Введение

Ограниченные возможности использования антибактериальных препаратов, а также формирование со временем устойчивости к антибиотикам способствуют развитию и внедрению различных альтернативных физических и химических методов инактивации микрофлоры при лечении инфицированных ран. Известно, что существует перечень из шести наиболее высоковирулентных и устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий, который включает Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp.

Трудности лечения гнойных ран мягких тканей обусловлены многими факторами, в том числе особенностями возникновения, формирования и характером течения раневого процесса. Особое место занимает рана, поверхность которой имеет неравномерную протяженность, сложную неправильную форму и контуры, зоны некротических изменений, а также часто глубокий раневой канал. Все это в совокупности с различными фиксирующими металлоконструкциями способствует прогрессированию воспалительной реакции и обсеменению микрофлорой [1]. Наличие большого количества патогенной флоры в ране ограничивает возможности хирургического закрытия дефектов, что достоверно увеличивает сроки госпитализации и выздоровления пациентов. Такие микроорганизмы, как P. aeruginosa, S. aureus и K. pneumoniae, являются одними из наиболее распространенных возбудителей в составе биопленок, представляющих наибольшую сложность при лечении ран [2].

Собственные наблюдения и данные литературы показывают, что частота инфекционных осложнений огнестрельных ран варьирует в пределах 25—50% случаев, а при политравмах может достигать и 90% [3—6]. Таким образом, проблема выбора метода инактивации антибиотикорезистентной микрофлоры остается весьма актуальной.

При затяжном течении инфекционного процесса в ране зачастую имеется высокая концентрация бактерий, которая приводит к формированию так называемого чувства кворума (QS), что является основной причиной ограничений деконтаминации [7]. QS играет ключевую роль во многих процессах жизнедеятельности бактериальных клеток. Прежде всего это образование биопленки, которая проявляет свойства, существенно отличающиеся от свойств свободноживущих бактериальных клеток. Это своего рода матрица, обеспечивающая социальное сотрудничество, захват ресурсов и повышенную выживаемость под воздействием антибиотиков. Биопленка дезактивирует антимикробную активность макрофагов и нейтрофилов, а также способна делегировать отдельным бактериям захват новых локализаций. Кроме того, помимо распространения по раневой поверхности биопленка оседает на глубину до нескольких миллиметров [8]. Таким образом, основной целью инактивации микрофлоры является разрушение биопленки и уменьшение количества бактерий с ограничением возможности образования QS [9], а также недопущение развития инфекции при «свежих» ранах.

Инфицированные раны, особенно бактериальными биопленками, недостаточно восприимчивы к имеющимся в настоящее время антибиотикам, что требует поиска альтернативных подходов для снижения концентрации патогенной микрофлоры. Антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ) или фотодинамическая инактивация (ФДИ) антибиотикорезистентной микрофлоры является методом, продемонстрировавшим свою эффективность в разрушении бактериальной биопленки [10]. Недавние исследования показывают эффективность ФДИ в заживлении ран благодаря ее антибактериальной активности, влиянию на биопленку и ремоделированию внеклеточного матрикса путем активации матриксных металлопротеиназ, что вызывает изменения в коллагене внеклеточного матрикса для процесса заживления тканей [11]. Одним из преимуществ ФДИ перед лечением антибактериальными препаратами является быстрое уничтожение микробных клеток в совокупности с крайне невысокой вероятностью развития фоторезистентности у микробов.

В данной работе описан подход к эффективному созданию условий для реконструктивных операций и заживлению вторичным натяжением антибиотикорезистентных огнестрельных ран с использованием лазерного и светодиодного облучения и различных групп фотосенсибилизаторов, с оценкой их относительной концентрации и определением оптимальных параметров светового воздействия.

Материал и методы

В исследование включены 90 пациентов с огнестрельными гнойными ранами. У всех пациентов при бактериологическом посеве раневого отделяемого выявлена микрофлора, устойчивая ко всем видам антибактериальных препаратов (рис. 1). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Рис. 1. Выявленная антибиотикорезистентная микрофлора.

