Введение
Оценка микрофлоры при физиологически протекающей доношенной беременности является важным аспектом в исследовании нормальной микрофлоры человека и становлении микробиома новорожденного, являясь впоследствии отправной точкой в изучении различных осложнений гестации.
В последние несколько лет после ряда публикаций, посвященных микробиому человека (The Human Microbiome Project — HMP) [1, 2], произошла смена парадигмы о безусловной стерильности плодных оболочек, плаценты и околоплодных вод при физиологически протекающей беременности. Было доказано, что полость матки, плацента, плод и околоплодные воды могут быть нестерильными и обладают своей уникальной микробиотой, которая участвует в формировании иммунной системы плода задолго до родов [3—8]. Изучению вагинального микробиома при физиологической и осложненной беременности посвящено множество работ [2—8], но остается открытым вопрос о корреляции его с микробиотой фетоплацентарного комплекса.
Цель исследования — анализ микробного пейзажа цервикального канала, околоплодных вод, плодных оболочек и плаценты при физиологически протекающей доношенной беременности культурально-независимым методом.
Материал и методы
В проспективное исследование включены 19 беременных с физиологическим течением гестации в сроке 37—41 нед с интактными плодными оболочками, которые были родоразрешены путем элективного1 кесарева сечения на базе родильных отделений ГБУЗ «Самарская городская клиническая больница №1 им. Н.И. Пирогова». Показаниями к кесареву сечению были неправильное положение и предлежание плода, рубец на матке после предшествующего кесарева сечения. Исследование микробиоты выполнялось из четырех локусов: цервикального канала непосредственно перед кесаревым сечением, околоплодных вод, плодных оболочек и плаценты интраоперационно методом полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени — ПЦР-РВ («Фемофлор-16») и применением детектирующего амплификатора ДТ-96 производства ООО «НПО ДНК-Технология» (РУ ФСР 2009/04663, патент №2362808 от 13.02.08) [9—12]. Выявляли следующие микроорганизмы: Lactobacillus spp., семейство Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida spp., Mycoplasma genitalis.
Во всех случаях качество взятия материала было адекватным (количество ДНК клеток пациентки — более 104 Гэ в образце). После амплификации автоматически устанавливали количество общей бактериальной массы, определенное лабораторией (ОБМл). Суммарное количество микроорганизмов для каждой пациентки мы обозначили как расчетное ОБМ (ОБМр).
Количественная характеристика выявленных микроорганизмов приводилась как в абсолютном количестве геном-эквивалентов (Гэ) микроорганизмов в образце (в виде десятичного логарифма — lg), так и в относительных по отношению к ОБМр (в процентах). Кроме того, данные представлены в виде частоты выявления каждого идентифицированного микроорганизма.
Мазки из цервикального канала брались по стандартной методике непосредственно перед родоразрешением. Амниотическую жидкость брали интраоперационно при вскрытии матки и плодного пузыря с применением специального разработанного устройства для сбора околоплодных вод [13], препятствующего загрязнению материала во время операции. Околоплодные воды подвергали центрифугированию в течение 15 мин со скоростью 2000 g, удаляли супернатант, осадок переносили в пробирку 1,5 мл «эппендорф» с транспортной средой («Проба-Рапид» производства ООО «НПО ДНК-Технология») пипеткой. Образцы плаценты и плодных оболочек брали в стерильных условиях во время кесарева сечения, в пределах операционного поля. Забор плаценты выполнялся посередине расстояния от места прикрепления пуповины до наиболее отдаленной точки края плаценты с помощью конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм, отсекали стандартный образец ткани плаценты с захватом участка из ее глубины (с предварительным отсечением амниона, хорионической пластинки и децидуальной ткани с материнской стороны). Образцы плодных оболочек брали посередине между плацентой и внутренним зевом с помощью стерильного конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм, отсекали стандартный образец плодных оболочек. Полученные образцы также помещали в «эппендорфы».
