Введение

Корь — высококонтагиозное инфекционное заболевание человека, вызываемое вирусом Measles morbillivirus семейства Paramyxoviridae и в большинстве случаев сопровождающееся высокой температурой, воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и характерной пятнисто-папулезной сыпью. Кроме того, возможно возникновение некоторые опасных для жизни осложнений, таких как пневмония и энцефалит, особенно у детей до 1 года, у людей с ослабленным иммунитетом и беременных женщин [1]. Несмотря на наличие эффективных вакцин, корь остается глобальной проблемой общественного здравоохранения. Рост заболеваемости корью в мире увеличился на 300% в первом квартале 2019 г., в том числе в европейских странах [2]. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2019 г. показатели заболеваемости корью во всем мире достигли самого высокого уровня за 23 года, при этом рост показателей произошел во всех регионах ВОЗ, а глобальная смертность от кори увеличилась на 50% с 2016 г. [3]. В течение 2021—2022 гг. число предполагаемых случаев кори увеличилось на 18%, а смертность от кори выросла на 43% [4]. В настоящее время наиболее уязвимыми являются страны Африки (Нигерия, Либерия, Эфиопия) и страны Азии (Индия, Афганистан), в которых вакцинация против кори была отложена из-за пандемии Covid-19 и с января 2020 г. по апрель 2021 г. вакцину от кори не получили 16,6 млн детей [5]. В России, согласно государственному докладу «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2019 году», отмечался рост заболеваемости корью в 1,8 раз по сравнению с 2018 г., а число зарегистрированных случаев составило 4491. В 2023 г., по данным Роспотребнадзора [6], заболеваемость корью в России по сравнению с 2022 г. увеличилась в 288 раз и превысила 8 тыс. человек.

До появления вакцины, когда заболеваемость корью была крайне высокой, постановка диагноза основывалась на характерных клинических проявлениях данного заболевания: лихорадке, кашле, насморке и конъюнктивите, а также пятнисто-папулезной сыпи. Регистрируются также и атипичные формы кори, при которых симптомы могут быть слабо выражены или отсутствовать вовсе. На сегодняшний момент, когда реализуемые программы по элиминации кори привели к значительному снижению уровня заболеваемости, диагностика кори по клинической картине, особенно в первые дни заболевания, малоинформативна, так как ранние симптомы часто напоминают острые респираторные заболевания [7]. В этой связи для ранней диагностики кори на первый план выходят различные лабораторные методы диагностики.

Наиболее широко используемым методом лабораторной диагностики кори как в мире, так и в России является иммуноферментный анализ (ИФА), направленный на выявление антител класса IgM против вируса кори [8]. Однако, по данным нескольких крупных исследований, около 30% образцов сывороток крови, отобранных в течение 3 сут после появления сыпи, дают ложноотрицательный результат из-за недостаточного уровня титра определяемых IgM-антител [9]. В то время как наиболее заразный период заболевания начинается за 4 дня до появления сыпи и продолжается еще не менее 4 дней после ее начала [7].

Использование молекулярно-генетических методов диагностики, позволяющих определять напрямую РНК вируса кори, решает проблему ранней диагностики кори. В одном из крупнейших исследований, проведенных Центром по контролю и профилактике заболеваний Китая в Пекине, при анализе 4600 образцов, отобранных в течение первых трех дней заболевания, диагностическая чувствительность ПЦР-анализа составила 94,39% по сравнению с 56,53% для ИФА [8].

В 2022 г. в России впервые был зарегистрирован набор реагентов для выявления РНК вируса кори методом ПЦР («АмлиТест Корь», ФГБУ «ЦСП» ФМБА России), который до сих пор остается единственным зарегистрированным набором в России для молекулярной диагностики кори. Однако у ПЦР-метода есть один важный недостаток — длительность анализа (5—6 ч с момента поступления образца в лабораторию). Поэтому в настоящее время все более популярным становится использование изотермических методов амплификации, например петлевой изотермической амплификации [10], которая по времени может занимать 10—30 мин без учета экстракции РНК.