До включения в исследование большинство пациентов (n=65; 72%) проходили лечение в отделении гнойной хирургии с применением различных методов инактивации микрофлоры (местные антисептики, бактериофаги, ультразвуковые методы, плазмо- и вакуум-терапия). Незначительный положительный эффект отмечен у 62 (95%) из 65 пациентов. Однако при контрольном микробиологическом исследовании сохранялся высокий уровень контаминации микрофлоры (с медианой в 10⁶ КОЕ/мл, p=0,05), нечувствительной ко всем группам антибактериальных препаратов. В связи с этим хирургическое лечение откладывалось, как и перевод на дальнейшие пути медицинской реабилитации. Раневой процесс имел вялотекущий характер, что значительно удлиняло сроки госпитализации в отделении гнойной хирургии. Отрицательная динамика отмечена у 3 (5%) пациентов.

Остальные 25 (28%) из 90 госпитализированных больных имели относительно «свежие» раны, при необходимости им проводили плановую санацию. В исследование не включали пациентов с неясной этиологией раневого процесса (эмболия сосудов, инородные тела и т.д.).

Всем 90 пациентам проводилась ФДИ (инактивация патогенной микрофлоры) локально лазерным или светодиодным излучением с помощью фотосенсибилизаторов (ФС), которые наносились местно (методом орошения) (таблица). Для лечения использовались растворы ФС (метиленовый синий (МС), «Фотосенс» — на основе фталоцианина алюминия (AlPc), производное хлорина е6 — «Фоторан e6» (Ce6)) в молекулярной форме (n=29) и в эмульсионной (нано-) форме (n=61). Препарат в эмульсионной форме синтезировали по методике, аналогичной описанной в работах A.G. Loginova и соавт. и A. Shiryaev и соавт. [12, 13]. Чистый лецитин яичного желтка (Serva, Германия) и ФС растворяли в этаноле. Бидистиллированную воду добавляли медленно тонкой струйкой при постоянном перемешивании со скоростью 700 об/мин с помощью блендера в течение 5 мин. Эмульсионную систему поддерживали при 30 °C во время синтеза, затем охлаждали до комнатной температуры. Терапевтические концентрации молекулярной и эмульсионной форм ФС были согласованы.

Перед каждой процедурой ФДИ поверхность раны или раневой канал очищали от раневого отделяемого, налетов фибрина, проводили удаление некротически измененных участков. Раствором хлоргексидина осуществляли санацию, после чего поверхность раны осушали марлевыми тампонами. У каждого пациента измеряли размер раны, на основании чего рассчитывали объем наносимого раствора ФС. Далее проводили ирригацию фотосенсибилизатора на всю поверхность раны с экспозицией в 2 мин.

ФДИ поверхностных ран больших и средних размеров (S_раны≥3см²) проводили с использованием светодиодных излучателей с длиной волны 660/680 нм (полная ширина полумаксимума менее 40 нм при 25 °C) для MC и Ce6/AlPc соответственно, что обеспечивало световое облучение с плотностью мощности около 350 мВт/см² (рис. 2). В свою очередь, для обработки каналов в глубоких ранах или небольших раневых поверхностей применяли лазер мощностью до 1,5 Вт с длиной волны 660/675 нм для MC и Ce6/AlPc соответственно и оптические диффузоры с торцевым и цилиндрическим излучателями на дистальном конце. Доза энергии в области светового облучения составляла 120—250 Дж/см². ФДИ проводили через день в течение 7 дней. Контрольный бактериологический посев раневого содержимого осуществляли в 1-й, на 3-й и 7-й дни лечения.

Рис. 2. Устройства для проведения ФДТ.

а — светодиодный источник излучения 660/680 нм и процесс светового облучения; б — лазерный источник 660 нм и 675 нм и процесс лазерного облучения с применением оптического рассеивателя для внутриканального облучения.

