Голимбет В.Е.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Коровайцева Г.И.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Габаева М.В.

ФГБУ "Научный центр психического здоровья" РАМН, Москва

Великая Н.В.

Городская клиническая психиатрическая больница №1 им. Н.А. Алексеева, Москва

Снегирева А.А.

ГКУЗ "Московская городская клиническая психиатрическая больница №1 им. Н.А. Алексеева", Москва

Каспаров С.В.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Колесина Н.Ю.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Ганишева Т.К.

Савельева Т.М.

Городская клиническая психиатрическая больница №1 им. Н.А. Алексеева, Москва

Изучение генов интерлейкина-1 и индоламин-2,3-диокси­геназы у больных шизофренией

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2014;114(5): 46-49

Просмотров : 34

Загрузок :

Как цитировать

Голимбет В. Е., Коровайцева Г. И., Габаева М. В., Великая Н. В., Снегирева А. А., Каспаров С. В., Колесина Н. Ю., Ганишева Т. К., Савельева Т. М. Изучение генов интерлейкина-1 и индоламин-2,3-диокси­геназы у больных шизофренией. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2014;114(5):46-49.

Авторы:

Голимбет В.Е.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва

Все авторы (9)

В последние годы наблюдается возрастание интереса к изучению роли кинуренинового пути метаболизма триптофана в патогенезе шизофрении [1, 2]. Продукты метаболизма триптофана оказывают влияние на функцио­нирование глутаматергических нейронов. Кинурениновая кислота, в частности, является антагонистом рецепторов глутамата типа NMDA. Этот метаболит блокирует рецепторы, что ведет к снижению активности глутаматергической системы, которой отводится существенная роль в механизмах развития заболевания.

Триптофан - одна из незаменимых аминокислот, поступающих в организм человека преимущественно с белковыми компонентами пищи. Аминокислота и ее метаболиты участвуют в различных процессах, регулирующих функции большинства клеток. При этом характер регуляции во многом зависит от особенностей обмена триптофана, определяемых конкуренцией между разными путями его деградации. Метаболизм триптофана в организме может проходить по пути метоксииндольному (ведет к образованию серотонина и мелатонина) и кинурениновому. В последнем случае образуются метаболиты, обладающие нейротоксическим действием (кинуреновая кислота, 3-гидроксикинуренин, хинолиновая кислота), повышенные концентрации которых обнаружены в крови и цереб­роспинальной жидкости больных шизофренией [3-5].

Выбор пути, по которому пойдет метаболизм триптофана, определяется многими факторами. В качестве одного из них выступает наличие легкого воспалительного процесса, имеющего место при шизофрении [6]. Такое предположение обосновано тем, что на первом этапе кин­уренинового пути триптофан превращается в кинуренин с помощью фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), а индуктором IDO являются провоспалительные цитокины. Ранее считалось, что основным стимулятором IDO является γ-интерферон [7, 8]. Однако в недавнем исследовании было обнаружено, что в культуре гиппокампальных нейронов линии HPC03A/07 активатором экспрессии IDO и увеличения уровня кинуренина был интерлейкин-1β (IL-1β) [9].

Цель настоящего исследования - изучение полиморфизмов в кодирующих эти белки генах для поиска их ассоциации с шизофренией. В случае обнаружения ассоциации и соответственно вариантов риска предполагалось исследовать возможность использования этих вариантов или их комбинаций в целях генетического тестирования на предрасположенность к шизофрении.

Для исследования гена IL-1β были выбраны полиморфные локусы (полиморфизмы) T-511C (rs16944) и C3954T (rs1143634), а для гена IDO - VNTR[1] и rs9657182. Локус T-511C расположен в области промотора, а C3954T - в экзоне 5 гена. Полиморфизм обусловлен заменой ти­мина (Т) на цитозин (С). Оба полиморфизма являются функциональными, т.е. при замене нуклеотидов имеет место изменение экспрессии соответствующего белка. Минорные аллели, т.е. аллели с более низкой популяционной частотой, связывают с более высокой продукцией белка, т.е. высокая активность характерна для аллелей Т [10]. Локусы VNTR и rs9657182 расположены в области промотора гена. Полиморфизм VNTR обусловлен разным числом повторов, состоящих из 24 п.о., а rs9657182 - заменой Т на С. По данным литературы [11], полиморфизм VNTR не оказывал влияния на транскрипционную активность, индуцированную цитокинами, in vitro, но некоторые данные указывают на его роль в поддержании баланса триптофана. Полиморфизмы гена IL-1β ранее использовали для поиска ассоциации с шизофренией [10-14], полиморфизмы гена IDO в этом аспекте будут изучены впервые.

Материал и методы

В исследование были включены 296 больных с параноидной шизофренией (рубрика F20.0 по МКБ-10). Среди них было 114 (38,5%) женщин и 182 (61,5%) мужчины. Средний возраст обследованных был 40,6±14,0 лет, средний возраст к началу заболевания 25,1±9,7 года.

