Введение

Известно, что среди таких факторов риска развития глаукомной оптиконейропатии, как повышенное внутриглазное давление (ВГД), пожилой возраст и генетика, возраст является основным [1, 2]. В свете результатов исследования ряда авторов становится понятно, что глаукома патофизиологически связана со старением, что означает более высокий риск развития глаукомы с возрастом [3, 4]. Однако роль старения в патогенезе глаукомы и механизмы, лежащие в основе повышения уязвимости ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) к глаукомному повреждению по мере старения, остаются неясными. Такие структурные изменения, как утолщение трабекул радужно-роговичного угла, обусловленное аномальным накоплением коллагена типа IV, увеличение жесткости решетчатой пластинки склеры (РПС), уменьшение количества ГКС, снижение толщины слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) и сужение кровеносных сосудов, наблюдаются как в глазах с глаукомой, так и в стареющих глазах [5, 6].

Имеются существенные доказательства того, что состояние соединительной ткани глаза и ее реакция на повышенное ВГД у пациентов с глаукомой влияют на степень поражения заболеванием, а также имеют важное диагностическое и прогностическое значение. В частности, именно особенности строения склеры делают зрительный нерв (ЗН) и ГКС восприимчивыми к повреждению при повышении уровня ВГД. Установлено, что деформация соединительной ткани играет центральную роль в опосредованном в связи с компрессией повреждении аксонов ЗН и аксонального транспорта, астроцитов и кровеносных сосудов диска зрительного нерва (ДЗН). Согласно результатам исследований ряда авторов, в патогенезе глаукомы происходят деформации соединительной ткани перипапиллярной склеры, стенки склерального канала и РПС под влиянием повышенного уровня ВГД. Эффект высокого ВГД по отношению к соединительной ткани с течением времени похож на возрастные изменения, происходящие по мере старения, что, в свою очередь, может вызывать постоянное ремоделирование под влиянием нагрузки внеклеточного матрикса склеры и приводит к различиям в его прочности у разных людей [7, 8].

Большая подверженность первичной открытоугольной глаукоме (ПОУГ) глаз с миопией с удлинением переднезадней оси глаза обусловлена более тонкой склерой, способность которой выдерживать напряжение ВГД ослаблена [9, 10]. Таким образом, истончение склеры и ее деформация в перипапиллярной зоне делают ее более податливой в ответ на воздействие стрессовых, повреждающих факторов [11, 12].

Патогенез, лежащий в основе повреждения аксонов ЗН в области прохождения их через РПС, до сих пор плохо изучен. Известно, что, несмотря на доказанную роль повышенного ВГД в патогенезе глаукомной оптиконейропатии, у значительного числа пациентов с нормальным ВГД также развивается глаукомное поражение ЗН. Значительное снижение ВГД при глаукоме высокого давления тоже не гарантирует замедления прогрессирования заболевания. Прогрессирующая гибель аксонов ЗН, наблюдаемая даже после устранения повреждающего фактора, например, в случаях нормализации ВГД при глаукоме, диктует необходимость поиска новых биомаркеров в диагностике и оценке эффективности лечения [13—16]. Растет интерес к перспективным методам лечения, направленным на механизмы старения в связи с глаукомой. Представляется актуальным разработать методы лечения глаукомы, направленные на изменение восприимчивости склеры к повреждению путем ее ремоделирования, в частности, на изменение исходного состояния склеры, для того чтобы ее механическая реакция на повышение уровня ВГД была более благоприятной. Согласно данным литературы, с одной стороны, глаза с механическими реакциями, которые можно отнести к категории «жестких», могут быть менее восприимчивыми к глаукоматозным повреждениям. Однако с другой стороны, методы лечения, основанные на «сшивании» коллагеновых волокон склеры и увеличении ее жесткости, могут неблагоприятно повлиять на основные глазные кровеносные сосуды, которые проходят сквозь склеру, а также на экстраокулярные мышцы, вызывая их компрессию. Не исключено, что благоприятное воздействие на склеру может быть достигнуто не за счет увеличения ее жесткости, а за счет создания менее жесткой и более эластичной структуры. Безусловно, с точки зрения разработки нового терапевтического подхода к глаукоме путем изменения склеры важно оценить ее исходное состояние [17—19].