Возможность проведения исследования была одобрена на заседании комитета по биоэтике (протокол №207 от 20.05.20), пациентки дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Статистический анализ. Обработку полученных данных исследования проводили с помощью программы Statistica 10.0, SPSS 13. Для описания количественных данных использованы среднее (M) со стандартным отклонением (SD) при соответствии нормальному распределению, при несоответствии — медиана (Me), а в качестве интервальной оценки — верхний (Q1) и нижний (Q3) квартили. Несоответствие нормальному распределению определено методом Шапиро—Уилка. Сравнение количественных переменных в локусах выполнено с применением непараметрического критерия Краскела—Уолиса, при выявлении значимых различий попарное сравнение выполняли с помощью критерия Манна—Уитни. Признаки, относившиеся к бинарным качественным переменным по типу есть/нет, приведены в виде абсолютных частот и процентов. Анализ качественных признаков проводили с помощью таблиц сопряженности, с применением критерия χ2 либо двустороннего критерия Фишера. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.
Результаты
Средний возраст обследованных составил 31,0±5,3 года, 12 из 19пациенток в исследовании было повторнородящих, на каждую женщину в среднем приходилось 2,47±1,71 беременности. Средний срок гестации составил 39,3±0,65 нед. Результаты анализа ПЦР-РВ образцов цервикального канала представлены в таблице.
Распределение микроорганизмов в цервикальном канале и фетоплацентарном комплексе, Гэ в образце
| Параметр | Показатель | Цервикальный канал 1 | Околоплодные воды 2 | Плодные оболочки 3 | Плацента 4 | Критерий |
| Общая бактериальная масса лабораторная | n | 19 | 10 | 14 | 15 | χ2=11,9; p=0,008 |
| Me [Q1; Q3] | 7,5 [7,0; 8,1] | 3,02 [0; 3,4] | 3,2 [0; 3,3] | 3,3 [3,1; 3,5] | H2=45,92; p=0,000 | |
| Общая бактериальная масса расчетная | n | 19 | 6 | 6 | 5 | χ2=28,3; p=0,000 |
| Me [Q1; Q3] | 7,5 [7,0; 8,1] | 2,83 [0; 3,1] | 0 [0; 3,2] | 0 [0; 3,1] | H2=49,42; p=0,000 | |
| Lactobacillus spp. | n | 19 | 1 | — | — | χ2=28,3; p=0,000 |
| Me [Q1; Q3] | 7,6 [7,1; 8,2] | 2,02 | — | — | — | |
| Семейство Enterobacteriaceae | n | 8 | 4 | 5 | 5 | χ2=2,3; p=0,512 |
| Me [Q1; Q3] | 3,3 [3,1; 3,6] | 2,59 [2,5; 3,4] | 3,3 [3,3; 3,4] | 3,2 [3,1; 3,2] | H=4,20; p=0,242 | |
| Streptococcus spp. | n | 4 | — | — | — | χ2=2,51; p=0,110 |
| Me [Q1; Q3] | 4,0 [3,7; 4,7] | — | — | — | — | |
| Staphylococcus spp. | n | 15 | 1 | — | — | χ2=20,6; p=0,000 |
| Me [Q1; Q3] | 3,4 [3,3; 3,9] | 1,72 | — | — | — | |
| Gardnerella vaginalis+Prevotella bivia+Porphyromonas spp. | n | 13 | — | — | — | χ2=16,84; p=0,000 |
| Me [Q1; Q3] | 4,2 [3,2; 5,2] | — | — | — | — | |
| Eubacterium spp. | n | 11 | — | — | — | χ2=12,8; p=0,000 |
| Me [Q1; Q3] | 4,4 [4,2; 6,4] | — | — | — | — | |
| Sneathia spp.+Leptotrichia spp.+Fusobacterium spp. | n | 2 | — | — | — | χ2=0,53; p=0,467 |
| Me [Q1; Q3] | 4,0 [3,3; 4,7] | — | — | — | — | |
| Megasphaera spp.+Veillonella spp.+ Dialister spp. | n | 8 | — | — | — | χ2=7,76; p=0,005 |
| Me [Q1; Q3] | 3,9 [3,3; 4,7] | — | — | — | — | |
| Lachnobacterium spp.+ Clostridium spp. | n | 4 | — | — | — | χ2=2,51; p=0,112 |
| Me [Q1; Q3] | 4,7 [4,2; 5,3] | — | — | — | — | |
| Mobiluncus spp.+Corynebacterium spp | n | 10 | 2 | — | — | χ2=5,97; p=0,015 |
| Me [Q1; Q3] | 4,1 [3,4; 4,6] | 2,1 | — | — | Z=3,05; p=0,002 | |
| Peptostreptococcus spp. | n | 6 | — | — | — | χ2=4,95; p=0,026 |
| Me [Q1; Q3] | 3,3 [3,2; 4,2] | — | — | — | — | |
| Atopobium vaginae | n | 5 | 1 | — | — | χ2=1,78; p=0,182 |
| Me [Q1; Q3] | 2,1 [2,1; 2,8] | 0,7 | — | — | — | |
| Candida spp. | n | 3 | — | 1 | — | χ2=0,28; p=0,597 |
| Me [Q1; Q3] | 4,2 [3,3; 5,0] | — | 1,82 | — | — | |
| Mycoplasma hominis | n | — | — | — | — | — |