Целью настоящей работы была разработка набора реагентов на основе метода LAMP (Loop-mediated isothermal amplification, петлевая изотермическая амплификация) для быстрого обнаружения вируса кори в мазках из носоглотки и ротоглотки.

Материал и методы

Базы данных и биоинформатический анализ

Из базы данных NCBI [11] были получены все полногеномные нуклеотидные последовательности вируса кори. С помощью программы MAFFT [12] выполнено множественное выравнивание 696 нуклеотидных последовательностей, которые включали все известные генотипы вируса кори, включая вакцинные штаммы.

Клинические образцы носоглоточного секрета были получены из лаборатории «ЛабКвест» (Москва) в 2024 г. Все образцы имели положительные результаты на наличие в них РНК вируса кори, полученные с использованием набора реагентов «АмплиТест Корь» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России).

Положительный контрольный образец (ПКО) представлял собой рекомбинантную псевдовирусную частицу бактериофага, содержащую химерную последовательность генома бактериофага MS2 и фрагмент генома вируса кори (гена N) длиной 384 п.н. Внутренний контрольный образец (ВКО) представлял собой рекомбинантную псевдовирусную частицу бактериофага, содержащую искусственно синтезированную последовательность РНК длиной 258 п.н. Наработку и очистку MS2-фагов осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [13].

Концентрацию РНК в ПКО определяли методом цифровой ПЦР (Digital PCR) с использованием системы с автоматической загрузкой образцов в генератор капель QX200 AutoDG (BioRad) и амплификатора C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Для проведения анализа использовали набор реагентов 1-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes.

Экстракция РНК вируса кори из клинических и модельных образцов

Для экстракции РНК вируса кори использовали три набора реагентов производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА России: «АмплиТест РИБО-преп», «АмплиТест Магно-Сорб-Турбо» и «АмплиТест Магно-Сорб-Комбо».

Амплификация (ПЦР и LAMP)

Амплификацию экстрагированных образцов проводили с помощью приборов Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH («Киаген ГмбХ»), Германия) и CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc. («Био-Рад Лабораториз, Инк.»), США).

ПЦР, совмещенную с обратной транскрипцией, осуществляли с помощью набора реагентов «АмплиТест Корь» (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России,) согласно инструкции производителя.

Реакцию LAMP, совмещенную с обратной транскрипцией (ОТ-LAMP), проводили с использованием реакционной смеси, содержащей наборы праймеров для амплификации ВКО и вируса кори, зонды для детекции продуктов амплификации, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) («ГенТерра»), обратную транскриптазу Genta RevL («ГенТерра»), Genta Bst ДНК-полимеразу («ГенТерра»). Амплификацию проводили в диапазоне температур 55—65°C с измерением флуоресценции каждые 30 с на каналах Fam (Green) и Hex (Yellow).

Штаммы вирусов

Для оценки специфичности метода использовали следующие штаммы микроорганизмов в концентрации не менее 10⁶ копий/мл: Mumps rubulavirus (ГКВ2353), Rubella virus (ГКВ2365) из коллекции НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; Human coxsackievirus «В-3», Human respiratory syncytial virus «РС/Long», Human respirovirus 1, Human rubulavirus 2, Human respirovirus 3 «Вирус парагриппа человека 3-го типа», вируса гриппа В (Ямагатской разновидности) «В/Санкт-Петербург/НИИГ-183/2020», вируса гриппа А (H1N1) «А/СПб/НИИГ-195/2020», вируса гриппа А (H3N2) «А/Хабаровск/83/2020» из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Статистическая обработка данных

Все графики построены с использованием программы Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corporation, США)

Результаты и обсуждение

1. Выбор праймеров для LAMP

При выборе целевой мишени в геноме вируса кори учитывались как консервативность используемой для выбора праймеров области, так и разный уровень транскрипции генов вируса кори, так как это может повлиять на чувствительность разрабатываемой методики. В итоге в качестве мишени для подбора праймеров и зонда был выбран ген нуклеокапсида, в котором выбран набор олигонуклеотидов для реакции LAMP.

