Анализ ассоциаций с рассеянным склерозом генетических маркеров предрасположенности, выявленных в результате полногеномных исследований

Рассеянный склероз (РС) — хроническое диссеминированное демиелинизирующее заболевание ЦНС, сопровождающееся прогрессирующей нейроаксональной деградацией. Женщины страдают РС чаще, чем мужчины, причем показатель соотношения числа заболевших женщин к числу мужчин значительно вырос за последние десятилетия (2,3—3,5:1), что отражает повышение заболеваемости РС среди женщин [1]. В Российской Федерации распространенность РC составляет 50 на 100 тыс. населения, а в Республике Башкортостан — 38 на 100 тыс. населения [2, 3].

Принято считать, что РС — это аутоиммунное заболевание, которое развивается в результате реакции Т-лимфоцитов на аутоантигены ЦНС у генетически предрасположенных к заболеванию индивидов [4]. В результате проведения полногеномных ассоциативных исследований (GWAS — Genome-Wide Association Studies) к настоящему времени идентифицировано около 400 генетических вариантов, ассоциированных с РС, большинство из которых является биомаркерами иммунного ответа и воспаления и зачастую ассоциировано с другими аутоиммунными заболеваниями (https://www.ebi.ac.uk/gwas/efotraits/EFO_0003885). Поскольку большинство генетических маркеров, выявленных в результате проведения GWAS, обладает небольшими эффектами, для их обнаружения необходимо увеличение размеров выборок, что достигается благодаря включению в исследование людей из различных этнических групп. Подобная этническая гетерогенность может влиять на результаты исследования, поскольку разные популяции могут различаться по аллельным частотам полиморфных вариантов и паттернам неравновесного сцепления [5]. Это может приводить к появлению ложноположительных результатов вследствие популяционной стратификации, в связи с чем необходима валидация результатов GWAS на независимых, желательно этнически гомогенных выборках [6].

Цель исследования — проведение репликативного анализа ассоциаций с РС генетических маркеров предрасположенности, выявленных в результате проведения GWAS в группах русских и татар, проживающих в Республике Башкортостан (Российская Федерация).

Группа исследования состояла из 1724 человек, русских (n=773) и татар (n=951) по этнической принадлежности, постоянно проживающих в Республике Башкортостан. Группа пациентов (n=547) была сформирована из числа лиц, состоящих на учете в Республиканском центре рассеянного склероза (РЦРС). Диагноз РС устанавливался согласно критериям МакДональда (2017) [7]. Для оценки тяжести неврологического дефицита использовали шкалу инвалидизации EDSS (Expanded Disability Status Scale), для характеристики нарастания неврологического дефицита применяли показатель скорости прогрессирования, который рассчитывали как отношение степени инвалидизации по шкале EDSS в баллах к продолжительности заболевания в годах. Соотношение женщин и мужчин в группе пациентов с РС равнялось двум. Средний возраст пациентов с РС составил 40,46±9,98 года (медиана 41 год).

В контрольную группу вошли 1177 практически здоровых лиц, не страдавших нейродегенеративными и иными хроническими заболеваниями. Средний возраст представителей группы контроля был равен 37,76±10,88 года (медиана 38 лет). Принадлежность к той или иной этнической группе устанавливали по результатам анкетирования, которое включало вопросы об этнической принадлежности и месте рождения предков в трех поколениях.

ДНК выделяли из 8 мл цельной венозной крови с использованием стандартного фенольно-хлороформного метода. Генотипирование проводилось при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с использованием термоциклера T100^TM («BioRad», США). Подбор олигонуклеотидных праймеров осуществлялся с применением пакета программ DNAStar v. 5.05 и базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). Перечень анализируемых генетических вариантов, последовательности праймеров, рестриктазы, амплифицируемые фрагменты представлены в табл. 1. Полученные в результате амплификации и рестрикции фрагменты затем разделяли при помощи электрофореза в 2% агарозном геле и идентифицировали с помощью видеогельдокументирующей системы Mega-Bioprint 1100 («Vilber Lourmat», Франция).

Таблица 1. Номенклатура и хромосомная локализация исследуемых полиморфных локусов, последовательности праймеров, эндонуклеазы рестрикции, номенклатура аллелей и размеры амплифицируемых фрагментов

Примечание. По данным Консорциума референсного генома человека 37 сборки (GRCh37.p13, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.25/), ВК — внутренний контроль, 5’-UTR — 5’ нетранслируемый регион.

Работа выполнялась в соответствии с этическими принципами проведения медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта, закрепленными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2013). Все участники предоставили письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics v.21 и PLINK v1.07 [8]. Соответствие наблюдаемого распределения генотипов и аллелей исследуемых маркеров теоретически ожидаемому согласно закону Харди—Вайнберга проверяли при помощи теста Фишера. Ассоциации исследуемых полиморфных вариантов с РС анализировали методом логистической регрессии с применением аддитивной генетической модели, используя пол в качестве ковариаты. Аддитивная модель предполагает, что наличие двух копий аллеля, предрасполагающего к развитию заболевания, оказывает в 2 раза более выраженное влияние на фенотип, чем наличие одной копии. Метаанализ результатов исследования в двух этнических группах проводили с использованием модели со случайными эффектами и модели фиксированного эффекта. Относительный риск заболевания для носителей минорного аллеля вычисляли как показатель соотношения шансов (OR — odds ratio). Различия считали значимыми при p<0,05.

