверхности кожу и слизистые оболочки желудочно-кишечного и дыхательного тракта, а также полостей носа и рта, органов мочеполовой системы, называется микробиотой (МБТ) [1—4]. В течение жизни человека под влиянием множества факторов (вредные привычки, лечение антибиотиками, перенесенные инфекции и др.) она может меняться [2].

Рост микробов с помощью ранее применявшегося бактериологического посева на питательные среды (традиционный метод культивирования) выявлялся в ≤50% всех случаев, что объяснялось малым разнообразием количественного и качественного состава микроорганизмов на поверхности глаза и неспособностью методики обеспечить подходящую питательную среду для их роста. Исследуемые образцы содержали бактерии родов Staphylococcus (тип Firmicutes), Corynebacteria и Propionibacteria (тип Actinobacteria) [3, 5—7].

В последние годы все большее распространение получает иммунодиагностика. Новейшее поколение методов молекулярной биологии, в частности таких, как секвенирование гена 16S бактериальной рибосомной РНК (рРНК) и в особенности метагеномное секвенирование, позволяет наиболее полно выявить разнообразие МБТ. Это в полной мере относится и к глазной поверхности [3] с тремя преобладающими (независимо от окружающей среды, используемого метода и др.) типами: протеобактерии (Proteobacteria) (64%), актинобактерии (Actinobacteria) (19,6%) и фирмикуты (Firmicutes) (3,9%), которые составляют >87% всех микроорганизмов. На сегодняшний день данные метагеномного секвенирования свидетельствуют о том, что на здоровой поверхности глаза на уровне рода превалируют коринебактерии (Corynebacterium), пропионовокислые бактерии (Propionibacterium) и коагулазонегативные стафилококки (Staphylococcus) [8—10].

Есть основания полагать, что нарушения состава МБТ могут вызвать развитие таких заболеваний глаз, как синдром «сухого глаза» (ССГ), блефарит, конъюнктивит, кератит, иридоциклит, глаукома, диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и др. [11—21]. Необходимо, однако, отметить тот факт, что имеющиеся многочисленные данные о составе МБТ глазной поверхности в норме и при различной офтальмопатологии крайне разнообразны, а порой и противоречивы [22, 23]. Если же иметь в виду такую нозологию, как миопия, то исследования, основанные на оценке МБТ глаза методом секвенирования бактериальной ДНК, представлены лишь единичными работами [24].

Цель исследования — изучить таксономическое разнообразие МБТ глазной поверхности у детей с миопией с помощью метагеномного секвенирования 16S рРНК в сравнении с аналогичными характеристиками у пациентов контрольной группы без клинически подтвержденной близорукости.

Материал и методы

Под нашим наблюдением находились 29 детей с миопией (58 глаз): 14 мальчиков и 15 девочек в возрасте 6—17 лет и 12 условно здоровых детей без клинически подтвержденной близорукости (24 глаза) — контрольная группа: 6 мальчиков и 6 девочек в возрасте 9—17 лет. Подавляющее большинство исследуемых (26) постоянно проживали в Республике Башкортостан (в основном в зоне Южного Предуралья) и только 3 ребенка были из Оренбургской области. У родителей пациентов было взято письменное согласие на проведение исследования. Всем детям назначалась очковая коррекция; 6 подростков (15—17 лет) периодически, но в меньшей степени использовали также контактную коррекцию мягкими контактными линзами (КЛ) (дневного ношения). Все участники в соответствии с установленной степенью близорукости были разделены на 3 группы: с миопией высокой степени — 17 человек (7 мальчиков, 10 девочек), средней — 9 (6 мальчиков, 3 девочки) и слабой степени — 3 человека (1 мальчик, 2 девочки). Из числа 17 детей с высокой миопией у 13 (76,5%) ранее (не менее чем за 2 года до настоящего обследования) в связи с прогрессированием близорукости произведена двусторонняя склеропластика. У всех пациентов были взяты биообразцы из конъюнктивальной полости. Однако 10 образцов (у 5 пациентов) с поверхности глаза не прошли фильтрацию из-за низкого качества прочтений, вследствие чего эти данные исключены из анализа. Удаленные данные касались в том числе и 2 пациентов (из 3) со слабой миопией, в связи с чем вся эта группа не учтена при статистической обработке результатов.

Важно отметить, что практически все биообразцы были получены от детей, родившихся и проживавших на территории Республики Башкортостан. Влияние окружающей среды (климатогеографические и урбанистические факторы) на микробиологический состав поверхности глаза было относительно одинаковым.

