Злокачественные глиомы являются наиболее агрессивными и смертельными первичными астроцитарными опухолями ЦНС. На их долю приходится от 60 до 70% всех глиом. Глиомы могут возникать в любом возрасте, но большинство — у пожилых пациентов [1].
Глиобластомы — самый злокачественный тип глиом, как правило, представляют собой опухоль с некрозом и микрососудистой пролиферацией. Пациенты, страдающие этим наиболее злокачественным типом, обычно умирают от болезни через 12—18 мес после постановки диагноза. По степени злокачественности различают два типа глиобластом: первичные, возникающие de novo, и вторичные, развивающиеся из глиом более низкой степени злокачественности [1, 2].
Первичные глиобластомы чаще встречаются у мужчин европеоидной расы в пожилом возрасте, в то время как глиомы более низкой степени злокачественности и вторичные глиобластомы чаще встречаются у молодых людей (45 лет и моложе). Половые различия объясняются гормональными изменениями и генетическими особенностями пациентов. Из-за частых рецидивов заболевания только от 3 до 5% пациентов с глиобластомой живут дольше 3 лет после постановки диагноза. Прогноз зависит от возраста пациентов на момент постановки диагноза, у более молодых прогноз лучше. Частично это можно объяснить более лучшим общим состоянием здоровья, но это также может быть результатом различных молекулярных и генетических изменений у более молодых пациентов по сравнению с пожилыми [1—3].
Хотя глиобластомы пациентов с короткой продолжительностью жизни и длительно живущих гистологически одинаковы, их биологические и молекулярные характеристики заметно различаются [3—7]. Из-за короткой ожидаемой продолжительности жизни длительно живущими пациентами считаются те, которые живут дольше 3 лет после постановки диагноза. При этом доля пациентов, живущих 10 лет и более после постановки диагноза, составляет <1% всех пациентов. Молекулярные исследования указывают на генетические различия между пациентами с короткой продолжительностью жизни и длительно живущими пациентами [6, 8, 9]. Так, к молекулярным маркерам, которые имеют прогностическую значимость и облегчают дифференциацию конкретных типов опухолей, а также дающих надежду на понимание прогрессирования опухоли и создания таргетных методов лечения, относят мутацию ATRX, мутацию промотора TERT, мутацию TP53, BRAF V600E, GATA 4, FGFR1, EGFR, WT1, PTEN, IDH, уровень экспрессии CD34. Наиболее информативными считают мутации гена IDH1/2 и метилирование промоутера MGMT, которые связывают с лучшим ответом на стандартное лечение при злокачественных глиомах [6—11].
На основании наличия или отсутствия IDH-мутации генов 1 и 2 и коделетирования хромосомы 1p/19q у взрослых первичные глиобластомы также определяются как IDH дикого типа, в то время как вторичные — могут быть либо мутантными IDH и интактными 1p/19q, либо мутантными IDH и коделетированными 1p/19q [8—19].
Все чаще обсуждается использование CD34 для прогноза, диагностики и лечения новообразований. CD34 представляет трансмембранный фосфогликопротеин. Была выявлена значительная связь между уровнем сверхэкспрессии CD34 и более плохим прогнозом глиобластомы [14, 19—21].
Стандартное лечение, как правило, применяемое к пациентам с диагнозом «глиобластома», предполагает хирургическое вмешательство, если это возможно (удаление максимально возможного объема опухоли желательно под флюоресцентным контролем), с последующей радио- и химиотерапией [22].
Фотодинамическая терапия (ФДТ) является относительно новой и неинвазивной терапевтической альтернативой для лечения различных онкологических заболеваний. В последние годы растет количество исследований ФДТ при глиобластомах. ФДТ включает фотоактивацию молекулы фотосенсибилизатора, которая избирательно внедряется в опухолевые клетки. Как результат в опухолевых клетках происходят реакции, которые повреждают мембраны внутриклеточных органелл, таких как митохондрии, лизосомы и эндоплазматический ретикулум, что в конечном итоге вызывает некроз, апоптоз, локальную ишемию (из-за окклюзии опухолевых сосудов), а также последующие иммунные реакции [23—26].
Цель работы — разносторонний анализ длительно живущих пациентов из группы больных глиобластомами после использования в структуре их комплексного лечения ФДТ с целью оценки влияния различных факторов: клинических, гистологических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических, объема лучевой и химиотерапии, ФДТ на величину продолжительности жизни.
Материал и методы
В одноцентровом ретроспективном категориальном исследовании анализировались отдаленные результаты лечения пациентов с морфологически установленной злокачественной глиальной опухолью супратенториальной локализации (Grade IV, глиобластома), находившихся на обследовании и лечении в РНХИ им проф. А.Л. Поленова в 2011—2016 гг. Всего в исследовании принимали участие 63 пациента с глиобластомой. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Всем пациентам выполнен хирургический этап лечения с применением интраоперационной ФДТ с препаратом хлорином e6 2-го поколения (Фотодитазин, производитель ООО «Вета-Гранд», Россия), вводившимся внутривенно за 2 ч до предполагаемого основного этапа операции в дозировке 1мг/кг массы тела пациента. ФДТ проводили с применением полупроводникового лазера Латус 2,5 (производитель ООО «Актус», Санкт-Петербург), всего 3 сеанса по 5 мин, с интервалом между сеансами 5 мин, суммарной общей дозой облучения 180 Дж/см2. Все пациенты в послеоперационном периоде получали адъювантную терапию (лучевая и химиотерапия). Гистологические диагнозы были пересмотрены и подтверждены в соответствии с классификацией ВОЗ 2016 г. Интраоперационный материал опухоли исследовали гистологически (окраска гематоксилином и эозином, ядерный полиморфизм, митозы, сосудистая пролиферация, наличие некрозов), иммуногистохимически (индекс Ki-67, белок p53, экспрессия вазоэндотелиального ростового фактора (VEGF)) у всех пациентов, цитогенетически у всех длительно живущих пациентов и частично у остальной части пациентов (метилирование промоутера MGMT, мутация гена IDH, экспрессия CD34).
Индекс пролиферации по Ki-67 определяли по процентному отношению клеток с иммунореактивными ядрами к общему количеству клеток.
Для иммуногистохимического исследования P53 использовались моноклональные антитела DO-7, выявляющие как wtP53, так и mtP53. Для количественной оценки пролиферативной активности, а также экспрессии белка P53 проводили подсчет соотношения окрашенных ядер на 300 клеток при 400-кратном увеличении.
Экспрессия мРНК генов MGMT, VEGF проводилась на архивном гистологическом материале при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Для выявления мутаций в генах IDH1 и IDH2 методом ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов IDH1/2 RGQ PCR Kit («Qiagen», 873001). Детекция проводилась путем анализа кривых плавления ПЦР-продуктов с высоким разрешением и последующим секвенированием ДНК. Определение статуса метилирования промотора гена MGMT производили методом специфичной к метилированию ПЦР в реальном времени по методике, рекомендованной фирмой-производителем (разведение 1:400; Modification Kit, «Chemicon International», США).
Экспрессию маркера CD34, известного как оптимальный маркер для исследований плотности микрососудов, определяли полуколичественным методом, а также автоматически количественно определяли на плотность микрососудов CD34 с помощью стандартизированного программного обеспечения для гистоморфометрии. Для этого срезы окрашивали антителами против CD34 (разведение 1:100; клон QBEnd-10; DAKO; Дания).
Оценка отдаленных результатов лечения пациентов была основана на величине безрецидивного периода и величине продолжительности жизни пациентов. Продолжительность жизни оценивалась от момента постановки диагноза по данным первой нейровизуализации (МРТ головного мозга). Величина безрецидивного периода оценивалась от даты первой операции до выявления рецидива опухоли по данным МРТ головного мозга с контрастным усилением гадолинием. Основной акцент сделан на изучении влияния на продолжительность жизни клинических (возраст, локализация и размер опухоли, индекс Карновского до операции, радикальность резекции опухоли, количество операций, объем лучевой и химиотерапии, ФДТ), морфологических, иммуногистохимических, цитогенетических факторов у длительно живущих пациентов в изучаемой группе. Длительно живущими считали пациентов, преодолевших 3-летний жизненный интервал после постановки диагноза.
Статистический анализ проводился с помощью SPSS (версия 22.0, Чикаго, Иллинойс, США). Сравнение категориальных переменных между группами проводилось с использованием критерия χ2 или точного критерия Фишера, в то время как различия в возрасте на момент постановки диагноза, размере опухоли и баллах по шкале эффективности Карновского оценивались с помощью t-критерия Стьюдента. Переменные со значениями p<0,05 были введены в многофакторный логистический регрессионный анализ для определения независимых предикторов длительно живущих пациентов. Показатели выживаемости рассчитывали с использованием методов Каплана—Мейера, а различия сравнивали с помощью логарифмических ранговых критериев. Все тесты были двусторонними, различие со значением p<0,05 считалось статистически значимым.
