Введение

Глиобластома представляет собой наиболее злокачественное первичное новообразование головного мозга человека. Несмотря на комплексный подход (хирургическая резекция, химио- и лучевая терапия), медиана продолжительности жизни пациентов составляет около 15 мес.

Необходимым условием разработки новых диагностических и терапевтических препаратов для борьбы с данным заболеванием является проведение доклинических исследований на экспериментальных животных. Чаще всего используются крысы, реже — мыши. Применение адекватных моделей на животных рассматривается как принципиальный фактор, так как методы работы in vitro (с клеточными культурами, эксплантатами и т.д.) и методы компьютерного моделирования недостаточны для прогнозирования успеха применения новых терапевтических препаратов или методик в клинике [1]. В качестве моделей часто используют клеточные линии химически индуцированных опухолей (в частности, глиом), которые как исследуют in vitro, так и имплантируют подкожно или интракраниально животному-носителю/хозяину. Наиболее распространенные модели — C6 (на крысах линии Wistar), F98 и 9L (на крысах линии Fischer) [2, 3]. При имплантации в мозг 10⁵—10⁶ опухолевых клеток происходит формирование узла, который в дальнейшем может быть визуализирован на специализированных магнитно-резонансно-томографических (МРТ) аппаратах и гистологически.

Эксперименты показали, что эти модели обладают рядом недостатков, среди которых морфологические различия с глиобластомой человека, низкая опухолевая инвазия, аутоиммуногенность, низкая васкуляризация [4]. Отдельная и существенная проблема — это серьезное отличие опухолевых моделей животных от глиобластомы человека по молекулярно-генетическому профилю (значительно меньшей представленностью экспрессии EGFR, TERT или MGMT) [5]. Поэтому поиск модели, наиболее полно воспроизводящей характеристики глиобластомы человека, остается актуальным.

Для оценки метаболизма опухоли сегодня применяют позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), современные аппараты позволяют исследовать малые объекты типа крысы и мыши при использовании детекторных систем с высоким пространственным разрешением [6].

Экспериментальная глиобластома 101.8 — это тканевая модель глиобластомы, полученная путем интрацеребральной пассировки, т.е. последовательной трансплантации от животного-донора животному-реципиенту, без культивирования in vitro химически индуцированной опухоли головного мозга [7]. Считается, что по своим гистологическим характеристикам она в наибольшей степени соответствует глиобластоме человека [8, 9].

Нами проведено сравнение тканевой модели 101.8 и клеточной модели C6 по фенотипическим (компьютерная томография (КТ), МРТ, ПЭТ-КТ) и морфологическим характеристикам с целью выявления наиболее адекватной модели глиобластомы.

Материал и методы

Животные. В работе использовали половозрелых самцов крыс породы Wistar (масса 200—250 г, всего 12, из них 4 для ревитализации клеток глиомы 101.8). Животные случайным образом разделены на две группы по 4 особи, и им была привита глиома C6 или 101.8.

Имплантация глиомы 101.8. Тканевая глиобластома 101.8 получена из коллекции экспериментальных опухолей нервной системы и нейральных опухолевых клеточных линий Научно-исследовательского института морфологии человека им. акад. А.П. Авцына — ФГБНУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского».

Тканевая глиобластома 101.8 хранится в виде фрагментов ткани в криопротекторе при температуре –196 °C. Для ревитализации штамма ткань размораживали и отделяли криопротектор путем центрифугирования. Полученную суспензию имплантировали животным под золетил-ксилазиновым наркозом через надрез на коже головы и трефинационное отверстие. Рану ушивали. Через 14—20 дней развивались клинические симптомы опухоли. Животных усыпляли в CO₂-камере. Опухоль извлекали в стерильных условиях, затем измельчали и имплантировали экспериментальным животным в количестве 0,8—1 млн клеток (что определялось с помощью счетчика клеток EC-20 от «Bio-Rad», США) в правое полушарие мозга (латерально и каудально в 2 мм от брегмы) на глубину 4 мм от внешней поверхности черепа. Рану ушивали.

Имплантация глиомы C6. Использована клеточная линия глиомы C6 из коллекции ATCC, хранящаяся в лаборатории нейрогенетики и генетики развития ФГБУН «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук». Клетки размораживали, путем центрифугирования отделяли от криопротектора и культивировали в среде ДМЕМ/F12 («ПанЭко», Россия) с 10% содержанием фетальной эмбриональной сыворотки («Hyclone», США) и с L-глутамином («ПанЭко», Россия). Для имплантации клетки, находящиеся в log-фазе роста, открепляли от подложки при помощи раствора трипсина-Версена («ПанЭко», Россия) и концентрировали до 20 мкл в растворе Хэнкса («ПанЭко», Россия). Имплантация осуществлялась аналогичным образом, но в левое полушарие мозга.