Анализ консервативности выбранных праймеров провели для всех полногеномных последовательностей и отдельно для относящихся к генотипам D8 и B3. Большая часть последовательностей полностью консервативна в области выбранных праймеров или содержит единичную мутацию (рис. 1).

Рис. 1. Частота встречаемости последовательностей вируса кори.

а — частота встречаемости последовательностей вируса кори генотипов В3 и D8 с мутациями в области посадки праймеров; б — частота встречаемости последовательностей вируса кори всех генотипов с мутациями в области посадки праймеров

2. Оптимизация условий амплификации

Для определения оптимальных условий проведения реакции LAMP сравнивали три температуры: 55°C, 60°C и 64°C, используя функцию градиента температур на амплификаторе CFX96. Использовали 10-кратные разведения ПКО кори от 10⁶ до 10³ копий/мл. На всех трех температурах эффективно выявлялись все четыре концентрации ПКО (табл. 1, рис. 2), однако при температуре 55°C наблюдалось значительное отставание кривых флуоресценции (в среднем на 4 цикла), существенной разницы между результатами, полученными при 60°C и 65°C, не выявлено, но чуть более ранние Ct наблюдались при 60°C, поэтому данная температура была определена как оптимальная.

Таблица 1. Эффективность амплификации при разных температурах проведения реакции ОТ-LAMP (Ct — пороговый цикл)

Рис. 2. Результаты, полученные при использовании разной температуры ОТ-LAMP.

— температура реакции 64°C; — температура реакции 60°C; — температура реакции 55°C; RFU – уровень флуоресценции; Cycles – число циклов амплификации; Amplification – амплификация.

3. Подбор условий для одновременной амплификации кДНК вируса кори и ВКО

Для выявления ВКО методом LAMP были выбраны праймеры и зонды. Для подбора оптимальной концентрации праймеров ВКО в реакционную смесь, содержащую праймеры для амплификации и детекции РНК вируса кори, добавляли разное количество праймеров для амплификации и детекции ВКО (35% и 50% от оптимальной концентрации). Проводили экстракцию РНК из 10-кратных разведений ПКО с концентрацией от 10⁵ до 10³ копий/мл совместно с ВКО. Реакцию ОТ-LAMP проводили при температуре 60°C. Как видно из табл. 2, все проанализированные образцы были определены как положительные при концентрации ВКО и 50%, и 35% без значительных сдвигов Ct. Однако добавление 35% праймеров ВКО оказалось недостаточным: наблюдались низкий уровень флуоресценции и поздние значения Ct. Поэтому нами был выбран вариант мультиплексной смеси с добавлением 50% праймеров ВКО.

Таблица 2. Результаты подбора оптимальной концентрации праймеров для детекции ВКО

4. Оценка аналитической чувствительности

Оценку аналитической чувствительности метода проводили с помощью разведений ПКО. Для того чтобы оценить аналитическую чувствительность метода, начиная с первого этапа анализа — экстракции РНК из биологического материала, нами были взяты для сравнения три набора реагентов производства ФГБУ «ЦСП» ФМБА России для выделения РНК: «АмплиТест РИБО-преп», «АмплиТест Магно-Сорб-Турбо» и «АмплиТест Магно-Сорб-Комбо». Были приготовлены модельные образцы, представляющие собой клинический материал доноров (мазки, взятые в транспортную среду) с добавлением разведения ПКО кори с концентрацией от 5∙10⁴ до 200 копий/мл, каждое разведение тестировали в десяти повторах (каждый повтор отличался донором мазка).