Таким образом, в работе изучены образцы глазной поверхности 24 детей (48 глаз) с миопией высокой и средней степени.

Бактериальный состав поверхности глаза определяли на уровне рода с помощью метагеномного секвенирования 16S рРНК. Выделение тотальной ДНК проводили путем гомогенизации в лизирующем растворе с последующей экстракцией методом сорбентной колонки (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Библиотеки для секвенирования собирали по секвенационному протоколу компании Illumina (США) (Part #15044223 Rev. B). Наборы реагентов, использованные в данной работе, также предоставлены компанией Illumina .

В ходе амплификации целевого фрагмента гена 16S рРНК с использованием рекомендованных праймеров для исследуемой гипервариабельной области V3—V4 брали 5 нг общей ДНК на один образец. Проводили 25 циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением диагностического набора KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2×) (Roche Diagnostics, Швейцария).

Биоинформационную обработку базы данных 16S рРНК проводили с помощью собственного разработанного биоинформатического пайплайна на языках программирования R версии 3.6.0 (R Foundation for Statistical Computing) и Python версии 3.0 (Python Software Foundation). Первый этап обработки подразумевал обрезку последовательности праймеров для парных прочтений. Не содержавшие последовательностей праймеров прочтения удаляли. Затем производили удаление прочтений с плохим качеством (балл Phred ≥10) и коротких прочтений (≥200 пар нуклеотидов). Обработку данных осуществляли с помощью конвейера DADA2 с целью выявления точных вариантов последовательностей. После конкатенации (объединения нескольких символьных строк в одну) прямых и обратных прочтений полученные последовательности использовали для таксономической классификации по методу Naive Bayers (наивный байесовский классификатор) при помощи референсной базы данных SILVA v138.1.

В процессе определения таксономического разнообразия бактериального сообщества использовали следующие пакеты программ на языке R: phyloseq, microbiome, ggpubr, upstartr, mixOmics, dplyr, gridExtra, vegan. Альфа-биоразнообразие микробиома глаза на уровне рода оценивали по индексам Чао и Шеннона с помощью функций пакета vegan в среде программирования R. В целях оценки сходства бактериального сообщества между исследуемыми группами пациентов проводили анализ бета-разнообразия с использованием расстояний Брея—Кертиса. Визуализацию бета-разнообразия осуществляли методом неметрического многомерного шкалирования (non-metric multidimensional scaling, NMDS). Непараметрический U-тест Манна—Уитни и анализ PERMANOVA использовали для сравнения индексов альфа-разнообразия между группами пациентов и определения статистических различий при попарных сравнениях групп по относительной представленности доминирующих бактериальных таксонов. Значения считали достоверными при p-value<0,05.

Результаты

Сравнительный анализ альфа- и бета-разнообразия микробиоты глазной поверхности у детей с миопией и детей контрольной группы

Альфа-разнообразие МБТ глазной поверхности у пациентов с миопией высокой и средней степени проанализировано при помощи индекса Чао, который оценивает общее число уникальных родов, и индекса Шеннона, отражающего количество родов и однородность распределения бактерий (рис. 1).

Рис. 1. Попарное сравнение индексов альфа-разнообразия Чао (а) и Шеннона (б) у детей с миопией и в контрольной группе.

Каждая точка на графике соответствует образцу глазной поверхности левого или правого глаза.

Как видно из полученных данных, МБТ у детей с миопией характеризуется бόльшим альфа-разнообразием по сравнению с пациентами контрольной группы. Это подтверждается количественными значениями индексов Чао и Шеннона (75 и 3,65 у пациентов с миопией, 30 и 2,9 — в контрольной группе соответственно). Как и ожидалось, с помощью теста Манна—Уитни обнаружены статистически значимые (p-value<0,05) различия между исследуемыми группами по альфа-разнообразию.

Дополнительно изучено влияние длины передне-задней оси (ПЗО) глаза на оцененное при помощи индекса Шеннона альфа-разнообразие МБТ (рис. 2). В нашем случае отмечена слабая отрицательная корреляция (r=−0,063). Таким образом, с увеличением этого показателя разнообразие МБТ уменьшалось. Однако следует отметить, что в исследуемых группах не учитывались пациенты со значениями ПЗО >28 (28—32) мм.