Во время дальнейших исследований все животные находились в состоянии наркозного сна, вызванного 2% воздушной смесью изофлурана.

МРТ проводили на 7, 14 и 18-е сутки на сканере для животных Bruker BioSpec 7T («Rheinstetten», Германия) в Центре магнитной томографии и спектроскопии ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова». Препарат гадолиния с концентрацией 1,0 ммоль/мл вводили в хвостовую вену в дозе 0,4 ммоль/кг. Исследование начинали не позднее 5 мин после инъекции. В качестве основного режима сканирования применялась импульсная последовательность T1-FLASH. Полное время сканирования 3 мин.

МикроПЭТ-КТ-исследование. При достижении опухолью 2 мм и более проводили микроПЭТ-КТ-сканирование с ¹⁸F-FDG для определения метаболического объема. В случае накопления радиофармпрепарата (РФП) опухоль считалась сформировавшейся, проводили наблюдение за ее эволюцией с помощью ¹⁸F-FDG и ¹⁸F-FET попеременно (одно исследование в один день). Двум животным из группы 101.8 выполнить исследование с ¹⁸F-FET не удалось по техническим причинам.

У 2 животных дополнительно было проведено КТ-исследование с контрастированием с целью сопоставления с данными МРТ и оценки степени нарушения гематоэнцефалического барьера. КТ-сканирование выполняли в режиме ультравысокого разрешения, изображение реконструировали с размером вокселя 40×40×40 мкм. Область сканирования включала только голову [10].

ПЭТ-ОФЭКТ-КТ (ОФЭКТ — однофотонная эмиссионная компьютерная томография) проводили на трехмодальном доклиническом аппарате для животных MiLabs VECTor⁶ («MiLabs», Нидерланды) в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Радиофрампрепарат вводили внутривенно в хвостовую вену за 5 мин до сканирования по 137±26 МБк ¹⁸F-FDG и по 198±12 МБк ¹⁸F-FET. Длительность сбора данных составила 30 мин. Для анализа брали усредненные по всему времени сканирования изображения. Все количественные измерения осуществлялись в программном обеспечении PMod 4.0 (Швейцария).

Животных выводили из эксперимента на 18-е сутки роста опухоли. При гистологическом исследовании подсчитывали фигуры митозов, количество сосудов и площадь некрозов в поле зрения при увеличении 200 как минимум в 10 полях зрения.

Все исследования проводились в соответствии с принципами биомедицинской этики, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 г. и последующих поправках к ней. Кроме того, согласованы с Комиссией по биоэтике Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей — ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Результаты

Вне зависимости от модели глиомы накопление РФП либо не регистрировалось (при малых размерах опухоли, рис. 1), либо регистрировалось при использовании как ¹⁸F-FDG, так и ¹⁸F-FET, подтверждая эквивалентность применения любого из них в работе с глиальными моделями опухоли головного мозга у крыс. Индекс накопления ¹⁸F-FET в опухоли оказался ниже, чем индекс накопления ¹⁸F-FDG, только у 1 животного (крыса №2, табл. 1). Во всех остальных случаях, кроме животных с 101.8 моделью глиобластомы под №1 и №2, индекс накопления тирозина был равен или выше, чем индекс накопления ¹⁸F-FDG. При этом стандартизованная величина поглощения (SUV) ¹⁸F-FET в здоровой части мозга оказалась почти втрое ниже, чем ¹⁸F-FDG (0,43±0,16 против 1,26±0,20 по результатам всех проведенных измерений).

Рис. 1. Накопление различных радиофармпрепаратов в эксперименте у одного и того же животного (крыса №4) с моделью 101.8.