Для оценки внутритканевого распределения ФС и контроля эффективности фотообесцвечивания фотосенсибилизатора в тканях через 5 мин после нанесения препарата пациентам (n=43; 48%) проводили флуоресцентную диагностику методом лазерного спектрального анализа в области раневой поверхности до и во время ФДИ. Для этого использовали лазерный спектроскопический анализатор ЛЭСА-01-БИОСПЕК, включающий спектрометр, источник лазерного излучения (He-Ne-лазер, 632,8 нм) и диагностическое световодное волокно [13, 14]. Дистальным концом диагностического световода в режиме мягкого контакта регистрировали спектры обратного рассеяния излучения от раневой поверхности, после чего оценивали индекс флуоресценции в численном выражении (о.е.) на экране монитора в виде графиков и гистограмм. Полученные спектры помимо флуоресценции тканей включали диффузно рассеянное назад лазерное излучение (632,8 нм), которое характеризовало рассеивающие и поглощающие свойства тканей, а также геометрию измерения (положение дистального конца диагностического световода на раневой поверхности). Индекс флуоресценции рассчитывали как отношение интегральной интенсивности флуоресценции тканей в диапазоне 650—750 нм к интегральной интенсивности диффузно рассеянного лазерного излучения в диапазоне 625—640 нм. Для исключения дополнительных погрешностей измерения флуоресценции исследование проводили с предварительной санацией раны, поскольку раневое отделяемое и/или кровь могут экранировать лазерное излучение или давать ложную флуоресценцию.

Для оценки результатов лечения в динамике разработана балльная шкала на основе международной шкалы заживления пролежней (PUSH) [15], модифицированной для применения оценки эффективности фототерапии (см. таблицу). Динамику заживления оценивали по сумме баллов, присваиваемых в зависимости от изменения площади раневой поверхности, объема раневого отделяемого, имеющихся свойств грануляционной ткани раневого канала или поверхности, болевого синдрома, а также результатов бактериологических посевов и цитологического исследования.

Разработанная шкала для оценки заживления инфицированных ран после фототерапии

После сеансов ФДИ проводили хирургическое лечение (аутодермопластика, наложение вторичных швов, пластика раневых дефектов местными тканями) по показаниям. Всего отобраны 56 (62%) пациентов.

Результаты

С помощью фотодиагностики у всех пациентов (n=43) отмечено достоверное снижение концентрации ФС более чем на 75% после ФДИ (p<0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Пример спектрально-флуоресцентной диагностики раневых поражений с использованием молекулярного раствора AlPc.

а — спектральные данные флуоресценции тканей; б — распределение индексов флуоресценции.

Помимо контроля эффективности фотообесцвечивания ФС также проводилась спектрально-флуоресцентная диагностика с целью выявления оптимальных параметров светового воздействия, а именно — определения оптимального времени облучения. Все используемые ФС выгорали на 75% и более в измеренных точках через 9 мин (энергетическая доза 190 Дж/см²) после начала облучения.

Уже после первого сеанса ФДИ было заметно снижение концентрации микрофлоры. К 3-м и 7-м суткам получена значимая или полная инактивация бактерий (рис. 4).

Рис. 4. Инактивация антибиотикорезистентной раневой микрофлоры методом ФДТ (усредненные данные по всем пациентам).

Помимо инактивации микрофлоры по результатам оценки заживления антибиотикорезистентных ран после фототерапии с помощью предложенной модифицированной балльной шкалы установлено достоверное сокращение сроков заживления ран, что способствовало проведению отсроченных реконструктивных операций или заживлению ран вторичным натяжением. В течение первых двух суток после фототерапии наблюдалось уменьшение раневого отделяемого, образование грануляционной ткани, уменьшение отека.

Приводим клиническое наблюдение (рис. 5). Обширная рана циркулярного характера неправильной формы 15×7 см и глубиной до 1,5 см по внутренней поверхности верхней трети левой голени. Дно раны представлено сухожилиями и мышцами с множественными участками некроза. При поступлении имелся выраженный перифокальный отек с гнойным отделяемым. При посевах высеивалась грамотрицательная мультирезистентная бактерия Acintebakter baumani 10⁸. Через двое суток после первого сеанса ФДИ отмечали уменьшение размеров раны за счет тканевой контракции, очищение от участков некроза, уменьшение объема гнойного отделяемого, формирование в области дна участков розовых грануляций. Уменьшилась выраженность болевого синдрома как в покое, так и при механическом воздействии. Через 7 сут дно раны представлено розовыми грануляциями, перифокальное воспаление регрессировало. Характер раневого отделяемого сменился с гнойно-некротического на серозно-геморрагический. При контрольных посевах из раны рост микрофлоры не выявлен. Закрытие раневого дефекта выполнено методом аутодермопластики. Ранний послеоперационный период протекал без осложнений.