Вторым после соединительной ткани важным аспектом, который связан с характерным повреждением аксонов ЗН в глазах с глаукомой, являются белки цитоскелета, в частности, нейрофиламенты (НФ), играющие решающую роль в поддержании целостности аксонов ЗН, структуры, жизнеспособности и функции ГКС. В ЗН существенным фактором, влияющим на жесткость ткани, являются организация и состояние цитоскелета аксонов. Распределение белков цитоскелета ЗН предопределяет скорость аксонального тока и дает ценную информацию о тех участках аксонов, которые наиболее уязвимы в случае повреждения. Хотя известно, что изменения цитоскелета происходят при множестве заболеваний ЗН, до сих пор не было проведено детального исследования нейронального цитоскелета ЗН человека в норме в возрастном аспекте [20, 21]. В связи с вышеизложенным актуальным представляется изучение ультраструктурных изменений в РПС, которые предшествуют функциональным дефицитам в аксонах ЗН.

Цель исследования — изучить морфологические особенности РПС с точки зрения их потенциальной роли в повреждении аксонов ЗН.

Материал и методы

В исследование включено 39 ЗН 24 человек (16 мужчин и 8 женщин, 19 правых глаз, 20 левых глаз) в возрасте от 27 до 81 года. Деление на возрастные группы выполнено согласно классификации ВОЗ: 1-я группа молодого возраста (22—44 года (36,18±5,17) — 11 ЗН), 2-я группа среднего возраста (45—59 лет (54,36±5,01) — 11 ЗН), 3-я группа пожилого возраста (60—74 года (63,8±4,15) — 9 ЗН) и 4-я — старческого возраста (75—89 лет (79,0±2,31) — 8 ЗН). Материал для исследования был получен из цельных глазных яблок умерших доноров, которые были энуклеированы сотрудниками отделения «Тканевые биотрансплантаты» ГУ «Минский научно-практический центр хирургии, трансплантологии и гематологии» и использованы для трансплантации роговицы, и из УЗ «Городское клиническое патолого-анатомическое бюро» в соответствии с Законом РБ «О трансплантации органов и тканей человека» № 199-З от 18.06.2019 года и постановлением Министерства здравоохранения РБ №2 от 4.01.2010 года «Об утверждении инструкции о порядке забора органов у умершего донора». Исследование проведено в рамках договора о научном сотрудничестве между этими учреждениями и УО «БГМУ», одобрено этическим комитетом по исследованиям на людях — Комитетом по биоэтике УО «БГМУ». Все человеческие ткани обрабатывались в соответствии с принципами Хельсинкской декларации (2024).

Фрагменты заднего полюса глазного яблока, каждый из которых включал внутриглазную часть ЗН, были выделены с помощью трепана (М 450, диаметр 10,5 мм, ООО «Медин-урал», 2021), фиксированы в растворе 1% глутаральдегида и 4% параформальдегида в 0,1% фосфатном буфере при 4 °C, обезвожены в серии этанолов и заключены в парафиновые блоки, из которых получены гистологические срезы, выполненные продольно оси ЗН. Срезы окрашены методом трихром по Массону и оценены с помощью световой микроскопии и автоматизированного анализа изображения программы Bioscan AT+. Также нами было выполнено иммуногистохимическое исследование структуры нейрофиламентов (НФ) в аксонах ЗН с помощью антитела Neurofilament (NE-14, BioGenex Laboratories, Inc., США). С помощью программы ImageJ 1.54i нами была оценена интенсивность экспрессии на изображениях с одинаковым увеличением (10 раз) по проценту площади позитивно окрашенных пикселей на заданной площади 10 изображений в каждом случае. Статистическая обработка данных проведена с использованием статистических пакетов Statistica 10,0 for Windows, расчетом коэффициентов корреляции Пирсона, Спирмена. При сравнении групп применяли критерий Краскела—Уоллиса, Манна—Уитни, τ-Кэндалла.

Результаты и обсуждение

В результате исследования нами установлено, что соотношение коллагенового, эластинового и нейрального компонентов в составе РПС коррелировало с возрастом (χ²=21,09, p=0,0018). РПС представляла собой многослойную структуру и состояла из соединительной ткани, образованной коллагеном различного типа и эластином, а также глиальных элементов (астроциты, микроглия) и капилляров. Слои (от 3 до 10) трабекул плотной соединительной ткани РПС были расположены преимущественно перпендикулярно оси ЗН, что обусловливало трансламинарное напряжение в ДЗН [22]. Нами выявлены статистически достоверные различия в соотношении глиального и соединительно-тканного компонентов РПС в исследуемых группах. На основе анализа изображений участка продольного среза ЗН, соответствующего РПС, с помощью программного комплекса Bioscan AT+ определяли содержание того или иного компонента относительно площади, занимаемой РПС на срезе. Основным критерием выбора типа РПС считали содержание коллагена относительно других компонентов в ее составе. На основании различий в степени выраженности соединительно-тканного и глиального компонентов и их соотношения в составе РПС нами были выделены 3 паттерна РПС: смешанный, эластический и коллагеновый.