Стрелка указывает на опухоль. а — ¹⁸F-FDG до появления метаболической активности в опухоли; б — ¹⁸F-FDG после начала активного роста опухоли; в — накопление ¹⁸F-FET, измеренное на следующий день после получения изображения «б» у того же животного. На рис. в определяется слабое накопление радиофармпрепарата в здоровой части мозга, ввиду чего мозг выглядит как зона пониженного метаболизма. На фоне низкого накопления радиофармпрепарата в здоровой ткани опухоль видна контрастнее. На изображениях, полученных с ¹⁸F-FDG (а, б), отмечается накопление радиофармпрепарата как в опухоли (обозначено на рис. б), так и в мозговой ткани. Контрастность опухоли по сравнению с другим радиофармпрепаратом меньше. Дополнительно визуализируется накопление радиофармпрепарата в мышцах языка, что позволяет его легко локализовать на позитронно-эмиссионной томограмме, совмещенной с компьютерной томограммой.

Таблица 1. Параметры опухоли в точке наибольшего роста по измерениям с помощью микропозитронной-эмиссионной томографии ¹⁸F-FDG (в скобках ¹⁸F-FET)

Примечание. н/д — нет данных; ИН — индекс накопления.

Сравнение моделей глиом показало определяемую на МРТ и ПЭТ-КТ разницу в диагностических характеристиках новообразований (рис. 2).

Рис. 2. Позитронно-эмиссионная томограмма, совмещенная с компьютерной томограммой. Исследование у крысы с тканевой моделью глиобластомы 101.8 (верхний ряд) и C6 (нижний ряд).

Позитронно-эмиссионная томограмма, совмещенная с компьютерной томограммой, демонстрирует различные паттерны накопления ¹⁸F-FDG в опухолевой ткани: периферический тип с центральным некрозом при 101.8 и компактный тип при C6-моделях глиобластом (без центрального некроза).

Модель 101.8 к моменту использования методов визуализации демонстрировала большие размеры (трех-четырехкратное превышение над объемом опухоли C6), что делало удобной оценку полученных изображений и отслеживание эволюции опухоли (см. табл. 1). При этом все животные сохраняли хорошее самочувствие и дожили до конца эксперимента, несмотря на наличие обширного некроза в центре опухоли.

При МРТ опухоль определялась в виде достаточно компактного узла с выраженным гетерогенным строением, с очагами микрокровоизлияний и микрокистами, неоднородно накапливала контрастный препарат. Во всех случаях при ПЭТ-КТ-исследовании была обнаружена центральная область с низкими показателями накопления РФП, что предполагало наличие центрального некроза в опухоли. Периферические отделы опухоли демонстрировали выраженную аккумуляцию РФП.

Случаев спонтанного излечения или смерти животного до момента завершения эксперимента при данной модели не наблюдалось.

Модель C6 в нашем эксперименте оказалась менее стабильной. У 1 животного (№1), несмотря на первично определяемую метаболическую активность, опухоль в динамике перестала визуализироваться при ПЭТ-КТ. Животное №2, у которого опухоль демонстрировала высокую метаболическую активность с ¹⁸F-FET (T/N=3,3), было исключено из эксперимента до его окончания из-за плохого состояния. При МРТ с контрастированием опухоли демонстрировали относительно гомогенное контрастирование с демонстрацией в 2 случаях многоузлового роста. Во всех наблюдениях при ПЭТ-КТ определялось компактное распределение РФП в структуре новообразования.

Проницаемость гематоэнцефалического барьера в новообразовании в эксперименте была продемонстрирована на основе данных МРТ с контрастным усилением. Во всех случаях опухоль интенсивно накапливала контрастный препарат, что позволяло ее достаточно четко детектировать на МР-изображениях и, таким образом, отбирать животных для дальнейших ПЭТ-КТ-экспериментов. В 2 случаях с животными (модель 101/8) мы использовали микроКТ с введением рентгеноконтрастного препарата (йопромид, 185 мг йода/мл). Области накопления последнего совпадали с зонами контрастирования по данным МРТ и полностью соответствовали участкам с высоким захватом ¹⁸F-FDG (рис. 3). Однако использование микроКТ в нашем эксперименте не нашло своего практического применения в силу длительности получения изображений с необходимостью проведения непрерывной инфузии контрастного средства, что приводит к высокой водной нагрузке на животное. В то же время при отсутствии специализированной МРТ данный метод может быть использован в комплексной оценке топографии опухоли в эксперименте на крысах.

Рис. 3. Животное №1. Тканевая модель опухоли 101.8.