Контрольная группа включала 355 человек без психических заболеваний - 199 (56,1%) женщин и 156 (43,9%) мужчин, средний возраст которых был 33,5±13,0 лет.

Все обследованные были этнически русские, давшие информированное согласие на участие в исследовании.

Молекулярно-генетическое исследование включало выделение ДНК из венозной крови больных и проведение генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим разделением полученных фрагментов с помощью электрофореза. ДНК из венозной крови выделяли стандартным фенол-хлороформным методом. Для определения аллельного полиморфизма 511T>C гена IL-1β проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой - 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3', обратный - 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3'. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкМ каждого из праймеров, 10× буфер для Taq-полимеразы («Helicon»). ПЦР проводили по следующей схеме: денатурация в течение 2 мин при 94 °C, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 20 с; 58 oC - 20 с; 72 oC - 20 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 4 мин. Рестрикцию проводили с помощью фермента Ama87I (фирма «Сибэнзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение полученных фрагментов осуществляли в 8% полиакриламидном геле в течение 1 ч при 240V. Размер фрагмента, полученного в результате амплификации, составлял 305 пар оснований (п.о.). После проведения рестрикции наличие фрагмента величиной 305 п.о. свидетельствовало о присутствии гомозиготных аллелей TT, наличие фрагментов величиной 190 и 115 п.о. - гомозиготных аллелей CC. Наличие трех фрагментов величиной 305, 190 и 115 п.о. свидетельствовало о гетерозиготном генотипе TC.

Для определения полиморфизма C3954T гена IL-1B проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой - 5'-CTCAGGTGTCCTCGAAGA AATCAAA и обратный -5'-GCTTTTTTGCTGTGAGTC CCG. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкМ каждого из праймеров, 10× буфер для Taq-полимеразы («Helicon») и (формамид или DMSO). Денатурацию проводили в течение 4 мин при 96 oС, далее - 35 циклов амплификации (95 oC - 30 с; 58 oC - 40 с; 72 oC - 25 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 2 мин. Рестрикцию проводили ферментом Taq («Fermentas» или «Сибэнзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение фрагментов осуществляли в 3,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в течение 1 ч при 240V. После рестрикции получали фрагмент длиной 164 п.о. (генотип ТТ) и фрагменты 52 и 112 п.о. (генотип СС). На наличие гетерозиготного генотипа TC указывало наличие трех фрагментов величиной 305, 190 и 115 п.о.

Для определения полиморфизма IDO VNTR использовали олигонуклеотидные праймеры: прямой - 5'-AAT CCTGGGACAGAATCATC и обратный -5'ATGAGGCTA ATACTTTGGG. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкМ каждого из праймеров, 10×буфер для Taq-полимеразы («Helicon») и 0,8M бетаина. Денатурацию проводили в течение 4 мин при 94 oС, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 30 с; 53 oC - 30 с; 72 oC - 30 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 2 мин. Разделение полученных фрагментов осуществляли в 8% поли­акриламидном геле в течение 1 ч при 240V. Размеры фрагментов составляли: 208 п.о. (аллель V1) и 232 п.о. (аллель V2).

Для полиморфизма IDO rs9657182 использовали олигонуклеотидные праймеры: прямой - 5'-TGCTCCAAA ATTATATGAGATTCC и обратный -5'GACACAACACTT TAGGATTTGCA. Состав реакционной смеси был тот же, что и для полиморфизма IDO VNTR. Денатурацию проводили в течение 4 мин при 94 oС, далее - 30 циклов амплификации (94 oC - 30 с; 61 oC - 30 с; 72 oC - 30 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 oC 2 мин. Рестрикцию проводили ферментом Bsp19I («Сиб­энзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение фрагментов осуществляли в 8% полиакрил­амидном геле в течение 1 ч при 240V. После рестрикции получали фрагмент длиной 232 п.о. (генотип CC) и фрагменты 90 и 142 п.о. (генотип TT). На наличие гетерозиготного генотипа TC указывало наличие трех фрагментов величиной 232, 90 и 142 п.о.

Статистическая обработка включала в себя построение таблиц сопряженности с использованием критерия &khgr;2 для оценки значимости различий. Для расчета риска использовали показатель отношение шансов (ОШ) с приведением доверительного интервала при вероятности 95% (95% ДИ). Для поиска комбинаций вариантов применяли программу MDR (Multiple Dimensions Reduction), с помощью которой можно подобрать оптимальную комбинацию генетических вариантов, связанную с риском заболевания. Также эта программа позволяет оценить чувствительность[2] и специфичность[3] использования комбинации в качестве маркера предрасположенности к заболеванию. На основании этих показателей рассчитывали усредненную величину (AUC) по формуле: (чувствительность + специфичность)/2, с помощью которой можно качественно оценить прогностическую ценность маркера[4].

Результаты и обсуждение

Распределение аллелей и генотипов по полиморфизмам в группах больных шизофренией и психически здоровых представлено в табл. 1-4.

