Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), количество наблюдений бесплодия в мире составляет 10—15% и не имеет тенденции к снижению [1—3]. По официальным данным Регистра вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) Российской ассоциации репродукции человека (РАРЧ), в 2018 г. примерно 2% детей в России были рождены благодаря применению ВРТ [4]. Несмотря на то что влияние бесплодия на суммарный коэффициент рождаемости невелико, государством предпринимаются социально-экономические меры в рамках национального проекта «Демография» по финансовой поддержке семей при рождении детей, включающей лечение супружеских пар с бесплодием с помощью ВРТ [5]. В период с 2016 по 2020 г. в Красноярском крае проведено 7170 лечебных циклов ВРТ, беременность наступила у 1943 пациенток, эффективность применения технологий на количество эмбриопереносов суммарно за 5 лет составила 35,2%, родились 1629 детей, что составило 1,5% от общего числа родившихся в этот период [6].

Эффективность лечения пациенток с бесплодием методами ВРТ определяется следующим:

— овариальным резервом, при этом одним из наиболее важных критериев его оценки является уровень антимюллерова гормона (АМГ) в сыворотке крови;

— качеством полученных при индукции суперовуляции ооцитов;

— качеством эмбрионов, переносимых в полость матки;

— синхронизацией процессов фолликулогенеза и роста эндометрия.

Тенденцией настоящего времени является увеличение в клиниках ВРТ доли пациенток позднего репродуктивного возраста, имеющих неблагоприятный коморбидный фон (по как соматическим, так и гинекологическим заболеваниям), что неизбежно отражается на овариальном резерве яичников [2, 7—10].

Низкий овариальный резерв многими исследователями рассматривается как преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ), или гипергонадотропный гипогонадизм, и как причина ановуляторного бесплодия у женщин моложе 40 лет встречается с частотой 1:100, а среди женщин моложе 35 лет — 1:250 [3, 11, 12]. Клинико-лабораторные характеристики ПНЯ определены и включают олигоменорею или отсутствие менструаций в течение 4—6 мес; уровень ФСГ в крови >25 МЕ/л в двух исследованиях с интервалом не менее 4 нед (латентная ПНЯ — ФСГ ≥12 ME/л); снижение уровня E₂ в крови [2, 7].

ПНЯ является состоянием, которое для женщины может оказаться неожиданным и требует принципиального пересмотра методов планирования семьи. Лечение включает психологическое консультирование, гормональную терапию и сопутствующую терапию. Рекомендации по лечению бесплодия при латентной ПНЯ — это проведение программ ВРТ, когда еще возможно получить собственные ооциты, а при абсолютной ПНЯ рекомендована донация ооцитов в программах ВРТ. Важно, что у 5—15% пациенток при латентной ПНЯ имеется возможность возобновления секреции половых гормонов и фертильности [12].

Учитывая вышесказанное, заслуживает внимания возможность использования при планировании программ ВРТ фолликулярного нейропептидного протектора Пинеамин (лекарственная группа: полипептиды эпифиза — шишковидной железы крупного рогатого скота). Механизм действия препарата основан на возможности эпифиза восстанавливать функциональную плотность пинеалоцитов (полигональных паренхиматозных клеток шишковидной железы) и повышать секрецию эндогенного мелатонина (МТ) [11, 13]. МТ в свою очередь стимулирует гонадотропин-ингибирующие (GnIH) нейроны, которые оказывают тормозящее действие на гонадотропин-рилизинг-гормон (ГнРГ) и способствуют снижению выработки фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Этот феномен особенно актуален при планировании программ ВРТ у пациенток с латентной формой ПНЯ, когда на фоне нормализации уровня ФСГ расширяются возможности гонадотропной индукции овуляции [14, 15].

Еще один важный механизм влияния МТ на растущий фолликул должен быть учтен. Как известно, макрофаги, нейтрофилы и клетки эндотелия сосудов, находящиеся в фолликулах, продуцируют активные формы кислорода во время овуляции. Хотя активные формы кислорода играют роль в разрыве фолликула, они потенциально могут повреждать яйцеклетку и лютеиновые клетки гранулезы [16, 17]. Рядом авторов показано, что концентрация МТ в фолликулярной жидкости в 3 раза выше, чем в крови. По мере приближения овуляции уровень фолликулярного МТ повышается, при этом в общий кровоток он не попадает. Концентрация МТ выше в крупных фолликулах, чем в небольших, что позволяет предположить, что повышение его в преовуляторных фолликулах может способствовать овуляции [18, 19]. Эндогенный МТ является важным антиоксидантом в фолликулах яичников, и увеличение его концентрации в фолликулярной жидкости снижает процессы окислительного повреждения клеток внутри фолликулов, повышает вероятность получения зрелых ооцитов, что способствует их оплодотворению in vitro и повышению качества бластоцист, а значит, косвенно влияет на процессы имплантации. Фолликулярный МТ также индуцирует синтез прогестерона лютеиновыми клетками желтого тела, что способствует не только наступлению беременности, но и ее вынашиванию [17, 20, 21].

Авторами показано, что обогащение МТ-сред для культивирования ооцитов и эмбрионов продлевает оптимальное окно для оплодотворения ооцитов в возрасте 8 и 16 ч in vitro и значительно улучшает качество получаемых эмбрионов [22, 23]. Однако до настоящего времени не разработано четких критериев и нормативных показателей уровня МТ как в фолликулярной жидкости, так и в сыворотке крови, которые могли бы рассматриваться в условиях реальной клинической практики как предикторы успешности лечения ановуляторного бесплодия.

Цель исследования — изучение уровня фолликулярного мелатонина как предиктора исхода применения программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с ановуляторным бесплодием.

Материал и методы

Настоящее исследование выполнено в период с 2018 по 2021 г. на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии ИПО ФГОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» и ООО «Медицинский центр гинекологической эндокринологии и репродукции «Три сердца». Исследование уровня МТ в фолликулярной жидкости проводили под руководством д.б.н. О.Л. Лопатиной на базе «Центра коллективного пользования КрасГМУ», использовали набор для определения МТ методом ИФА (CEA908Ge, «Cloud-Clone Corp.», США). Чувствительность 4,63 пг/мл. Исследования проводили по протоколу производителя (https://www.cloud-clone.com/products/CEA908Ge.html).

Для исследования методом сплошной выборки были отобраны 330 пациенток с различными формами бесплодия, планирующих лечение методами ВРТ. После учета критериев включения и исключения нами были включены в исследование 150 пациенток, среди них 100 с ановуляторной формой бесплодия, 50 с мужским фактором бесплодия. У всех пациенток было получено информированное добровольное согласие на проведение обследования и предложенных лечебно-оздоровительных мероприятий. Для определения причин бесплодия использовали клинико-статистический анализ, диагностику инфекционно-воспалительных, анатомических, гормональных, а также иммунологических и тромбофилических нарушений.

Критерии включения в исследование: возраст от 18 до 45 лет; уровень АМГ не ниже 1,0 нг/мл, уровень ФСГ не более 12,0 МЕ/л, индекс массы тела женщины не менее 18 и не более 35 кг/м²; женское бесплодие, связанное с отсутствием овуляции (МКБ Х N97.0); женское бесплодие, связанное с изолированным мужским фактором (МКБ Х N97.4); правильное анатомическое строение матки.

Критерии исключения из исследования: наличие гинекологических заболеваний, снижающих вероятность наступления беременности при использовании методов ВРТ (хронические сальпингиты с образованием гидросальпинксов, миома матки размером >4 см, субмукозное расположение миоматозного узла, гиперпластические заболевания эндометрия, опухолевидные образования яичников); наличие тяжелых соматических и психических заболеваний, препятствующих вынашиванию беременности и рождению ребенка; наличие острых воспалительных заболеваний репродуктивной системы; отсутствие возможности получения жизнеспособных сперматозоидов (азооспермия, аспермия).

Когорта пациенток была разделена на три группы. В 1-ю группу были включены 50 пациенток с ановуляторной формой бесплодия и низким овариальным резервом (АМГ ≤1,2 нг/мл), каждой 3-й пациентке на прегравидарном этапе применяли со 2—3-го дня менструального цикла (д.м.ц.) курсом 10 дней лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения 10 мг водорастворимых полипептидных фракций эпифиза — фолликулярный нейропептидный протектор Пинеамин (ООО «ГЕРОФАРМ», Россия). Во 2-ю группу были отнесены 50 пациенток с ановуляторной формой бесплодия и высоким овариальным резервом (АМГ >2 нг/мл). Контрольную группу составили 50 пациенток, не имевших хронических соматических заболеваний и нарушений репродуктивного здоровья, где бесплодие было обусловлено мужским фактором. В ходе обследования была разработана специальная программа исследования, позволяющая персонифицировать протоколы индукции суперовуляции и программы ВРТ.

Стимуляцию суперовуляции осуществляли с применением короткого протокола с антагонистом ГнРГ (ант-ГнРГ) — цетрореликсом. Рекомбинантный ФСГ (рФСГ) — (гонадотропин альфа, гонал-Ф) — и человеческий менопаузальный гонадотропин (ЧМГ, менопур) использовались в индивидуально подобранных дозах, с учетом овариального резерва. В качестве триггера овуляции использовали рекомбинантный хориогонадотропин альфа (рХГα) в дозе 6500 МЕ. Оценка эффективности индукции овуляции осуществлялась в период с 3-го по 14-й день менструального цикла с применением трансвагинальной эхографии.

Образцы фолликулярной жидкости получали во время аспирации преовуляторных доминантных фолликулов, достигших диаметра 18—20 мм трансвагинальным доступом под контролем ультразвука с применением аппарата Samsung HS30. Образцы фолликулярной жидкости помещали в стерильные пластиковые пробирки и замораживали для последующего исследования. Морфологическую оценку ооцитов в лаборатории осуществляли по состоянию внешнего вида полученных ооцит-кумулюс-комплексов: «прозрачности», размера и «степени разрыхления» клеток кумулюса и лучистого венца.

На эмбриологическом этапе ВРТ культивирование эмбрионов осуществлялось на средах William A. Cook Australia Pty. Ltd. (Австралия) в пластиковых планшетах фирмы «Cook Vandergrift Inc.» (США), в специализированных инкубаторах TermoForma CO₂ (США) и SANYO O₂/CO₂ (Япония) при концентрации CO₂ 6,0%, O₂ 10,0%, температуре 37°C. Качество и морфологическое развитие эмбрионов контролировались ежедневно. Использовались критерии оценки развития бластоцист по классификации, предложенной Д.К. Гарднером (dr. D.K. Gardner). Эффективность программ ВРТ оценивали по результатам наступления беременности в расчете на количество эмбриопереносов, по уровню хорионического гонадотропина человека (ХГч) и при эхографическом подтверждении клинической беременности.

Использовалась описательная статистика: частота в процентах, средняя арифметическая (M), ошибка средней (m). Методы непараметрической статистики: критерий согласия Пирсона (χ²), критерий Колмогорова—Смирнова (λ). Для оценки связи признаков применен корреляционный анализ с расчетом коэффициентов корреляции по методу Спирмена (r_s). Проводились расчеты множественной и логистической регрессий, при значении коэффициента корреляции r_s≥0,75 связь между признаками оценивалась как сильная, при коэффициенте 0,25s<0,75 — зависимость средней силы, при r_s≤0,25 — слабая степень корреляции. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Возраст женщин в обследуемых группах колебался от 18 до 45 лет. Средний возраст пациенток 1-й группы составил 35,7±0,7 года, 2-й группы — 31,5±0,5 года (p_1,2<0,05), контрольной группы — 33,0±0,5 года (p_1,3>0,05, p_2,3>0,05, χ² — 18,299). Доля женщин старшего репродуктивного возраста в обследуемых группах составила 39% (19), 22% (11) и 4% (2) (p_1,2<0,05, p_1,3<0,05, p_2,3<0,05) соответственно. Во всех группах превалировало первичное бесплодие — 58% (29), 58% (29) и 62% (31) (p >0,05) соответственно. Продолжительность бесплодия колебалась от 1 года до 20 лет и составила в среднем 6,01±0,28 года (χ² — 3,520) к моменту проведения исследования с использованием программ ВРТ. Анализ репродуктивной функции у женщин обследованных групп с вторичным бесплодием показал, что в 1-й группе доля срочных родов составила 12% (6), преждевременных родов — 2% (1), медицинские аборты выполняли 14% (7) пациенток, репродуктивные потери наблюдались у 28% (14), среднее количество беременностей на 1 пациентку составило 1,3±0,06. Среди пациенток 2-й группы доля срочных родов была 12% (6), медицинские аборты составили 14% (7) и репродуктивные потери — 30% (15), среднее количество беременностей на 1 пациентку составило 1,3±0,06 (p_1,2>0,05). У пациенток 3-й группы срочные роды наблюдались у 14% (7), преждевременные роды — у 4% (2), медицинские аборты — у 18% (9), репродуктивные потери 22% (11), среднее количество беременностей составило 1,0±0,04 (p_1,3>0,05, p_2,3>0,05). Таким образом, только каждая 5-я пациентка в обследованных группах имела деторождение.

Оценку уровня гонадотропных и стероидных гормонов осуществляли во всей выборке пациенток на 2—3-й д.м.ц., уровня прогестерона — на 20—22-й д.м.ц. на этапе подготовки пациенток к лечению методами ВРТ для оценки овариального резерва, овуляции и выбора протокола стимуляции суперовуляции (табл. 1). Показатели гонадотропных, стероидных гормонов и АМГ в 1-й группе подтверждали наличие ановуляторного бесплодия и низкий овариальный резерв, во 2-й группе — ановуляторное бесплодие с высоким овариальным резервом, в 3-й группе пациентки имели показатели нормального овуляторного цикла и овариального резерва.

Таблица 1. Показатели гонадотропных и стероидных гормонов в обследованных группах, M±m

В 1-й группе была проведена стимуляция суперовуляции по короткому протоколу с применением ант-ГнРГ и комбинации рФСГ (гонал-Ф) и ЧМГ (менопур). Длительность овариальной стимуляции составила 9,9±0,2 дня, суммарная доза рФСГ — 2342,50±61,16 МЕ/л (min 1500 — max 3300), ЧМГ — 2372,22±81,17 МЕ/л (min 975 — 3600), средняя продолжительность введения ант-ГнРГ — 4,20±0,08 дня. Доза эстрогенов для обеспечения роста эндометрия составляла 3,0 мг/сут. Во 2-й группе длительность овариальной стимуляции составила 10,02±0,15 дней, суммарная доза рФСГ — 2295,50±48,99 МЕ/л (min 1500 — max 3300), ЧМГ — 1935,00±262,39 МЕ/л (min 900 — max 2325), средняя продолжительность введения ант-ГнРГ — 4,90±0,09 дня, доза эстрогенов для обеспечения роста эндометрия — 2,0 мг/сут. В 3-й группе длительность овариальной стимуляции составила 9,6±0,16 дня, суммарная доза рФСГ — 2209,09±169,03 МЕ/л (min 1350 — max 3300), ЧМГ — 2209,00±169,03 МЕ/л (min 900 — max 2775), средняя продолжительность введения ант-ГнРГ — 4,60±0,09 дня, доза эстрогенов для обеспечения роста эндометрия — 2,0 мг/сут. В обследованных группах нами не получено статистически значимых различий в продолжительности стимуляции p>0,05) и суммарных дозах гонадотропинов, отмечена только необходимость использования более высоких доз эстрадиола у пациенток с низким овариальным резервом.

Анализ результатов эффективности стимуляции суперовуляции в обследованных группах представлен в табл. 2, где отмечены достоверные различия в количестве полученных ооцитов на пункцию среди пациенток 2-й группы, но не получено отличий в селекции эмбрионов высокого качества, выбранных для переноса в полость матки.

Таблица 2. Количество ооцитов и зигот у пациенток обследованных групп

Примечание. * — различия статистически достоверны (p_1,2<0,05).

У 60% (90) пациенток обследованных групп определяли уровень МТ в фолликулярной жидкости и проводили корреляционный анализ с качеством полученных ооцитов и эмбрионов. Средний уровень МТ фолликулярной жидкости во всей выборке составил 4,83±0,09 пг/мл (min 1,0 — max 11,67). В 1-й группе этот показатель оказался наиболее высоким — 5,02±0,41 пг/мл (min 2,11 — max 11,67) что, вероятно, было обусловлено применением фолликулярного нейропептидного протектора пинеамина на прегравидарном этапе. Во 2-й группе уровень МТ в фолликулярной жидкости оказался самым низким — 4,63±0,33 пг/мл (min 1,00 — max 7,88), в группе контроля — 4,82±0,44 пг/мл (min 1,00 — max 9,32), χ² — 0,027. Корреляционный анализ между уровнем МТ и количеством зрелых ооцитов выявил показатель коэффициента корреляции Спирмена r_s≥0,92 во всей выборке пациенток, а при групповом распределении он составил r_s≥0,917, r_s≥0,921 и r_s≥0,942 соответственно, что оценивалось как сильная связь между оцениваемыми признаками. Корреляционный анализ между уровнем МТ и количеством эмбрионов высокого качества в общей выборке обследованных групп представлен на рисунке. При групповом сравнении нами было выявлено, что эмбрионы высокого качества в 1-й группе наблюдались при референсном значении МТ в фолликулярной жидкости 3,248—5,464 пг/мл, λ=0,308, p=0,250. Во 2-й группе — 3,820—6,644 пг/мл, λ=0,249, p=0,200, в 3-й группе — 4,321—5,889 пг/мл, λ=0,207, p=0,200. Результативность программ ВРТ у пациенток обследованных групп представлена в табл. 3. Наименьшее количество ооцитов и эмбрионов получено нами у пациенток 1-й группы. У каждой 5-й пациентки при культивировании эмбрионов произошла остановка развития, поэтому только у 88% (44) женщин был проведен перенос эмбрионов (ПЭ) 1—2 при толщине эндометрия групп 9,71±0,13 мм, и количество наступления беременности от количества эмбриопереносов составило 31,8%. Получены аналогичные результаты и в контрольной группе, где у пациенток был персонифицирован протокол индукции овуляции и вводились более низкие дозы гормонов, но по причине патоспермии в 16% (6) протоколов произошла остановка развития эмбрионов, и ПЭ был осуществлен у 84% (42) пациенток при толщине эндометрия 9,83±0,12 мм с количеством наступления беременности 33,3%.



Анализ уровня фолликулярного мелатонина и развитие эмбрионов высокого качества в общей выборке обследованных групп.

0 — эмбрионы низкого качества, 1 — эмбрионы высокого качества.

Таблица 3. Эффективность программ ВРТ у пациенток обследованных групп

Наибольшие проблемы мы наблюдали среди пациенток 2-й группы, при значительном количестве полученных ооцитов оплодотворению подлежали только 63,8% ооцитов. По причине развития синдрома гиперстимулированных яичников было проведено сегментирование циклов у 16% (6) женщин, у каждой 5-й пациентки произошла остановка развития эмбрионов, поэтому только у 74% (37) был проведен перенос эмбрионов при толщине эндометрия 9,52±0,12 мм, и процент наступления беременности у них составил 29,7.

Заключение

Из представленного исследования можно заключить, что референсные значения фолликулярного эндогенного МТ от 3,248 до 6,644 пг/мл можно рассматривать как необходимые для прогнозирования получения зрелых ооцитов и эмбрионов высокого качества у женщин как с ановуляторным бесплодием, так и с бесплодием, обусловленным мужским фактором.

Для повышения выработки эндогенного мелатонина в фолликулярной жидкости целесообразно на прегравидарном этапе использовать со 2—3-го дня менструального цикла пинеамин-лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения, содержащий 10 мг водорастворимых полипептидных фракций эпифиза курсом 10 дней, что существенно влияет на овариальный резерв, качество ооцитов и эмбрионов и в целом на результативность лечения пациенток с ановуляторным бесплодием методами ВРТ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Базина М.И., Егорова А.Т.

Сбор и обработка материала — Васильева А.С., Базина М.И., Сыромятникова С.А., Лопатина О.Л., Пожиленкова Е.А.

Статистическая обработка — Наркевич А.Н.

Написание текста — Васильева А.С.

Редактирование — Базина М.И., Егорова А.Т., Васильева А.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Bazina M.I., Egorova A.T.

Collection and processing of the material — Vasil’eva A.S., Bazina M.I., Syromyatnikova S.A., Lopatina O.L., Pozhilenkova E.A.

Statistical processing of the data — Narkevich A.N.

Text writing — Vasil’eva A.S.

Editing — Bazina M.I., Egorova A.T., Vasil’eva A.S.

Authors declare lack of the conflicts of interests.