Рис. 5. Фотографии четырех процедур ФДИ.

Использован «Фотосенс», облучение лазером 675 нм с плотностью мощности 330 мВт/см², плотностью энергии 178 Дж/см², время облучения 9 мин. В последующем больному проведена аутодермопластика свободным перфорированным лоскутом.

Общие результаты лечения 90 больных с антибиотикорезистентной микрофлорой ран, согласно разработанной шкале оценки, выявили достоверное снижение суммарного балла на 3-и, 5-е, 7-е и 11-е сутки от начала применения ФДИ с 20,3 до 18; 14,7; 11,3 и 8,2 соответственно. В результате лечения у 76 (84%) пациентов достигнута полная инактивация антибиотикорезистентной микрофлоры. У оставшихся 14 (16%) больных замечено снижение концентрации патогенной микрофлоры в ранах после четырех сеансов ФДИ. Однако полной или значительной инактивации достигнуто не было. Это объясняется более «старыми» ранами на момент начала ФДИ у этих больных (n=14; 100%) (что может быть в последующем скорректировано увеличением количества сеансов ФДИ, т.е. индивидуальным, а не стандартизированным подходом к лечению), а также применением молекулярной формы ФС для некоторых больных.

Статистически значимых различий в результатах лечения среди ФС в молекулярной форме (МС, Ce6, AlPc) и отдельно среди препаратов в эмульсионной форме (наноМС, nanoCe6, nanoAlPc) не выявлено. Однако результаты лечения пациентов с помощью эмульсионных (нано-) форм ФС отличались от результатов лечения молекулярными растворами ФС. Эффективность лечения ФС в эмульсионной форме оказалась существенно выше, чем в молекулярной (89% против 72% инактивации микрофлоры соответственно, p<0,05). Это можно объяснить тем, что использование ФС в виде эмульсии позволило увеличить глубину проникновения препарата в ткани.

Благодаря проведенной ФДИ сокращены сроки предоперационной подготовки пациентов с ранами различной локализации. Активная хирургическая тактика позволила успешно закрыть раневые дефекты различными способами (100% случаев), а именно: аутодермопластикой, пластикой местными тканями, наложением вторичных швов. Таким образом, удалось достичь сокращения предоперационных койко-дней в 1,5 раза (p<0,05) и уменьшить сроки заживления ран в 2 раза (p<0,05).

Девять пациентов (10% случаев) указывали на кратковременное жжение во время нанесения препарата в эмульсионной форме при первом сеансе ФДИ. При последующих сеансах жжение отсутствовало. Проведенный анализ показал, что во всех девяти случаях у пациентов имелись раны, полученные менее трех недель до начала лечения ФДИ. Для минимизирования такого эффекта пациентам со «свежими» ранами может быть рекомендован ФС в молекулярной форме для первого сеанса, поскольку он не содержит этанол. Иных побочных эффектов терапии у пациентов не отмечено. После инактивации антибиотикорезистентной микрофлоры пациентов выписывали на дальнейшую медицинскую реабилитацию или переводили в специализированные отделения. К больным, раны которых не давали выраженного результата с помощью ФДИ, применяли другие методы лечения, и их также выписывали на дальнейшую медицинскую реабилитацию или переводили в специализированные отделения.

Обсуждение

Процесс заживления ран обычно непрерывен и переходит от коагуляции и некроза к фазе воспалительных изменений и периода очищения раны, затем к пролиферации клеток, миграции и дифференцировке и, наконец, к сокращению и ремоделированию раны с образованием рубцовой ткани [16, 17].

Имеются ограниченные сообщения об антимикробной ФДТ в животных моделях, а также в клинических испытаниях. Однако, согласно результатам систематического обзора литературы, найденной в последние годы, в которой анализировалась ФДИ in vivo с целью заживления ран у животных, получены обнадеживающие результаты [18, 19]. Сообщалось о влиянии различных ФС для ФДИ на инактивацию антибиотикорезистентных биопленок Streptococcus mutans и Staphylococcus aureus, раневых инфекций Acinetobacter baumannii, Vibrio vulnificus, C. albicans и Pseudomonas aeruginosa [17, 20, 21].