Рис. 2. Корреляция между альфа-разнообразием (рассчитанным через индекс Шеннона) и величиной переднезадней оси глаза (в мм).

При характеристике бета-разнообразия МБТ поверхности глаза использован NMDS-анализ на основе расстояния Брея—Кертиса с целью выявления различий в распределении численности родов между детьми с миопией и их здоровыми сверстниками (контроль). Согласно полученным результатам (рис. 3), наблюдается отчетливая тенденция к различию бактериального состава между участниками контрольной группы и пациентами с близорукостью (p-value=0,001).

Рис. 3. Бета-разнообразие микробиоты глаз у детей с близорукостью и в контрольной группе.

Каждая точка на графике соответствует глазной поверхности левого или правого глаза пациентов. Числовые значения по осям — условные коэффициенты разнообразия.

В рамках данного исследования проанализировано также влияние пола на МБТ глазной поверхности в контрольной группе и у детей с миопией. При оценке альфа- и бета-разнообразия не выявлено значимых различий (p-value>0,05) между мальчиками и девочками с наличием миопии высокой и средней степени и ее отсутствием (в контроле).

Таксономия глазного микробиома у детей с миопией и детей контрольной группы

В биообразцах с глазной поверхности детей с близорукостью выявлено 12 доминирующих таксонов (родов) МБТ поверхности глаза (рис. 4). На уровне рода наиболее распространенными таксонами у детей с миопией, не имеющих каких-либо глазных и общих острых или хронических заболеваний (т. е. в контроле), оказались Bradyrhizobium sp., Methylobacterium/Methylorubrum sp., Sphingomonas sp., Paracoccus sp., Faecalibacterium sp. и Blautia sp.

Рис. 4. Бактериальное разнообразие микробиоты глазной поверхности на уровне рода у детей с близорукостью и здоровых лиц.

Ширина столбца соответствует относительной представленности таксона. Менее представленные таксоны объединены в группу «Другой» («Other»).

Наряду с этим обнаружены различия в распределении бактериальных родов в количественном выражении между группами пациентов (рис. 5). У детей контрольной группы наблюдалось повышение относительной представленности таких родов, как Sphingomonas и Blautia, а также снижение представленности условно-патогенных микроорганизмов Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Cutibacterium и Pelomonas. Зарегистрировано в том числе преобладание представителей рода Faecalibacterium, которые, вероятно, являются контаминантами.

Рис. 5. Относительная представленность на глазной поверхности доминирующих родов бактерий у пациентов с миопией и в контрольной группе.

Числовые значения по оси ординат — условные коэффициенты представленности.

Примечательно, что у страдающих миопией различной степени отмечалось существенное достоверное (p-value<0,05) увеличение представленности Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Cutibacterium sp., Pelomonas sp. и Bacteroides sp. относительно значений в контрольной группе. Кроме того, не выявлено значимых различий в представленности рода Blautia (p-value=0,11) у пациентов с близорукостью и в группе контроля.

В целом структура МБТ детей с миопией характеризовалась бόльшим числом таксономических единиц в сравнении с показателями контрольной группы, что косвенно свидетельствует о наличии патологического состояния.

Обсуждение

Изучение МБТ глазной поверхности человека с применением технологий секвенирования 16S рРНК позволило обнаружить большее биоразнообразие по сравнению с использованием традиционных культуральных методов.

Известно, что здоровая глазная поверхность характеризуется относительно стабильным и сравнительно низким разнообразием МБТ [22]. Качественные и количественные изменения в ней могут быть связаны с развитием офтальмопатологии, например некоторых воспалительных заболеваний, ССД, ВМД, диабетической ретинопатии, глаукомы и др. [14, 15, 19, 21—23]. Однако характеристика МБТ глазной поверхности у детей с близорукостью при помощи более точного анализа, основанного на секвенировании 16S рРНК, до настоящего времени остается малоизученной областью. Например, только в единичных работах [24] определены структура микробиома конъюнктивы, а также таксономический состав биопленок с поверхности жестких КЛ длительного ношения у взрослых пациентов.