Клиническая характеристика группы пациентов с РС в зависимости от этнической принадлежности представлена в табл. 2. Средняя продолжительность заболевания в общей группе пациентов с РС на момент проведения исследования составляла 13,26±9,72 года (медиана 12 лет), показатель инвалидизации по шкале EDSS достигал 4,48±1,54 балла (от 1 до 8 баллов), скорость прогрессирования неврологического дефицита составила 0,71±0,99 балла/год (медиана 0,38 балла/год). В группе русских наиболее часто наблюдался вторично-прогрессирующий тип течения заболевания (52,9%), в группе татар преобладал ремиттирующий тип течения (43,7%).

Таблица 2. Клиническая характеристика пациентов с РС

Наблюдаемое распределение частот генотипов исследуемых полиморфных маркеров в контрольной группе как среди русских, так и среди татар соответствовало теоретически ожидаемому согласно закону Харди—Вайнберга (табл. 3, 4). Проведение анализа ассоциаций исследуемых генетических маркеров с РС в группе татар позволило выявить ассоциацию с заболеванием аллеля PVT1 rs759648*С (OR=1,42, 95%ДИ 1,05—1,92, p=0,023) (см. табл. 4). В группе русских ассоциаций исследуемых полиморфных маркеров с РС обнаружено не было. Метаанализ результатов исследования в двух этнических группах подтвердил наличие ассоциации с РС аллеля PVT1 rs759648*С (модель со случайными эффектами и модель фиксированного эффекта: OR=1,29, p=0,018) (табл. 5).

Таблица 3. Результаты анализа ассоциаций исследуемых полиморфных вариантов с РС в этнической группе русских

Примечание. Здесь и в табл. 4: n — численность, p — частота, P_HWE — уровень значимости для равновесия Харди—Вайнберга, OR — показатель соотношения шансов для минорного аллеля, 95% CI 95% доверительный интервал для показателя соотношения шансов, P — уровень значимости.

Таблица 4. Результаты анализа ассоциаций исследуемых полиморфных вариантов с РС в этнической группе татар

Таблица 5. Метаанализ результатов исследования в двух этнических группах

Примечание. А1 — минорный аллель, А2 — аллель «дикого типа», P (R) — уровень значимости для модели со случайными эффектами; P (F) — уровень значимости для модели фиксированного эффекта; OR (R) — показатель соотношения шансов для модели со случайными эффектами; OR (F) — показатель соотношения шансов для модели фиксированного эффекта. Показатель соотношения шансов рассчитывался для минорного аллеля. Жирным шрифтом выделены результаты, достигавшие уровня статистической значимости (p<0,05).

Мы провели репликативный анализ ассоциаций с РС полиморфных маркеров генов предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям, выявленных в ходе GWAS, в независимых выборках жителей Республики Башкортостан, русских и татар по этнической принадлежности. В результате выполненного исследования нам удалось подтвердить ассоциацию с РС полиморфного маркера PVT1 rs759648, для которого ранее была продемонстрирована ассоциация с РС в GWAS с участием 41 505 лиц европеоидного происхождения (14 802 пациентов с РС, 26 703 лиц контрольной группы) [9]. Полученные нами результаты согласуются с данными GWAS в отношении аллеля риска по этому полиморфизму, хотя наблюдаемый нами эффект для аллеля PVT1 rs759648*С несколько выше, чем тот, который был выявлен в GWAS (OR=1,08, 95%ДИ_OR 1,06—1,11, Р=5,05·10^–10 GWAS; OR=1,42, Р=0,023 в группе татар, OR=1,29, Р=0,018 метаанализ по двум этническим группам). Возможно, наблюдаемое снижение размера эффекта в GWAS обусловлено этнической гетерогенностью группы исследования, которая включала жителей 11 стран, в том числе Бельгии, Дании, Финляндии, Франции, Германии, Италии, Норвегии, Швеции, Великобритании, а также представителей белого населения Австралии, Новой Зеландии и Соединенных Штатов Америки [9].