Смешанный тип строения РПС характеризовался равномерным распределением соединительно-тканного компонента с присутствием в его составе коллагеновых и эластических волокон в пределах соотношений от 50:25% до 25:50%, а также умеренным количеством глии (рис. 1). Такой вариант строения РПС встречался в большем по сравнению с другими проценте случаев во всех возрастных группах (в 1-й группе — в 54,55%, во 2-й — в 100%, в 3-й — в 60% и в 4-й — в 50% случаев).

Рис. 1. Внутриглазная часть зрительного нерва. Сагиттальные срезы через решетчатую пластинку склеры смешанного типа.

Здесь и на рис. 2—4: окраска трихром по Массону. Ув. 10 (а, б), ув. 40 (в, г).

Здесь и на рис. 2, 3: 1 — РПС; 2 — эластические волокна; 3 — коллагеновые волокна; 4 — аксоны ЗН.

Нами установлено, что эластический тип строения РПС, характеризующийся минимальным содержанием коллагеновых волокон, менее 25% площади РПС, которая в основном состояла из эластических волокон и глиальных элементов, — преимущественно наблюдался в 1-й группе в возрасте до 44 лет (в 45,5% случаев), в то время как в остальных группах в составе РПС эластические волокна были менее выражены либо отсутствовали (рис. 2).

Рис. 2. Внутриглазная часть зрительного нерва. Сагиттальный срез через решетчатую пластинку склеры эластического типа.

Ув. 10 (а), ув. 40 (б), ув.100 (в).

Коллагеновый тип РПС, характеризующийся преобладанием коллагеновых волокон, составляющих более 75% площади РПС на срезе, и минимальным содержанием эластических волокон и глии (рис. 3), встречался в 3-й группе у доноров в возрасте старше 60 лет в 40% и в 4-й группе — в 50% случаев. Нами установлено, что изменение и преобразование периваскулярной соединительной ткани, окружающей центральные сосуды сетчатки, с возрастом сопровождалось разрастанием коллагеновых волокон: последнее в 1-й и 2-й группах нами отмечено в 18,18%, в 3-й группе — в 20,00%, в 4-й — в 25,0% случаев (τ = -0,308, p<0,05). Следует отметить, что в первую очередь при переходе из 1-й группы во 2-ю и 3-ю происходило изменение эластических волокон в ДЗН: эластические волокна теряли связи с остальными компонентами склеры, постепенно исчезали, тогда как коллагеновые волокна, их диаметр и ориентация изменялись позже. Полученные результаты согласуются с данными литературы [23, 24]. В результате сравнения склеры в норме и при глаукоме авторами установлено, что как в процессе естественного старения, так и в глазах с глаукомой изменяются структура и механические свойства коллагенсодержащих структур, в частности увеличиваются диаметр коллагеновых фибрилл и их жесткость. С другой стороны, ряд авторов описывают подобные изменения как отличительные морфологические признаки глаз с глаукомой, отличающихся от возрастной нормы [25—28].

Рис. 3. Внутриглазная часть зрительного нерва. Сагиттальный срез через решетчатую пластинку склеры коллагенового типа.

Ув. 10 (а), ув.40 (б).

Наряду с вышеизложенным нами было выявлено изменение рельефа передней (обращенной в сторону глазного яблока) поверхности РПС, которое коррелировало с усилением коллагеновых волокон, окружающих центральные сосуды сетчатки (τ =-0,427, p<0,05). Передняя поверхность РПС в 1-й и 2-й возрастных группах во всех случаях имела форму дугообразной линии, изгиб которой был обращен кзади, в сторону ретроламинарной части ЗН. В последующие возрастные периоды она постепенно приобретала более плоский рельеф и имела форму прямой линии (в 20% случаев в 3-й группе и в 25% случаев — в 4-й), затем в связи с дальнейшими возрастными преобразованиями деформировалась и в форме дугообразной линии проминировала кпереди в 25% глаз пациентов старше 75 лет. Мы считаем, что деформация рельефа РПС, наряду с увеличением выраженности периваскулярных коллагеновых волокон, обусловливала снижение эластичности РПС и, следовательно, — недостаточный ответ на воздействие повреждающего фактора, например повышенного ВГД у лиц пожилого и старческого возраста.