Отклонения от равновесия Харди-Вайнберга не наблюдалось ни в одном случае. При сравнении распределения частоты аллелей и генотипов по каждому из полиморфизмов были обнаружены различия между группами для полиморфизма C3954T, отмеченные на уровне тенденции (&khgr;2=5,7, df=2, р=0,05)[5]. Значимые различия найдены между частотой генотипа СС и генотипов, содержащих аллель Т (генотипы СТ и ТТ). В группе больных частота генотипа, содержащего аллель Т, была выше, чем в группе здоровых (&khgr;2=5,6, df=1, р=0,02; ОШ 1,47, 95% ДИ 1,07-2,03). Также была выявлена комбинация для двух полиморфизмов гена IDO, которая чаще встречалась у больных шизофренией, но различия в частоте не достигали статистической значимости (р=0,06). Эта комбинация включала в себя варианты V1V1 (полиморфизм VNTR) и СС (полиморфизм rs9657182). При использовании программы MDR удалось определить комбинацию, состоящую из вариантов всех включенных в исследование генов. Она включала в себя четыре варианта: 1) генотипы по полиморфизму IL-1β T-511C, содержащие аллель С (СС+СТ); 2) генотипы по полиморфизму IL-1β C3954T, содержащие аллель Т (СТ+ТТ); 3) генотипы по полиморфизму IDO VNTR, содержащие аллель V1 (V1V1 1 и V1V2); 4) генотипы по полиморфизму IDO rs9657182, содержащие аллель С (СС+СТ). Сокращенно эта комбинация может быть обозначена как С-Т-V1-С. Точность модели была 63%, чувствительность - 83%, специфичность - 40%, ОШ - 3,3 (2,3-4,8). Прогностическая ценность маркера составила 62%, что соответствовало среднему уровню.

Таким образом, результаты работы указывают на существование связи между генами IL-1β и IDO и шизофренией. Эти результаты вполне согласуются с высказанным предположением, которое опиралось на кинуренин-кин­уреновую гипотезу происхождения шизофрении и экспериментальные биохимические данные о роли IL-1β и IDO в кинурениновом пути метаболизма триптофана [9]. При изучении полиморфизмов IL-1β T-511, IL-1β C3954T, IDO VNTR, IDO rs9657182 в группах больных шизофренией и психически здоровых мы обнаружили комбинацию С-Т-V1-С. Эта комбинация значимо чаще встречалась в группе больных по сравнению с контролем. У ее носителей риск развития шизофрении был в 3,3 раза выше, чем у носителей других генетических вариантов. В комбинацию вошли аллель С (IL-1β T-511С) и аллель Т (IL-1β C3954T), которые и ранее изучали у больных шизофренией. Метаанализ нескольких исследований, в сумме включающий 819 больных шизофренией и 1292 психически здоровых, показал существование ассоциации (ОШ 1,24) между аллелем С полиморфизма T-511С и заболеванием у европеоидов [10]. Полученные нами результаты подтверждают эти данные. Связь между шизофренией и полиморфизмом C3954T ранее изучалась только в азиатских популяциях [15, 16], но результат был негативный. Что касается гена IDO, то, как уже упоминалось, полиморфизмы этого гена никогда не изучали у больных шизофренией. В нашем исследовании впервые было обнаружено, что вариантами риска являются аллели V1 и С. Нужно отметить, что полиморфизм IDO rs9657182 ранее использовали при изучении генов психических заболеваний. Например, по данным работы [17], аллель С был связан с риском развития депрессии у больных гепатитом С, для лечения которых применяли интерферон-α.

Оценка возможности использования комбинации С-Т-V1-С в качестве маркера риска шизофрении показала, что для него характерны высокая (более 80%) чувствительность, но низкая (в пределах 60-70%) специфичность и соответственно средний уровень прогностической ценности.

На основании этих показателей можно сделать заключение о возможностях и ограничениях использования маркера в практических целях. К его достоинствам можно отнести высокую чувствительность, которая необходима, если важно выявить как можно больше лиц, имеющих предрасположенность к шизофрении, при проведении, например, медико-генетического тестирования или скрининговых исследований. К ограничениям следует отнести низкую специфичность, т.е. повышенную вероятность выявления ложноположительных случаев в группе здоровых людей. Исходя из этих данных, представляется целесообразным рекомендовать использование выявленного генетического маркера для выявления групп ультравысокого риска по шизофрении, т.е. в случаях, когда основной задачей является выявление лиц с генетической предрасположенностью к заболеванию для дальнейшего наблюдения.

Работа выполнена при частичной поддержке грантом РФФИ №12-04-00108-а.

[1] VNTR (от англ. variable number of tandem repeats) - полиморфизм, обусловленный разным числом повторяющихся последовательностей (повторы) нуклеотидов, примыкающих друг к другу (тандем).

[2] Чувствительность определяется как процент положительных результатов в группе больных.

[3] Специфичность определяется как процент отрицательных результатов в группе здоровых.

[4] AUC=0,5 - случайный классификатор; AUC=0,6-0,7 - средний классификатор; AUC=0,7-0,8 - хороший классификатор.

[5] df - число степеней свободы.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail