Введение

Частота бесплодных браков в России колеблется в зависимости от регионов — от 17,2 до 24% [1]. Женское бесплодие составляет 44,4—52,7% [2]. Сочетанные факторы бесплодия — миома (ММ) в сочетании с эндометриозом матки выявляются у 35—85% женщин [3]. Следует отметить, что у 25% больных помимо ММ и эндометриоза наблюдаются также гиперпластические процессы в эндометрии, обусловленные едиными патофизиологическими механизмами, сходными факторами риска и широким распространением оперативных вмешательств [4, 5]. Термин «гиперплазия эндометрия» (ГЭ; от греч. hyper — сверх, plasis — образование) включает обширный процесс гистологических изменений железистой ткани и стромы эндометрия [6]. К этиологическим факторам развития ГЭ относят инфекционно-воспалительные процессы. Кроме того, по данным отечественных публикаций, показано развитие гиперплазии без атипии у пациенток с хроническим эндометритом разной степени выраженности [7]. Последствия обменно-эндокринных нарушений связаны с абсолютной и относительной гиперэстрогенемией, сопровождающейся недостаточным влиянием прогестерона. Баланс половых гормонов сопряжен с деятельностью всех желез внутренней секреции, в частности, щитовидной железы и надпочечников, а также с такими патологическими состояниями, как ожирение, гиперлипидемия, сахарный диабет [7]. Таким образом, патогенез гиперплазии эндометрия — это сложный процесс, в котором принимают участие как местные, так и системные факторы, вовлекая в патологическое состояние весь организм женщины, нарушая фертильность [5, 7]. В научных публикациях высказывается мнение о целесообразности проведения предымплантационного генетического тестирования на анеуплоидию в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у пациенток после консервативного лечения по поводу атипической гиперплазии эндометрия [8].

С учетом изложенного представляются актуальными вопросы эффективности применения ВРТ у пациенток с сочетанными факторами бесплодия. В связи с этим представляют интерес исследование ферментной системы матриксной металлопротеиназы-1 (ММП-1) и тканевого ингибитора метллопротеиназы-1 (ТИМП-1) в фолликулярной жидкости (ФЖ) у пациенток с бесплодием, а также применение метода функциональной морфологии биологических жидкостей (БЖ), что позволит получить возможность более глубокого представления о внутриорганных изменениях в яичниках.

Матриксные металлопротеиназы (ММП) — это семейство цинкзависимых эндопептидаз, расщепляющих все белки внеклеточного матрикса (ВКМ) [9] и ремоделирующие ВКМ [9—13]. ММП модулируют различные аспекты иммунного ответа, апоптоза, пролиферации, дифференцировки и миграции клеток, являясь важным компонентом нормального функционирования тканей и органов [9—13], участвуют в метаболических процессах, процессах эмбриогенеза, имплантации эмбрионов, их роста и развития [13]. Известно более 30 видов ММП, которые поделены на 6 групп [9—13]. ММП-1 — первый тканевый фермент, который гидролизует интерстициальные коллагены — I, II, III, VII и X типов, а также белки соединительнотканного матрикса. Этот фермент синтезируется рядом клеток: фибробластами, хондроцитами, эпителиальными клетками, макрофагами [9—13]. В физиологических условиях ММП-1 обнаруживается в клетках фолликулов всех стадий развития: в клетках вторичных и третичных фолликулов, в лютеиновых клетках функционально активных желтых тел, в интерстициальных гормон-продуцирующих клетках и клетках покровного эпителия [11]. Активность в физиологических условиях регулируется специфическими ингибиторами тканей — тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП) [9—11, 14—16]. К настоящему времени в геноме человека найдены 4 гена белков ТИМП. Хотя часто считают, что ТИМП-1 ингибирует в основном ММП-1, а ТИМП-2 — ММП-2 и т.д., реальная картина воздействия определенных белков ТИМП на коллагеназы сложнее. Любой из белков ТИМП может ингибировать практически любую коллагеназу, но с разными константами ингибирования в разных тканях [12]. На уровень синтеза ТИМП-1 оказывают влияние различные внешние стимулы, такие как форболовые эфиры, ростовые факторы, цитокины, в то время как экспрессия ТИМП-2 в основном конститутивна. Предполагается, что ингибиторная активность ТИМП-3 может усиливаться в присутствии некоторых гепарансульфатпротеогликанов. О ТИМП-4 известно немного, однако предполагается, что он играет главную роль при связывании ММП в тканях сердца [12]. Основное место экспрессии ТИМП-1 — яичники и костная ткань. ТИМП-1 представляет собой белок массой 28,50 кДа, определяемый во многих тканях. ТИМП-1 стимулирует синтез ММП-1 в фибробластах, очевидно по механизму отрицательной обратной связи [13]. Необходимым условием нормального протекания физиологических процессов в межклеточном матриксе является поддержание равновесия между активностью ММП и их ингибиторов. Нарушение этого равновесия может оказывать глубокое воздействие на состав межклеточного матрикса и влиять на различные функции клеток, включая адгезию, миграцию и дифференциацию [9—11, 14, 15], обусловливая развитие патологических процессов — воспалительных, аутоиммунных, нейродегенеративных, сердечно-сосудистых, инфекционных и онкологических [9—13]. Фиброз in vivo ассоциируется с увеличением уровня ТИМП-1, что подразумевает снижение активности ММП и, следовательно, увеличение накопления ВКМ [16, 17]. Повышенный уровень ТИМП-1 служит универсальным маркером фиброза ВКМ различных органов, например, щитовидной железы, почек [18, 19], миокарда [16]. Имеются публикации о подтверждающей прогностической роли ТИМП-1 в метастазировании рака яичника в лимфатические узлы. Уровень ТИМП-1 в сыворотке крови больных достоверно возрастает при переходе от доброкачественных к пограничным и далее к злокачественным новообразованиям яичника [11].

Использование метода исследования функциональной морфологии БЖ дает возможность технически просто определять физиологические резервы человека, устанавливать характер и глубину патологических изменений [20, 21]. Суть метода заключается в процессе перехода БЖ из жидкого состояния в твердое (дегидратация), при котором организуется определенный статический структурный порядок, возможный для анализа [20—24].

Цель исследования — оценка степени патогенетических нарушений у пациенток с сочетанными формами бесплодия в зависимости от уровней ТИМП-1 и морфологической картины фолликулярной жидкости.

Материал и методы

В исследование включена 31 пациентка с сочетанными факторами бесплодия за период 2013—2016 гг. в отделении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) БУ «Президентский перинатальный центр» Минздрава Чувашии. Обследование проводилось согласно стандартам оказания медицинской помощи и включало сбор жалоб, данных о перенесенных заболеваниях, оперативных вмешательствах в анамнезе, особенностях менструальной и репродуктивной функций, физикальный осмотр, гинекологическое исследование. С целью оценки функциональной активности яичников определяли гормональный профиль: уровни пролактина, гонадотропинов, стероидных, тиреоидных гормонов в крови на 3—5-й день менструального цикла; прогестерона — на 21—22-й день. Выполняли трансвагинальное ультразвуковое исследование (УЗИ) матки, состояния эндометрия, яичников. Состояние маточных труб и органов малого таза оценивали при лапароскопии и гистеросальпингографии. При гистероскопии с последующим взятием биопсии проводили дополнительную оценку состояния эндометрия. Наличие гиперплазии эндометрия подтверждалось результатом гистологического исследования. Осуществляли выбор протокола стимуляции овуляции, разрабатывали порядок контроля за исходом и конечным результатом ВРТ. Выбор режима лечения и схем стимуляции овуляции осуществляли с учетом анамнеза, исхода предыдущих попыток применения ВРТ (не зависел от сформированных групп исследования). При использовании протокола с агонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (аГнРГ) у 22 пациенток применяли ежедневные подкожные инъекции аГнРГ по 0,1 мл в лютеиновую фазу менструального цикла. При использовании протокола с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (антГнРГ) у 9 пациенток вводили антГнРГ по 0,25 мг на 3-й день лечебного цикла и ежедневно до начала индукции овуляции. Стандартная доза гонадотропинов составила 75—225 МЕ в зависимости от возраста, анамнеза болезни. Овуляторная доза хорионического гонадотропина человека составляла 10 тыс. МЕ. Через 36 ч после введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина человека под контролем УЗИ проводили трансвагинальную пункцию фолликулов и аспирацию их содержимого. Для переноса использовали эмбрионы отличного и хорошего качества (A, AB). Осуществлен сравнительный анализ по результатам исходов программ ВРТ: у 6 пациенток наступила беременность, у 25 пациенток был неудачный исход (в том числе у 20 пациенток с гиперпластическими процессами в эндометрии в анамнезе. Таким образом, результативность программ ВРТ составила 19,4%, частота живорождения — 19,4%. Сравнительный анализ проводили в зависимости от исхода программ ВРТ — внутригрупповой: контрольная группа — положительный исход ВРТ (n=6), основная — неудачный исход ВРТ (n=5) и межгрупповой с целью выявления патогенетических причин неудач: без гиперплазии эндометрия в анамнезе — контрольная группа (n=11), с гиперплазией эндометрия в анамнезе — основная группа (n=20).