Как видно из результатов, представленных в табл. 3, при использовании для экстракции РНК набора реагентов ««АмплиТест РИБО-преп» образцы с концентрацией 10³ коп/мл были определены как положительные в 100% случаев. Для двух остальных наборов реагентов чувствительность анализа снижалась, причем худшие результаты были получены для набора реагентов «АмплиТест Магно-Сорб-Турбо», отличающегося наиболее простой и быстрой методикой экстракции.

Таблица 3. Аналитическая чувствительность метода ОТ-LAMP при использовании трех наборов реагентов для экстракции РНК

Параллельно выделенные образцы анализировали с помощью набора реагентов «АмлиТест Корь», основанного на методе ПЦР. Результаты исследования приведены в табл. 4. Если сравнить результаты, полученные с помощью методов LAMP и ПЦР, можно заметить, что существенной разницы в аналитической чувствительности двух методов не наблюдается. В основном чувствительность меняется в зависимости от метода экстракции РНК, при этом максимальная чувствительность достигается с помощью набора «АмплиТест РИБО-преп».

Таблица 4. Аналитическая чувствительность метода ОТ-ПЦР при использовании трех наборов реагентов для экстракции РНК

5. Оценка аналитической специфичности

Для оценки специфичности разработанного метода были исследованы как вирусы, генетически близкие к вирусу кори, так и возбудители вирусных заболеваний со схожими клиническими проявлениями. По результатам оценки аналитической специфичности метода ОТ-LAMP для выявления РНК вируса кори, ложноположительных результатов выявлено не было. Таким образом, аналитическая специфичность разработанного набора реагентов, согласно полученным данным, равна 100%.

6. Апробация набора реагентов на основе LAMP на клинических образцах

Проведены исследования клинических образцов, полученных от пациентов, с помощью двух наборов реагентов: разработанного набора на основе изотермической амплификации и зарегистрированного набора реагентов на основе ПЦР «АмлиТест Корь». Для экстракции РНК был использован набор «АмплиТест РИБО-преп». Для исследования использовали 50 образцов мазков из ротоглотки, забранных в транспортную среду. Ранее образцы были охарактеризованы как положительные, тестирование проводили в лаборатории «ЛабКвест» с использованием набора «АмлиТест Корь» и набора для экстракции РНК «АмплиТест РИБО-преп». Результаты тестирования образцов с использованием двух наборов показали высокую сходимость результатов — совпадение составило 96% (табл. 5).

Таблица 5. Результаты анализа клинических образцов с использованием двух методик: на основе ПЦР и LAMP

Обсуждение

Для ранней диагностики кори крайне важно иметь простые, быстрые и высокочувствительные диагностических тесты. До недавнего времени в России для лабораторной диагностики кори использовали исключительно методы ИФА, которые, как неоднократно было продемонстрировано ранее [14, 15], имеют крайне низкую чувствительность в ранний период заболевания. Ситуация кардинально изменилась после регистрации первого ПЦР-набора и после разработки обновленных клинических рекомендаций по ведению больных корью [16].

Однако с появлением методов изотермической амплификации пришло понимание, что нужны более быстрые и простые методы диагностики, которые позволят выявлять вирус в максимально короткие сроки. Одним из таких методов является петлевая изотермическая амплификация (LAMP). Несомненным преимуществом метода является скорость получения результата: результат может быть получен уже через несколько минут — по сравнению с 1,5—2 ч при использовании ПЦР-анализа. В том случае, когда необходимо провести предварительно этап обратной транскрипции, разница во времени анализа еще увеличивается, поскольку в случае LAMP реакция ОТ идет одновременно с амплификацией.