Результаты
В целом медиана общей выживаемости пациентов всей группы (n=63) с глиобластомой (Grade IV) после ФДТ составила 20,3±4,1 мес, а длительность межрецидивного периода — 11,1±2,1 мес. Из этих 63 пациентов с глиобластомой, пролеченных на базе РНХИ им. проф. А.А. Поленова с использованием ФДТ, 7 (11,1%) имели выживаемость более 3 лет. Три (4,8%) из них преодолели порог 5-летней выживаемости, 1 (1,6%) — 10-летней выживаемости.
Сравнивая 7 длительно живущих пациентов с глиобластомой с другими 56 пациентами, которые прожили менее 3 лет, у длительно живущих пациентов был более молодой средний возраст при постановке диагноза (в среднем 44,7±5,3 года против 57,3±13,7 года, p<0,001) (рис. 1 на цв. вклейке). Также у длительно живущих пациентов по сравнению с остальной частью группы была более высокая частота полной резекции (85,7 против 73,1%). Однако 1 пациент с частичной резекцией прожил более 3 лет. Никаких различий в протоколе лечения или распределении по полу не было выявлено между длительно живущими и остальными пациентами. Однако следует отметить, что у более 40% пациентов из 56, не преодолевших 3-летний жизненный интервал после постановки диагноза и прошедших ФДТ, продолжительность жизни находилась в диапазоне от 24 до 36 мес.
Рис. 1.Анализ пациентов с длительной выживаемостью (более 3 лет) после комплексного лечения, включая ФДТ.
Никакой разницы в распределении индекса Ki-67, белка p53 и экспрессии VEGF между длительно живущими пациентами и остальной группой не наблюдалось. Было обнаружено, что классические прогностические факторы, такие как метилирование промотора MGMT и мутация IDH, значительно более распространены в группе пациентов с большей продолжительностью жизни, чем в остальной части группы (индекс метилирования промотора MGMT: 65,5% против 33,5% (p<0,001) и частота мутаций IDH1/2: 13,5% против 6,0% (p=0,001)). Тем не менее были 5 пациентов с глиобластомой с коротким периодом продолжительности жизни, у которых был как неметилированный промотор MGMT, так и IDH дикого типа.
Исходя из полученных данных, самая сильная прямая корреляционная связь среди всей группы пациентов была между продолжительностью жизни и статусом MGMT, наличием мутации IDH1/2 (рис. 2). Пациенты с высоким уровнем метилирования MGMT или наличием IDH mut типа имели большую продолжительность жизни (p=0,001).
Рис. 2. Выживаемость пациентов в группе в зависимости от статуса IDH (а) и MGMT (б).
Далее по силе корреляционной связи была зависимость между количеством курсов химиотерапии и продолжительностью жизни. Чем больше циклов химиотерапии проходил пациент, тем была выше продолжительность жизни (p=0,001) (рис. 3).
Рис. 3. Выживаемость пациентов в группе в зависимости от количества курсов химиотерапии.
Также прямая корреляционная зависимость установлена между продолжительностью жизни и возрастом пациента на момент постановки диагноза: чем моложе был пациент, тем продолжительность жизни была больше (p=0,002) (рис. 4).
Рис. 4. Выживаемость пациентов в группе в зависимости от возраста пациента на момент постановки диагноза.
Слабая положительная корреляционная связь наблюдалась и между степенью радикальности проводимого первого оперативного вмешательства и продолжительностью жизни. Чем радикальнее операция, тем выше продолжительность жизни (p=0,03) (рис. 5). При этом радикальность последующих оперативных вмешательств у пациентов с более чем одной операцией не влияла на продолжительность жизни.
Рис. 5. Выживаемость пациентов в группе в зависимости от радикальности проведенного первого оперативного вмешательства.
Корреляционной связи между продолжительностью жизни и полом пациента, предоперационным индексом Карновского, размером опухоли, локализацией опухоли, объемом лучевой терапии, количеством курсов ФДТ не выявлено.
Обсуждение
Злокачественные глиомы являются очень агрессивными опухолями. Длительно живущие пациенты составляют примерно 10% всех пациентов с глиобластомой. Тем не менее лишь у небольшого числа пациентов наблюдаются сильный ответ на терапию и чрезвычайно длительная выживаемость — около 10 лет и более [1—4].