| Me [Q1; Q3] | — | — | — | — | — | |
| Ureaplasma (urealyticum + parvum) | n | 6 | — | — | — | χ2=4,95; p=0,026 |
| Me [Q1; Q3] | 4,2 [3,8; 4,6] | — | — | — | — | |
| Mycoplasma genitalium | n | — | — | — | — | — |
| Me [Q1; Q3] | — | — | — | — | — |
Примечание. Критерий χ2 — межгрупповые сравнения по частоте выявления микроорганизмов; критерий Краскела—Уоллиса (H) — межгрупповые отличия для количественных показателей, критерий Манна—Уитни (Z) — попарное сравнение количественных показателей. Дальнейшие сравнения показали p>0,05 при сравнении цервикального канала с другими локусами.
Методика Фемофлор-16, исходно разработанная для диагностики дисбиоза влагалища [10, 11], хорошо себя зарекомендовала в качестве диагностического компонента микробиоты цервикального канала [12, 13]. ОБМл и ОБМр цервикального канала совпали у всех пациенток. При физиологически протекающей доношенной беременности в цервикальном канале преобладали Lactobacillus spp. в высоком титре — 107,6 [107,1; 108,2] ГЭ в образце по сравнению с другими локусами. В процентном отношении в общем пуле микроорганизмов количество Lactobacillus spp. превышало 90% и в среднем составляло 92% (рисунок на цв. вклейке). В околоплодных водах Lactobacillus spp. выявлены только в одном случае, что мы склонны связывать со случайными факторами (возможно, субклиническое нарушение целостности плодного пузыря). На плаценте и плодных оболочках Lactobacillus spp. не наблюдались.
Относительная частота выявления различных микроорганизмов методом ПЦР-РВ из цервикального канала (cc), околоплодных вод (af), плодных оболочек (fm) и плаценты (p) при доношенной беременности и интактном плодном пузыре.
На втором месте по частоте выявления в цервикальном канале были Staphylococcus spp. — в 15 из 19 наблюдений. У 13 из 19 пациенток в цервикальном канале определялись Gardnerella vaginalis+Prevotella bivia+Porphyromonas spp., но в низком титре и относительное их содержание в общем пуле микроорганизмов составило 3,26% (см. рисунок на цв. вклейке). Столь высокая частота выявления Gardnerella vaginalis+Prevotella bivia+Porphyromonas spp. свидетельствует в пользу того, что не все виды этих микроорганизмов являются маркерами дисбиоза [6], данные микроорганизмы могут обитать в цервикальном канале и в норме, но в низких титрах, на фоне абсолютного доминирования Lactobacillus spp. Представители факультативной анаэробной и условно-анаэробной микрофлоры, грибы Candida spp. и Ureaplasma (urealyticum + parvum) в цервикальном канале идентифицировались часто, но при расчете относительного процентного содержания на их долю приходилось в среднем 8% от всего состава микробиоты цервикального канала.
Общая бактериальная масса, определенная лабораторией (ОБМл) в околоплодных водах выявлена у 10 из 19 пациенток, в количестве 103,02 Гэ в образце, на плодных оболочках — у 14 из 19 в количестве 103,2 Гэ в образце и в плаценте — у 15 из 19 пациенток в количестве 103,3 Гэ в образце. Неидентифицируемая панелью «Фемофлор-16» ДНК микроорганизмов определялась в плаценте у 15 из 19 пациенток, в плодных оболочках — у 9 из 19 и околоплодных водах — в 11 из 19 наблюдений. Среди идентифицированных микробов лидирующими были представители семейства Enterobacteriaceae, которые определялись во всех исследуемых нишах: в околоплодных водах они были выявлены у 4 из 19 пациенток, в плодных оболочках и плаценте — у 5 из 19, в цервикальном канале — у 8 из 19. По абсолютному количеству и распространенности различия этих микроорганизмов у обследованных пациенток были статистически незначимы (p=0,242 и p=0,512 соответственно). В околоплодных водах в единичных наблюдениях были выявлены следующие микроорганизмы: Staphylococcus spp., Mobiluncus spp.+Corynebacterium spp., Atopobium vaginae (см. рисунок на цв. вклейке).