Конкретные механизмы, приводящие к заживлению ран при ФДИ, до конца не изучены. Однако известно, что после облучения ФС вступает в фотохимическую реакцию, генерируя свободные радикалы за счет отрыва или переноса электронов от молекулы субстрата, которые непосредственно уничтожают бактерии, если фотосенсибилизатор находится на бактериальной мембране или внутри нее. Помимо этого, в процессе взаимодействия электромагнитного излучения на длинах волн поглощения ФС и самого ФС, находящегося на или в бактериальной клетке, возможно образование высокореактивных состояний кислорода (таких как синглетный кислород), являющихся токсичными для окружающих клеточных составляющих бактерий. В таком случае в процессе ФДИ происходит окислительное повреждение клеточной мембраны, ферментативная инактивация и остановка процессов клеточного дыхания, а также каскада протеолитических ферментов каспаз, запускаемого высвобождением цитохрома С, кроме того, нарушается синтез белка и индуцируется мутация ДНК. Таким образом, происходит активация апоптоза, который играет одну из главных ролей в данном процессе [10].

Помимо этого, считается, что воздействие ФДТ на биопленку провоцирует целый комплекс реакций и ответов: продукцию фибробластами и кератиноцитами матриксных металлопротеиназ, цитокинов и факторов роста; а также специфический значимый иммунный ответ [17, 22—24] через продукцию липидов и провоспалительных цитокинов; высвобождение антигенов погибших клеток, обусловливающее активацию дендритных клеток кожи и тем самым способствующее отложению коллагеновых волокон [17, 22, 23].

Известно, что в процессе фотохимической реакции происходит снижение концентрации ФС, что клинически выражается в фотообесцвечивании [25]. В литературе имеется множество работ, указывающих на необходимость оценки фотообесцвечивания в процессе ФДИ с целью персонализированного контроля [26—29]. Достижение фотообесцвечивания 50% и более положительно влияет на результаты лечения [30]. Благодаря флуоресцентной спектроскопической диагностике в данном исследовании показана возможность in vivo персонализированного контроля выгорания ФС и, следовательно, эффективности светового воздействия на рану во время сеанса инактивации патогенной микрофлоры.

Хирургический контроль и коррекция состояния раневой поверхности является неотъемлемой частью лечения, однако на фоне некротических изменений и инфицирования тканей значительно удлиняется процесс заживления. Применение немедикаментозного метода инактивации антибиотикорезистентной микрофлоры (ФДИ) позволило в короткие сроки дезактивировать бактерии, что способствовало снижению воспалительной реакции и минимизировало возникновение осложнений в послеоперационном периоде.

Заключение

Таким образом, ФДИ является эффективным методом лечения и подготовки гнойных ран к хирургическому лечению в условиях антибиотикорезистентной микрофлоры. Кроме того, ФДИ может улучшать трофику тканей, тем самым сокращая сроки заживления ран и способствуя более быстрому проведению реконструктивных операций. Хирургическое лечение после ФДИ выполнено успешно и с меньшим количеством осложнений. Диагностический анализ, проводимый во время сеансов ФДИ, позволил оценить относительную концентрацию ФС в тканях, а также определить усредненное оптимальное время светового воздействия. Тем не менее проблема поиска оптимальных параметров ФДИ и количества сеансов остается открытой, в том числе для каждого класса препаратов и каждого пациента.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ширяев А.А., Иванков М.П., Лощенов В.Б., Решетов И.В.

Сбор и обработка материала — Калягина Н.А., Войтова А.В., Эфендиев К.Т., Кузнецов М.Р., Уденеев А.М.

Статистический анализ данных — Калягина Н.А., Войтова А.В., Эфендиев К.Т., Уденеев А.М.

Написание текста — Ширяев А.А., Калягина Н.А., Эфендиев К.Т., Иванков М.П.

Редактирование — Кузнецов М.Р., Лощенов В.Б., Решетов И.В.

Финансирование: Работа поддержана грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации на создание и развитие исследовательских центров мирового уровня №075-15-2020-912 — «Центр фотоники».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.