По данным литературы, за последние годы было проведено 4 крупных ретроспективных когортных прогностических мультицентровых исследования с участием длительно живущих пациентов с глиобластомой и направленных на изучение социодемографических и клинических факторов с целью оценки их влияния на продолжительность жизни. Результаты этих исследований приведены в таблице [27—30].
Результаты исследований факторов, влияющих на продолжительность жизни, у длительно живущих пациентов с глиобластомой
| Исследование | Дизайн исследования | Период исследования | Описание примера | Изучаемые параметры | Результаты |
| S. Sccocianti и соавт. [27] | Ретроспективное когортное прогностическое исследования, мультицентровое | 2002—2007 гг. | n=1059. 5-летняя выживаемость 3,9% (n=41). 2-летняя выживаемость 24,8% (n=263) | Социодемографические и клинические факторы: возраст, пол, количество случаев, симптомы, предоперационный индекс Карновского, радикальность операции, лучевая терапия, объем химиотерапии | Статистически значимые социодемографические и клинические факторы после мультивариативного анализа: возраст (p<0,002), предоперационный индекс Карновского (p<0,01), радикальность резекции (p<0,001), лучевая терапия (p<0,001), химиотерапия (p<0,001). Генетические и молекулярные факторы не изучались |
| G. Reifenberg и соавт [28] | Ретроспективное когортное прогностическое исследования, мультицентровое | 2004—2012 гг. | n=301. 3-летняя выживаемость 9,3% (n=28) (выживаемость <1 года у 190 пациентов, выживаемость от 12—36 мес у 46 пациентов) | Социодемографические и клинические факторы: возраст, пол, предоперационный индекс Карновского, радикальность операции, лучевая терапия, объем химиотерапии, медиана выживаемости, молекулярно-генетические факторы (MGMT, IDH 1/2, делеция 1p/19q), молекулярные варианты (пронейрональный, мезенхимальный, классический) | По отношению к социодемографическому и клиническим факторам: возраст (p<0,02), безрецидивный период (p<0,001) были связаны с более длительной выживаемостью (36 мес). Генетические и молекулярные факторы: IDH 1/2 (p<0,001), MGMT метилирование (p<0,001) являлись статистически значимыми факторами, связанными с длительной выживаемостью |
| L. Gately и соавт. [29] | Ретроспективное когортное прогностическое исследования, мультицентровое | 2006—2012 гг. | n=776. 2-летняя выживаемость у 154 пациентов | Социодемографические и клинические факторы: возраст, пол, предоперационный ECOG, радикальность операции, локализация опухоли, лучевая терапия, объем химиотерапии, лечение при рецидиве, медиана выживаемости | Относительно факторов, связанных с длительным выживанием (более чем 2 года и 5 лет), были молодой возраст (p<0,001), ECOG 0-2 (p<0,001), тотальная резекция (p<0,001), адъювантная химиорадиотерапия (p<0,001), а также введение в клиническое исследование в случае рецидива (p=0,049). Возраст, тотальность резекции и адъювантная химиорадиотерапия были независимыми прогностическими факторами. Единственным предиктором выживаемости после 5 лет был возраст (p=0,02) |
| M. Tian и соавт. [30] | Ретроспективное когортное прогностическое исследование, мультицентровое | 2000—2008 гг. | n=6586. 5-летняя выживаемость 7,3% (n=483) | Социодемографические и клинические факторы: возраст, пол, раса, размер опухоли, радикальность операции, лучевая терапия, объем химиотерапии | Статистически значимые социодемографические и клинические факторы после мультивариативного анализа, показывающие более высокую выживаемость: возраст менее 40 лет (p<0,001), женский пол (p<0,001), раса, отличная от белых и черных американцев (p<0,001), отсутствие влияния на ствол мозга (p<0,001), а также лечение после 2005 г. (p<0,001). Генетические и молекулярные факторы не изучались |
Имеются и исследования на малых группах, но не менее ценных и значимых для оценки прогноза у пациентов с глиобластомой.
Так, T. Tykocki и M. Eltayeb [31] провели анализ литературы по клиническим исследованиям, содержащим информацию об очень длительно живущих, т.е. о пациентах с глиобластомой, живущих 10 лет и более. Согласно их систематическому обзору, 0,71% всех пациентов с глиобластомой имеют выживаемость более 10 лет. В целом 10-летняя общая выживаемость у длительно живущих пациентов с глиобластомой различалась в разных возрастных группах: в группах 0—14, 15—39 и 40+ лет выживают 14,9, 13,6 и 1,6% соответственно.