Обсуждение
Нормальная микрофлора влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста содержит грамположительные и грамотрицательные аэробные, факультативно-анаэробные и облигатно-анаэробные микроорганизмы, при этом 95—98% всех микроорганизмов представлено Lactobacillus spp. [12]. К нормальной микрофлоре относятся также Mycoplasma hominis в титре менее 104 КОЕ/мл, грибы рода Candida в титре менее 103 КОЕ/мл [14]. Применение методики ПЦР-РВ перспективно в плане исследования биотопа не только влагалища, но и цервикального канала [9, 11, 12], что подтвердило и наше исследование. В норме в III триместре беременности микрофлора цервикального канала отличается большим разнообразием и бактериальной массой, с преобладанием Lactobacillus spp. (в нашем исследовании в среднем 92% от всей имеющейся микрофлоры) и отсутствием патогенной микрофлоры, например Mycoplasma genitalium. В нашем исследовании Mycoplasma genitalium не выявлена, Mycoplasma hominis также отсутствовала.
Согласно результатам нашего исследования различные виды Staphylococcus spp. наблюдались у 15 из 19 пациенток в цервикальном канале в небольшом количестве — 103,4 [103,3; 103,9] Гэ в образце. По данным литературы [9, 11, 12], Staphylococcus spp. являются наиболее распространенными представителями биотопа цервикального канала, встречаются на всем протяжении желудочно-кишечного тракта и относятся к нормальной микрофлоре.
Считается нормобиоценозом влагалища выявление остальных представителей его микробиоты в количестве менее 20% (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum), Candida spp., Mycoplasma henitalium) [9, 11, 12], в нашем исследовании в цервикальном канале их распространенность не превышала 8%.
Что касается других локусов, то благодаря генетической идентификации ДНК было установлено, что плацента в норме обладает своей уникальной микробиотой, напоминающей микробиоту полости рта в большей степени, чем урогенитального тракта [15—18]. Однако ряд других исследований подвергает сомнению существование плацентарной микробиоты, так как бактериальные колонии, взятые из тканей плаценты, имеют низкую биомассу и, вероятно, могут быть результатом загрязнения [11, 19, 20]. В своем исследовании мы продемонстрировали, что наличие микробной ДНК может идентифицироваться как в околоплодных водах — 10 из 19 наблюдений, так и на плодных оболочках — 14 из 19 и плаценте — 15 из 19. Эта ДНК не совпадала с микробной ДНК цервикального канала, исключением служили представители семейства Enterobacteriaceae, которые выявлялись в одинаковом количестве у ряда пациенток в изучаемых локусах. По нашему мнению, микробиота фетоплацентарного комплекса независима от микробиоты цервикального канала.
Действительно, если в более ранних исследованиях, использующих культуральные методики, речь шла о преобладании Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. (обитателях нормальной кишечной микрофлоры) в биоптатах плаценты [21], то в современных исследованиях при физиологически протекающей беременности наиболее часто в тканях плаценты выявляются ДНК семейства Enterobacteriaceae [1, 22], что совпадает с полученными нами данными.
По данным литературы, по мнению J. Younes и соавт. [23], E. Popova и соавт. [24], наличие Lactobacillus spp. и семейства Enterobacteriaceae в плаценте, а также в кишечнике плода способствует формированию иммунитета у новорожденного за счет врожденной экспрессии генов иммунитета у плода и создания здорового микробиома у новорожденного. Микробиологическая колонизация матки, околоплодных вод и плаценты играет важную роль, позволяя плоду проявлять толерантность к бактериям после рождения через феномен прайминга, поскольку происходит формирование врожденной экспрессии генов иммунной реакции у плода и в дальнейшем создание здорового микробиома у новорожденного [25, 26]. Микробная колонизация плаценты при физиологическом течении беременности не вызывает неблагоприятных перинатальных исходов, соответственно, наличие плацентарного микробиома необходимо для становления адекватных защитных механизмов у плода и новорожденного против микробной инвазии окружающей среды [23, 25]. Согласно нашим результатам выявление ДНК семейства Enterobacteriaceae в плаценте и плодных оболочках не повлияло на материнские и перинатальные исходы: осложнений у обследованных пациенток в послеродовом периоде и их новорожденных не наблюдалось, поэтому выявление бактериальной массы, в составе которой определяются представители семейства Enterobacteriaceae, является физиологическим.