В настоящем исследовании мы использовали секвенирование 16S рРНК для изучения глазного микробиома у детей с миопией высокой/средней степени и в контрольной группе. Практически все участники проживали на одной территории, что снижает вероятность влияния различных климатогеографических и экологических факторов на микробиомное разнообразие. Проведенный нами анализ продемонстрировал закономерность увеличения альфа-разнообразия у детей с близорукостью. При этом нормобиом глазной поверхности характеризовался меньшей численностью и, как следствие, сниженным индексом альфа-разнообразия. Тем не менее получить желаемый уровень значимости при сравнительной оценке этой характеристики микробиоты у пациентов с помощью индексов Чао и Шеннона удалось только при попарном сравнении групп с высокой (индекс Чао: p-value=0,000027; индекс Шеннона: p-value=0,00003) и средней (индекс Чао: p-value=0,00079; индекс Шеннона: p-value=0,01) степенью миопии. Незначительные различия между индексами альфа-разнообразия могут быть вызваны неравномерным распределением некоторых родов бактерий. Мы также обнаружили существенные различия в бета-разнообразии, представленные в виде четкого разделения паттернов бактериального состава. Таким образом, глазная поверхность у детей с миопией имеет большее микробное разнообразие, чем у здоровых сверстников.

Считается, что возраст и уровень половых гормонов оказывают значительное влияние на состояние местного иммунитета и здоровье органа зрения. Другими словами, возраст и пол в совокупности могут влиять на состав микробиома поверхности глаза. Однако ряд авторов отмечают, что у пациентов разного возраста состав и метаболические функции МБТ глазной поверхности сильно различаются, при этом гендерный фактор может оказывать влияние только на бета-разнообразие бактериального состава. В другой работе не обнаружено связи возраста и пола с разнообразием бактерий, заселяющих глазную поверхность [3]. Мы, как и другие исследователи [8], не выявили влияния пола на биоразнообразие поверхности глаза.

Характерной чертой МБТ детей с миопией и участников контрольной группы оказалась выраженная представленность бактериальных родов Bradyrhizobium, Methylobacterium/Methylorubrum, Sphingomonas, Paracoccus, Faecalibacterium и Blautia. Таким образом, наиболее часто выявляемыми микроорганизмами в нашем исследовании были бактерии Bradyrhizobium, которые, участвуя в азотном цикле почв, очень часто присутствуют в пробах воздуха, взятых в Башкирии (особенно Южном Предуралье, куда относятся гг. Уфа, Стерлитамак, Салават, Ишимбай, Мелеуз, Кумертау с развитой промышленной структурой) и граничащей с ней Оренбургской области, где почвы склонны к переносу бактерий и спор в форме аэрозолей. Как известно, глазная поверхность способна абсорбировать содержимое последних, включая очень обильный генетический материал разрушенных клеток сапрофитов. Возможно, выявленная нами особенность распределения родовой представленности этих микроорганизмов именно у детей связана с местом их проживания, а также с невысоким ростом относительно взрослых пациентов. Кроме того, наличие бактерий Methylobacterium/Methylorubrum может свидетельствовать об их участии в глобальном цикле углерода, в частности — о роли в снижении эмиссии из почв метана и метанола, которые влияют на формирование климата.

Что касается различий МБТ детей с миопией и в контрольной группе, то наблюдалось значимое (p-value<0,05) увеличение численности Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Cutibacterium sp., Pelomonas sp. и Bacteroides sp. Таким образом, структура МБТ глазной поверхности у пациентов с близорукостью в сравнении со здоровыми отличалась бόльшим числом таксономических единиц и увеличением относительной представленности указанных микроорганизмов.

Заключение

В результате проведенного исследования МБТ глазной поверхности посредством секвенирования 16S рРНК обнаружено увеличение альфа- и бета-разнообразия у проживающих на территории Республики Башкортостан детей с миопией в сравнении со здоровыми сверстниками (контролем). Установлено, что на уровне рода наиболее распространенными таксонами как у страдающих миопией, так и в контрольной группе были Bradyrhizobium, Methylobacterium/Methylorubrum, Sphingomonas, Paracoccus, Faecalibacterium и Blautia. В целом структура МБТ пациентов с близорукостью характеризовалась более высоким количеством таксономических единиц относительно участников группы контроля. В то же время при миопии отмечалось значительное увеличение Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Cutibacterium sp., Pelomonas sp. и Bacteroides sp. по сравнению с контролем.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Резбаева Г.Н., Дудурич В.В.

Сбор и обработка материала: Резбаева Г.Н.

Биоинформатический и статистический анализ: Дудурич В.В., Согомонян К.С., Данилова А.А., Данилов Л.Г.

Написание текста: Резбаева Г.Н., Бабушкин А.Э.

Редактирование: Дудурич В.В., Бабушкин А.Э., Оренбуркина О.И., Данилова А.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.