Ранее было обнаружено, что полиморфизм rs759648 влияет на степень STAT1-фосфорилирования у пациентов с РС, получавших терапию интерфероном-бета-1b, что указывает на активацию провоспалительных механизмов [10]. Кроме того, выявлена ассоциация rs759648 с микроструктурными особенностями белого вещества головного мозга [11]. Полиморфный вариант rs759648 находится в локусе PVT1, в регионе, где расположены еще несколько ассоциированных с РС полиморфных вариантов, неравновесно сцепленных с данным маркером. В частности, полиморфизм rs1861842, для которого найдена ассоциация с РС у афроамериканцев (OR=1,30, 95%ДИ_OR 1,14—1,48, Р=8,5·10^–5), сцеплен с rs759648 у европейцев (r²=0,4), тогда как у лиц африканского происхождения сила наблюдаемого сцепления значительно снижена (r²=0,08) [12]. Это позволяет предположить, что оба генетических маркера являются tag-SNP (т.е. тесно сцеплены с рядом других полиморфных вариантов, благодаря чему наследуются с ними совместно) у европейцев и отражают наличие в этой области генома функционального полиморфизма, связанного с развитием заболевания. Помимо этого, rs759648 находится в неравновесном сцеплении (r²=0,6) с полиморфным вариантом rs2019960 в гене PVT1, для которого также обнаружена ассоциация с РС [13, 14].

Ген PVT1 картирован на длинном плече хромосомы 8 (8q24) и при помощи альтернативного сплайсинга участвует в образовании ряда длинных некодирующих РНК (днкРНК), а также шести микроРНК: miR-1204, miR-1205, miR-1206, miR-1207-5p, miR-1207-3p и miR-1208 (см. рисунок) [15, 16]. ДнкРНК представляют собой транскрипты длиной более 200 п.н., не несущие информации о структуре белка и предположительно играющие важную роль в регуляции транскрипции и процессинге матричной РНК (мРНК), хотя конкретная биологическая роль большинства днкРНК в настоящее время остается неясной [17].

Графическое изображение локуса PVT1.

МикроРНК — это малые некодирующие молекулы РНК (размером 20—22 п.н.), которые участвуют в регуляции активности генов, связываясь со специфическими нуклеотидными последовательностями в мРНК и влияя на такие процессы, как пролиферация и дифференцировка клеток и апоптоз. МикроРНК могут модулировать работу иммунной системы, оказывая влияние на активацию иммунокомпетентных клеток, секрецию цитокинов и развитие иммунологической толерантности [18].

Помимо PVT1, хромосомный регион 8q24 включает хорошо известный онкоген MYC, причем в опухолевых клетках обнаруживалась совместная амплификация этих генов [19]. Увеличение количества копий гена PVT1 отмечается при таких заболеваниях, как рак молочной железы, рак яичников, острый миелолейкоз, лимфогранулематоз, детская злокачественная астроцитома; тем не менее патофизиологические последствия нарушения регуляции локуса PVT1 до сих пор окончательно неясны [20]. Было обнаружено, что в нормальных клетках в отличие от опухолевых PVT1 выступает в качестве «ловушки», действуя как конкурентная эндогенная РНК и уменьшая количество микроРНК, доступной для связывания с мРНК [17]. Также продемонстрировано, что PVT1 индуцирует ангиогенез путем активации STAT3-VEGFA сигнального пути, приводя тем самым к увеличению проницаемости гематоэнцефалического барьера, в том числе для иммунокомпетентных клеток, что может способствовать развитию РС [21].

Нами не найдено ассоциации других исследуемых маркеров с РС (см. табл. 3, 4). Ранее в GWAS были выявлены ассоциации полиморфных вариантов IL2 rs2069762, FAS rs1800682, CLEC16A rs12708716 с РС, а также другими аутоиммунными заболеваниями, в том числе с сахарным диабетом 1-го типа, псориазом, болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом, анкилозирующим спондилитом, первичным склерозирующим холангитом [22—28]. Было также обнаружено, что аллель IL2 rs2069762*Т входит в состав сочетаний, ассоциированных с РС у башкир, проживающих в Республике Башкортостан [29]. Продемонстрировано, что этот аллель связан с пониженной продукцией ИЛ-2 [30, 31]. Кроме того, аллель IL2 rs2069762*Т сцеплен с аллелем IL2 rs2069772*G, входящим в состав комбинаций, ассоциированных с повышенным риском РС у башкир, русских и татар из Республики Башкортостан [32]. Возможно, отсутствие ассоциаций данных полиморфных вариантов с РС, наблюдаемое в нашем исследовании, связано с влиянием межгенных взаимодействий, для детекции которых требуется проведение полигенного анализа.

Нами обнаружена ассоциация полиморфизма PVT1 rs759648 с РС в группах русских и татар, проживающих в Республике Башкортостан. Полученные результаты, а также анализ данных литературы позволяют предположить, что участок генома, где расположен ген PVT1, является значимым для регуляции функционирования иммунной системы и развития воспаления в ЦНС. Необходимы дальнейшие исследования в этой области, чтобы прояснить роль гена PVT1 в патогенезе РС.

Финансирование.Исследование частично поддержано Российским фондом фундаментальных исследований (№17-44-020735р_а) и НИР №АААА-А16-116020350031-4; биологический материал (ДНК) для исследования взят из коллекции биологических материалов человека ИБГ УНЦ РАН, поддержанной программой биоресурсных коллекций ФАНО России; работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Биомика» и УНУ «КОДИНК» (ИБГ УФИЦ РАН).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.