Вопрос о наличии микроорганизмов в амниотической полости является еще более дискуссионным. С одной стороны, в ряде исследований установлено, что наличие микроорганизмов в околоплодных водах служит предиктором преждевременных родов и/или внутриутробного инфицирования плода [25—27]. С другой стороны, доказано, что при неповрежденных плодных оболочках микроорганизмы могут проникать в полость амниона и культивироваться у здоровых матерей и их новорожденных как в амниотической полости, так и на фетальных мембранах и плаценте [23] без негативных последствий. Исследование C. Combs и соавт. [27] показало, что нет связи преждевременных родов с интраамниотическим наличием бактерий при условии отсутствия воспаления (гистологический хориоамнионит или ИЛ-6 более 11,3 нг/мл, что характеризуется как тяжелое воспаление).
Микробный пейзаж околоплодных вод характеризуется меньшим разнообразием по сравнению с другими составляющими фетоплацентарного комплекса. Так, в исследовании E. Lim и соавт. [16] анализ амниотической жидкости, собранной во время элективного кесарева сечения, продемонстрировал ее низкую обсемененность — 944±374 копии/мл. В данной работе сделан вывод, что в норме доношенный младенец внутриутробно не подвергается выраженному микробному воздействию накануне родов, однако определенная бактериальная масса в околоплодных водах все же может присутствовать. В нашем исследовании получена низкая ОБМ при интактных плодных оболочках с небольшим диапазоном выявленных микроорганизмов — ОБМл = 103,02 [0; 103,4] Гэ/мл. У 9 из 19 пациенток амниотическая полость была стерильная.
По нашему мнению, возможно, что в норме амниотическая жидкость не содержит жизнеспособные бактерии, и фактически обнаруженный микробиом — это высвобожденное ДНК микроорганизмов, происходящих из других локусов, например, из крови или плаценты. Наше мнение совпадает с мнением J. Steel и соавт. [26], C. Combs и соавт. [27], M. Collado и соавт. [28]. Авторы утверждают, что микробиомная структура околоплодных вод достаточно разнообразна, но ввиду низкой ОБМ, возможно, некоторая часть ДНК бактерий может гематогенно распространяться из крови в амниотическую полость.
Заключение
При физиологической доношенной беременности в цервикальном канале у всех обследованных беременных определялась ДНК Lactobacillus spp. в количестве 107,6 Гэ [107,1; 108,2] в образце. Общая бактериальная масса, определенная лабораторией (ОБМл) в околоплодных водах, выявлена у 10 из 19 пациенток в количестве 103,02 Гэ [0; 103,4] в образце, на плодных оболочках — у 14 из 19 беременных в количестве 103,2 Гэ [0; 103,3] в образце и в плаценте — у 15 из 19 пациенток в количестве 103,3 Гэ в образце [(103,1; 103,5]. Неидентифицируемая панелью Фемофлор-16 ДНК микроорганизмов определялась в плаценте в 15 из 19 наблюдений, в плодных оболочках — в 9 из 19 и околоплодных водах — у 11 из 19 пациенток. Среди идентифицированных микробов лидирующими в плаценте, плодных оболочках и околоплодных водах были представители семейства Enterobacteriaceae. Таким образом, микрофлора фетоплацентарного комплекса содержит свой уникальный микробиом, отличный от микрофлоры цервикального канала.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — М.А. Каганова, Н.В. Спиридонова
Сбор и обработка материала — М.А. Каганова
Статистическая обработка — М.А. Каганова
Написание текста — М.А. Каганова
Редактирование — Н.В. Спиридонова, С.В. Михальченко
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of the authors:
Concept and design of the study — M.A. Kaganova, N.V. Spiridonova
Data collection and processing — M.A. Kaganova
Statistical processing of the data — M.A. Kaganova
Text writing — M.A. Kaganova
Editing — N.V. Spiridonova, S.V. Michal’chenko
Authors declare lack of the conflicts of interests.
1Англ. elective — необязательный; кесарево сечение с учетом желания пациентки.