а — позитронно-эмиссионная томограмма, совмещенная с компьютерной томограммой, с ¹⁸F-FDG (верхний ряд); б — микрокомпьютерная томограмма изображения во фронтальной проекции и при сагиттальной и аксиальной реформации на фоне контрастного усиления; в — позитронно-эмиссионная томограмма, совмещенная с компьютерной томограммой. Компьютерная томограмма демонстрирует больших размеров и гетерогенно контрастирующуюся опухоль (отмечена в центре пересечения линий). Определяется полное совпадение метаболической активности при позитронно-эмиссионной томографии, совмещенной с компьютерной томографией, и зоны нарушения гематоэнцефалического барьера по данным компьютерной томограммы с контрастированием. Яркий очаг в опухоли по позитронно-эмиссионной томограмме, совмещенной с компьютерной томограммой, представляет собой зону высокой плотноклеточности, и зона снижения плотности — область некроза.

Гистологически модель 101.8 во всех случаях демонстрировала высокую плотноклеточность с наличием полиморфных клеток различного размера, с полиморфными ядрами и широким ободком цитоплазмы (рис. 4, б). Митотическая активность была высокой — с 5—6 митозами в поле зрения (×200) (табл. 2). Кроме того, для этой модели глиобластомы была характерна высокая васкуляризация. Сосуды при этом имели нарушенную архитектонику, истонченную мышечную стенку, фенестрации. Отмечалось множество псевдопалисадных структур и некрозов, причем площадь некрозов была выше в центральной зоне. Граница опухоли была относительно четкой, однако присутствовали отдельные участки с диффузным ростом опухоли в окружающие здоровые ткани, где рост клеток происходил по перинейрональному и периваскулярному пути. По границе опухоли наблюдался астроцитарный вал.

Рис. 4. Гистологический срез опухоли и магнитно-резонансная томограмма мозга животного с контрастным усилением.

а — глиома C6; б — глиома 101.8. Описание гистологических препаратов представлено в тексте.

Таблица 2. Морфометрические показатели глиомы C6 и 101.8 на 18-й день роста

Глиома C6 гистологически демонстрировала также высокую плотноклеточность с присутствием выраженного волокнистого компонента, соотношение цитоплазмы к ядру 1:1 (рис. 4, а). Количество митотически делящихся клеток 3—4 в поле зрения (×200) (см. табл. 2). Сосудистый компонент представлен редкими новосформированными сосудами неправильной формы. Количество и площадь некрозов значительно отличались в центре и на периферии опухоли. На периферии опухоли отмечены лишь единичные мелкие некрозы в отдельных случаях. В большинстве случаев наблюдался центральный некроз. При этом в сравнении с 101.8-моделью площадь некроза была значительно меньше (см. табл. 2). Псевопалисадные структуры не обнаружены. Граница опухоли четкая, астроцитарный вал, перинейрональный и периваскулярный рост не выражены.

По данным МРТ, глиома C6 на 7-й день после имплантации определялась как небольшое объемное образование, крайне слабо накапливающее контрастный препарат (рис. 5). На 14-й день отмечали значительное разрастание опухолевого узла, причем у 2 животных опухоль была представлена в виде двух узлов роста с разным накоплением контрастного агента. На 18-й день роста происходило значительное разрастание опухоли, при этом в 1 случае сформировался обширный центральный некроз (№1). Остальные 2 случая демонстрировали сохраняющееся компактное контрастирование.

Рис. 5. T1-взвешенные магнитно-резонансные изображения головного мозга крыс с глиомами 101.8 и C6 на фоне контрастного усиления на 7, 14 и 18-е дни после имплантации опухоли.

На магнитно-резонансных томограммах определяется типичный паттерн роста опухолей (описание в тексте).

На 7-й день после имплантации глиобластомы 101.8 у всех животных наблюдали сформированные опухолевые узлы (см. рис. 5). Накопление контрастного препарата было неравномерным, что свидетельствовало о высокой гетерогенности опухоли. На 14-й и 18-й дни после имплантации зафиксировано значительное разрастание опухолевого узла, остановок роста не было ни в одном случае. Структура опухоли имела гетерогенный вид, с формированием множественных зон мелких и средних размеров некрозов.

Обсуждение

Наиболее популярными сегодня являются клеточные культуры глиом C6, F98, 9L и др., имплантируемые экспериментальным животным подкожно или интракраниально. Эти модели используются во многих фундаментальных исследованиях, в частности при изучении белка-транслятора TSPO [11, 12], нового РФП — [18F]VUIIS1018A, ферментов класса гистондеацетилазы (HDACs) [13], экспрессии рецепторов σ₂ с помощью также нового РФП — [18F]RM273 [14, 15], ингибитора ALK2-рецепторов как средства лечения диффузно растущей глиомы моста [16]. Все эти исследования проводятся на крысах [17] и подразумевают необходимость введения в мозг животного примерно 1 млн клеток [18]. Применяемые сегодня РФП демонстрируют сходную эффективность в визуализации экспериментальной глиомы [6, 19].