Полученные нами данные согласуются с результатами исследования других авторов, которые отмечали ряд структурных и биохимических возрастных преобразований РПС, обусловивших впоследствии изменения ЗН в глазах с глаукомой [29, 30]. Авторы отметили, что с возрастом увеличивается количество коллагена I, II и III типов, изменяется состав межклеточного матрикса, а также функциональная активность астроцитов, что в совокупности приводит к уменьшению эластичности РПС и увеличению ее жесткости [31].

В результате исследования ЗН нами выявлено, что ход аксонов внутриглазной части ЗН различался во всех возрастных группах: в некоторых случаях он был прямым, в других — наблюдалась девиация аксонов в центральных отделах РПС и/или на ее периферии. Девиация оценивалась визуально как изменение направления хода аксонов ЗН при их прохождении из преламинарной части в отверстия РПС. Нами определено, что с возрастом девиация аксонов ЗН в месте прохождения их через РПС встречалась чаще как в периферических отделах РПС (в 40% случаев в 3-й группе), так и в центре, а также на периферии РПС (в 4-й группе — в 50%). Отклонение хода волокон через РПС может явиться причиной их большей повреждаемости при повышении уровня ВГД в результате компрессии аксонов ганглиозных клеток и нарушения аксоплазматического транспорта [32]. Тенденция к усилению отклонения хода аксонов ЗН от прямого при прохождении их через РПС коррелировала с такими факторами риска, как преобладание коллагена в составе РПС (τ=–0,308, p<0,05), превалирование числа пор в задних отделах РПС по сравнению с ее передними отделами (τ=0,456, p<0,05), уменьшение слоев трабекул в РПС (до 5) (τ=0,346, p<0,05), сниженное содержания и разреженность глии в преламинарной зоне ЗН (τ=0,287, p<0,05), а также вариабельность диаметров пучков аксонов ЗН (τ=0,463, p<0,05) (рис. 4).

Рис. 4. Изменение хода аксонов зрительного нерва. Сагиттальный срез через решетчатую пластинку склеры.

Ув. 40 ( а), ув.10 ( б); 1 — РПС, 2 — аксоны ЗН.

В результате изучения распределения НФ в аксональном цитоскелете внутриглазной части ЗН человека (преламинарной (PL), ламинарной (LC) и постламинарной (PoL) зонах) нами установлено, что экспрессия НФ, которая отражает аксоплазматический ток, коррелировала с соотношением эластического, коллагенового и глиального компонентов в составе РПС и варьировала в РПС разного паттерна (см. таблицу). Чем более интенсивной была экспрессия НФ, тем медленнее был аксоплазматический ток.

Интенсивность (в %) экспрессии НФ аксонов ЗН в зависимости от типа РПС

Примечание. Достоверность различий в группах <0,05.

Экспрессия НФ была наименьшей во всех возрастных группах в преламинарной, ламинарной и постламинарной частях ЗН (42,4; 39,18 и 35,61% соответственно) при смешанном типе РПС, в составе которой эластические, коллагеновые волокна и глия распределены равномерно (рис. 5). Достоверное увеличение экспрессии НФ наблюдалось при эластическом типе РПС у 45,5% людей в возрасте до 44 лет в преламинарной части РПС (51,54%) по сравнению с ламинарной (46,87%) и постламинарной частями ЗН (44,15%) (рис. 6). Мы считаем, что увеличение экспрессии НФ в РПС эластического типа отражало обусловленную отсутствием миелина компенсаторную потребность в поддержке аксонов ЗН в ответ на воздействие повреждающих факторов.

Рис. 5. Экспрессия нейрофиламентов в аксонах зрительного нерва со смешанным типом решетчатой пластинки склеры.

ИГХ с антителом NE-14.

Здесь и на рис. 6, 7: Ув. 10. PL — преламинарная часть ЗН, LC — lamina cribrosa (решетчатая пластинка склеры), Pol — постламинарная часть ЗН.

Рис. 6. Экспрессия нейрофиламентов в аксонах зрительного нерва с эластическим типом решетчатой пластинки склеры.

В результате сравнения трех паттернов РПС нами установлено, что экспрессия НФ была достоверно более выражена в преламинарной, ламинарной и постламинарной частях ЗН (63,95; 72,35 и 60,02% соответственно) в возрастной группе старше 60 лет с коллагеновым типом РПС (рис. 7). С нашей точки зрения, преобладание коллагена в составе РПС и усиление в связи с этим ее жесткости, наряду с увеличением экспрессии НФ, следует считать фактором риска блокады аксонального тока.