Оценка влияния ФДТ на результаты лечения пациентов с глиобластомой проведена у нескольких авторов. M. Nitta и соавт. [32] изучали результаты лечения 30 пациентов с глиобластомами после ФДТ. Результаты сопоставили с репрезентативной группой 164 пациентов с глиобластомами без ФДТ. Так, медиана общей выживаемости в группе с ФДТ составила 27,4 мес против 22,1 мес у пациентов без ФДТ.
В результатах работы J. Akimoto и соавт. [33] говорится о величине общей выживаемости в 26,0 мес (1 пациент —более 38,0 мес) у пациентов с глиобластомой с максимальной циторедукцией опухоли и сеансом ФДТ. Хотя для пациентов с рецидивом глиобластомы общая выживаемость после ФДТ составила только 8,5 мес.
Что касается связи между генетическими мутациями и выживаемостью, то отчеты показывают, что пациенты с глиобластомами, с мутациями IDH1/2 и метилированием промотора MGMT, более чувствительны к хирургической резекции и химиотерапии темозоломидом и имеют лучший прогноз [6, 11, 34].
Также на результаты лечения пациентов влияют повышенные уровни экспрессии генов, которые отвечают за синтез белков, таких как ABCG2 (представитель 2 подсемейства G АТФ-связывающей кассеты) и XIAP (связанный с X-хромосомой ингибитор апоптоза), активность которых опосредует устойчивость к терапии и к апоптозу клеток глиальной опухоли [35—38].
В нашем исследовании клинические особенности, такие как возраст на момент постановки диагноза и степень хирургической резекции, объем химиотерапии, имели прогностическую значимость при оценке их влияния на продолжительность жизни. Мутации IDH и MGMT-метилирование промотора явились наиболее важными молекулярными факторами, определяющими долгосрочную выживаемость пациентов. Количество курсов ФДТ не имело прямой корреляционной зависимости от продолжительности жизни.
В целом более молодой возраст является предиктором лучшей общей выживаемости. Пациенты с диагнозом «глиобластома» в возрасте до 40 лет имеют больше шансов на более длительную выживаемость, особенно на срок более 10 лет после постановки диагноза. Другим фактором, влияющим на прогноз пациентов с глиобластомой, является объем хирургической резекции, например 12-месячная величина безрецидивного периода увеличивается на 50% после полной резекции опухоли. Однако есть также сообщения о пациентах, перенесших частичную резекцию или биопсию, но проживших более 10 лет [3, 4]. В дополнение к более молодому возрасту и хорошему функциональному состоянию адъювантная химиотерапия считается положительным фактором, влияющим на продолжительность жизни у пациентов с глиобластомой [4, 5]. Проведение интраоперационной ФДТ также оказывает положительное влияние на величину безрецидивного периода и общей выживаемости за счет повышения радикальности проводимой операции и запуска каскада клеточных противоопухолевых механизмов [35—38]. Что касается генетических факторов, то пациенты с метилированием промотора MGMT и мутациями IDH1/2 чаще встречаются среди долгожителей.
Заключение
Злокачественные глиомы являются серьезной медицинской проблемой современного общества из-за высокой смертности. Даже при агрессивном клиническом лечении долгоживущие пациенты составляют менее 15% всех случаев. Клинические особенности, такие как возраст на момент постановки диагноза и степень хирургической резекции, являются известными факторами, влияющими на продолжительность жизни пациентов. Однако для персонализированного ведения пациентов генетическая, эпигенетическая, транскриптомная и протеомная информация должна дополнять ранние клинические проявления. На данный момент мутации IDH и MGMT-метилирование промотора являются наиболее важными молекулярными факторами, определяющими долгосрочную выживаемость пациентов с злокачественными глиомами. Также необходимо дальнейшее изучение новых методик лечения этой категории пациентов, одной из них является интраоперационная ФДТ, которая активирует некоторые звенья противоопухолевых механизмов.
Выявление факторов, способствующих длительной продолжительности жизни пациентов, важно для точной диагностики и правильного клинического ведения заболевания. Из-за небольшого числа пациентов с большой ожидаемой продолжительностью жизни сравнительные исследования генетических различий между мало- и долгоживущими затруднительны, что делает этот феномен плохо изученным. Однако выявление таких различий имеет решающее значение для установления механизма патогенеза злокачественных глиом.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.