Известно, что рост злокачественной опухоли напрямую связан с ее васкуляризацией [20, 21]. Опухолевые сосуды имеют нарушенную морфологию и архитектонику, что в итоге приводит к формированию ишемии, кровоизлияний, гибели клеток и некрозу опухоли [22—24]. Такие процессы характерны для злокачественных глиом человека и наблюдаются в глиобластоме 101.8.

Популярная в настоящее время модель глиомы C6 в нашем исследовании не продемонстрировала подобных характеристик на тканевом уровне. В опухоли обнаружены отсутствие гетерогенности, крайне скудная васкуляризация и низкая способность к формированию некрозов (за исключением 1 наблюдения с формированием обширного центрального некроза к 18-м суткам после имплантации), полное отсутствие псевдопалисадных структур и опухолевой инвазии, свойственных глиобластоме человека.

С другой стороны, примененная в нашем исследовании тканевая модель 101.8 показала высокую гетерогенность структуры опухоли, признаки неоваскуляризации и инвазии в окружающие ткани. Кроме того, по нейровизуализационным и гистологическим характеристикам она имеет высокое сходство с глиобластомой человека.

Важно отметить, что эффективность ПЭТ-КТ с ¹⁸F-FDG и с ¹⁸F-FET в визуализации тканевых моделей глиомы у крыс оказалась сходной, что делает использование более доступного ¹⁸F-FDG в эксперименте оправданным с практической точки зрения.

Заключение

Исследования новой тканевой модели 101.8 с помощью ПЭТ, КТ и МРТ, а также гистологические показали ее фенотипическое и гистологическое сходство с глиобластомой человека. Особенности роста опухоли делают ее удобной для проведения экспериментальных исследований с использованием различных методов нейровизуализации. По нашему мнению, изученная тканевая модель глиобластомы 101.8 может быть рекомендована научным группам, испытывающим новые диагностические и терапевтические препараты на животной модели.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Пронин И.Н., Постнов А.А., Липенгольц А.А., Павлова Г.В., Григорьева Е.Ю., Алексеева А.И.

Сбор и обработка материала — Липенгольц А.А., Ревищин А.В., Скрибицкий В.А., Финогенова Ю.А., Смирнова А.В., Шпакова К.Е., Козлова Ю.А., Алексеева А.И.

Статистический анализ данных — Постнов А.А.

Написание текста — Пронин И.Н., Постнов А.А., Липенгольц А.А., Алексеева А.И.

Редактирование — Пронин И.Н., Постнов А.А., Финогенова Ю.А., Шпакова К.Е., Алексеева А.И.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по соглашению №075-15-2024-561.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Работа посвящена сравнению двух экспериментальных моделей глиомы крыс по их морфофизиологическим и функциональным характеристикам.

В основу работы положены эксперименты на половозрелых крысах Вистар с имплантированными интракраниально образцами глиомы. Рост и развитие опухоли были оценены методами магнитно-резонансной и позитронно-эмиссионной томографии. Дополнительно проведена гистологическая верификация опухолей у животных.

Полученные результаты продемонстрировали высокое сходство обеих моделей по своей метаболической активности в сравнении с глиобластомой человека. При этом по результатам магнитно-резонансной томографии и гистологического исследования были выявлены существенные отличия моделей. В то время как модель 101.8 показала высокое сходство со спонтанной глиобластомой, модель C6 продемонстрировала существенные недостатки, такие как низкая гетерогенность, отличные от спонтанной глиомы накопление и распределение контрастного препарата, неадекватная некротизация тканей в динамике.

Исследование выполнено в полном объеме, полученные и продемонстрированные данные позволяют согласиться с выводами авторов статьи об исследованных моделях. Тем не менее в качестве замечания авторам следует учесть следующее: на магнитно-резонансных томограммах продемонстрированы томограммы от разных животных. Несмотря на то что указано, что данный вид опухоли является типичным, читателям было бы интересно наблюдать за динамикой развития опухоли у конкретного животного, так как это более предметно отразило бы появление и развитие некротических зон.

Данная работа имеет адекватный дизайн эксперимента, характеризуется новизной, обладает высоким потенциалом для дальнейшего использования в экспериментальной нейроонкологии и важным научно-практическим значением.

С.Э. Гельперина (Москва)