Рис. 7. Экспрессия нейрофиламентов в аксонах зрительного нерва с коллагеновым типом решетчатой пластинки склеры.

В литературе приведены различные точки зрения авторов относительно увеличения жесткости склеры под влиянием повышенного ВГД у пациентов с ПОУГ [33, 34]. Согласно одной из гипотез, жесткость является защитной реакцией, так как склера, чья «податливость» увеличена, становится более уязвимой к повышенному ВГД и потере ГКС. Альтернативная точка зрения заключается в том, что глаза более восприимчивы к глаукоме, когда они жесткие и становятся еще более жесткими в результате заболевания. Жесткий участок склеры по периметру ЗН потенциально может усиливать градиент трансламинарного давления по обе стороны от РПС, что обоснованно делает глаз менее устойчивым к повышению ВГД. Тем не менее, приносит ли увеличение жесткости склеры в целом пользу или вред остается предметом дискуссий [35, 36].

Обращает на себя внимание тот факт, что во всех случаях нами выявлено равномерное снижение экспрессии НФ в постламинарной части ЗН по сравнению с преламинарной и областью РПС (рис. 8). Известно, что аксоны ГКС не покрыты миелином в преламинарной и ламинарной областях и становятся миелинизированными в постламинарной части. Таким образом, олигодендроциты, обеспечивая аксоны миелиновой оболочкой в постламинарной части ЗН, увеличивают скорость аксонального тока в этой области. Миелинизация аксонов улучшает биомеханические свойства ЗН, модулирует метаболическую активность и уменьшает вероятность повреждения аксонов ЗН. Более высокая концентрация белков НФ цитоскелета в преламинарной части ЗН, возможно, отражает потребность в усилении «каркаса» для механической поддержки аксонов ЗН.

Рис. 8. Экспрессия нейрофиламентов (в пикселях) в зависимости от типа решетчатой пластинки склеры.

1 — эластический, 2 — смешанный, 3 — коллагеновый.

Заключение

На основании различий в степени выраженности соединительно-тканного и глиального компонентов и их соотношения в составе РПС нами выделены 3 паттерна РПС: смешанный, эластический и коллагеновый. Смешанный вариант строения РПС встречался в большинстве случаев во всех возрастных группах, эластический наблюдался преимущественно в молодом возрасте до 44 лет, коллагеновый тип преобладал в возрасте старше 60 лет.

Отмеченное нами ремоделирование РПС через преобладание коллагеновой ткани в ее составе преимущественно периваскулярно наряду с деформацией передней поверхности РПС в возрасте старше 60 лет и с тенденцией к усилению девиации проходящих через РПС аксонов ЗН следует рассматривать как возможные факторы риска повреждения аксонов ЗН, ишемии и/или блокады аксонального тока. Данные факторы риска могут обусловливать прогрессирование повреждения ЗН после прекращения воздействия повреждающего фактора, в частности, после нормализации уровня ВГД у пациентов с глаукомой, что следует учитывать при прогнозировании результатов лечения оптиконейропатий.

Нами установлено, что экспрессия НФ коррелировала с соотношением эластического, коллагенового и глиального компонентов в составе РПС и была вариабельной в разных типах РПС: была наименьшей при смешанном типе РПС, достоверно увеличивалась в РПС эластического типа и была наиболее выражена в возрастной группе старше 60 лет с коллагеновым типом РПС. Определенная нами гетерогенность распределения НФ в аксонах ЗН в различных возрастных группах отражает структурно-функциональную неоднородность ЗН, а также может служить объяснением асимметричного характера повреждения ЗН, в частности в ответ на повышение уровня ВГД. В результате исследования распределения НФ нами выявлены аксональные области ЗН, которые наиболее уязвимы к повреждению. Полученные нами данные о преобразованиях цитоскелета НФ, которые предшествовали изменениям в аксональном транспорте, могут быть использованы в качестве раннего маркера повреждения ГКС под влиянием повышенного уровня ВГД или других повреждающих факторов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Гусева Ю.А., Позняк Н.И.

Сбор и обработка материала: Гусева Ю.А.

Статистический анализ: Гусева Ю.А.

Написание текста: Гусева Ю.А., Позняк Н.И.

Редактирование: Позняк Н.И., Гусева Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.