В отличие от ПЦР для LAMP необходимо использовать как минимум 6 праймеров, что, конечно, накладывает ограничения на использование этого метода для выявления высоковариабельных вирусов, к которым чаще всего относятся РНК-вирусы. Однако, по последним данным, наблюдается снижение разнообразия циркулирующих в мире генотипов вируса кори. Так, начиная с 2003 г., когда было обнаружено восемнадцать совместно циркулирующих генотипов, включая эндемичный для Китая в 2011—2017 гг. вирус генотипа H1, их число уменьшалось, и начиная с 2021 г. в большинстве случаев выявляются только два генотипа: B3 и D8 [17]. В этой связи задача по выбору консервативных праймеров для выявления РНК вируса кори немного упрощалась. При подборе праймеров в случае наличия мутаций мы отдавали предпочтение нуклеотидам, характерным именно для генотипов B3 и D8. Тем не менее если посмотреть на рис. 1б, то видно, что более 96% проанализированных последовательностей из базы данных NCBI не имеют мутаций либо имеют единичную мутацию в местах посадки праймеров. Если же рассматривать только последовательности B3 и D8 генотипов, эта доля превышает 99%. Известно, что одиночные мутации мало влияют на эффективность амплификации, что было показано нами для ПЦР-анализа вариабельного вируса иммунодефицита человека [18]. Таким образом, нам удалось выбрать консервативные праймеры, которые эффективно выявляют РНК вируса кори в клинических образцах.

По разным данным, метод на основе LAMP имеет меньшую аналитическую чувствительность по сравнению с методом ПЦР [19], по другим данным, на чувствительность LAMP в меньшей степени, чем на ПЦР, влияют различные компоненты (потенциальные ингибиторы) клинических образцов, что теоретически делает возможным использование LAMP без использования сложных методов экстракции нуклеиновых кислот или даже без их применения, как было показано группой японских ученых при выявлении вируса простого герпеса и вируса ветряной оспы [20]. Однако полученные нами результаты по оценке аналитической чувствительности разработанного набора на основе ОТ-LAMP оба данных факта не подтвердили. Во-первых, мы показали, что аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР и ОТ-LAMP сопоставима при использовании набора для экстракции РНК «АмплиТест Рибо-преп». Во-вторых, мы показали, что чувствительность обоих методов падала при использовании более простых методов экстракции РНК. При этом при использовании простых методов экстракции аналитическая чувствительность ОТ-LAMP была намного хуже, чем ОТ-ПЦР. Скорее всего, такое отличие от опубликованных данных связано с тем, что в нашем случае речь идет об РНК, а известно, что обратная транскриптаза крайне чувствительна к ингибиторам [21]. Тем не менее использование простых и быстрых методов экстракции может быть оправданно в случае необходимости быстрого получения результата, особенно в больницах, куда поступают пациенты на ранних сроках заболевания, когда вирусная нагрузка в ротоглотке максимальна. В работе, проведенной исследовательской группой из Франции, было показано, что концентрация РНК вируса кори в образцах слюны в первые три дня после появления сыпи составляла в среднем около 10⁸ копий/мл [22].

Из 50 клинических образцов, наличие РНК вируса кори в которых было подтверждено в нашей работе методом ОТ-ПЦР, только 2 образца дали отрицательный результат при проведении теста с использованием метода ОТ-LAMP. К сожалению, из-за ограниченного объема материала повторить исследование, чтобы понять причину дискордантных результатов, не удалось. Однако в обоих образцах вирусная нагрузка была низкой (значения Ct в ПЦР для одного из образцов превышали 30—35), что согласуется с работами по сравнению чувствительности ОТ-LAMP с методом ОТ-ПЦР для диагностики SARS-CoV-2 [23, 24].

Заключение

Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что разработанный нами набор реагентов на основе метода ОТ-LAMP для выявления РНК вируса кори обладает аналитическими характеристиками, не уступающими зарегистрированному набору реагентов на основе ОТ-ПЦР, а по скорости проведения реакции намного превосходит его.

Таким образом, в ходе настоящей работы был разработан набор реагентов, не имеющих аналогов в РФ, позволяющий быстро и без потери чувствительности проводить анализ на наличие РНК вируса кори в мазках ротоглотки и носоглотки.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.