Критерии включения в исследование: маточный фактор бесплодия (МКБ-10: N97.2): с эндометриозом (наружно-генитальный эндометриоз — МКБ-10: N80.0, эндометриоз яичников (МКБ-10: N80.1), эндометриоз тазовой брюшины (МКБ-10: N80.3); с миомой матки (МКБ-10: D 25.9): узлы 3, 4, 5, 6-го типов по классификации Международной федерации акушерства и гинекологии (FIGO); с гиперплазией эндометрия без атипии в анамнезе (МКБ-10: N85.0). С трубным бесплодием (МКБ-10: N97.1). Возраст от 24 до 40 лет, с первичным и вторичным бесплодием, без и с наличием оперативных вмешательств по поводу наружного генитального эндометриоза, миомы матки.

Критерии исключения: бесплодие цервикального происхождения (МКБ-10: N97.3); другие формы женского бесплодия (МКБ-10: N97.8); неуточненное (МКБ-10: N97.8); с мужским фактором бесплодия (МКБ-10: N97.4); женское бесплодие (МКБ-10: N97) при наличии острого и подострого инфекционного, гинекологического и экстрагенитального заболеваний в стадии обострения; наличие доброкачественных опухолей репродуктивной системы; некорригированные гормональные нарушения; злокачественные опухоли; пороки развития матки (двурогая матка, генитальный инфантилизм, гипоплазия матки); показатель антимюллерова гормона (АМГ) ниже референсных значений (норма 0,9—1,3 нг/мг).

Во время пункции фолликулов забирали ФЖ, а затем методом количественного твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» определяли содержание уровней ММП-1 и ТИМП-1. Иммуноферментный анализ выполняли на автоматическом планшетном фотометре Thermo Scientific Multiskan FC (USA, 2012) в лаборатории Ульяновского государственного университета. Концентрацию ММП-1 устанавливали с помощью наборов Matrix metalloproteinase-1 (набор Human MMP-1 Quantikine ELISA Kit, R&D System), ТИМП-1 определяли с помощью наборов eBioscience (набор Human TIMP-1 Quantikine ELISA Kit). ФЖ исследовали методом клиновидной дегидратации, разработанным академиком РАН, проф. В.Н. Шабалиным и проф. С.Н. Шатохиной (1991 г.) [20, 21]. Для исследования применяли ФЖ, полученную путем аспирации из нескольких фолликул во время пункции. Медицинская технология разрешена Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (ФС №2009/155 от 15 июня 2009 г.). При анализе ФЖ исследованию подвергалось 2 объекта: фация (высушенная капля), полученная из свежевзятой ФЖ (исходная фация ФЖ). В ней происходят текущие биохимические процессы; фация, полученная из ФЖ, хранившейся в течение суток при температуре 4—8 °C (суточная фация ФЖ, в фазе завершенных ферментативных процессов) [22, 23]. ФЖ автоматической микропипеткой в количестве 20 мкл наносилась на предварительно подготовленное предметное стекло. Диаметр капли 5—7 мм, средняя толщина 1 мм. Капля высушивалась при температуре 25 °C, относительной влажности воздуха 60—70%, минимальной подвижности воздуха в течение 18—24 ч [22, 23]. Микроскопия структур фаций ФЖ изучена с помощью стереомикроскопа MZ12 (Leica, Германия), оснащенного видеокамерой Pixera, с использованием программы «Морфотест». Фотографии получали при разных увеличениях — ×80, ×400. Оценка фаций ФЖ проведена в соответствии с методическими рекомендациями МЗ РФ №96/165 «Формирование кристаллических структур биологических жидкостей при различных видах патологии» [24]. Электронная база фотографий фаций ФЖ составила 268 фото.

Образованная в ходе исследования база данных размещена в программе Microsoft Excel 2019 для Windows 10. Полученная информация подвергалась статистическому анализу с помощью прикладной программы Statistica 10.0. В начале анализа данных сформированы вариационные ряды абсолютных чисел, вычислены средние величины (M) и средняя арифметическая (m), достоверность проверена с помощью критерия Стьюдента (t). Определен размах вариации (R) — разность между минимальным и максимальным значением признака. Для сравнения 2 относительных показателей, характеризующих частоту определенного признака, использовали точный критерий Фишера (F). Статистически значимыми различия считали при З<0,05. Для поиска межгрупповых различий использовали критерий Манна—Уитни (U). Для оценки значимости различий между относительными признаками применяли критерий Пирсона (χ²). Связь явлений, одно из которых входит в число причин, воздействующих на эти явления, выражали с помощью корреляции (r). Относительный риск (ОР) и его 95% ДИ использовали для оценки отношения частоты исходов среди обследуемых. Для определения статистических линейных и нелинейных взаимосвязей выбранных параметров использовали уравнение парной и множественной регрессии.

Результаты

Средний возраст пациенток составил 33 [29; 36] года: с удачными исходами — 30 [30; 38] лет, с неудачными — 36 [35; 36] лет, с гиперплазией эндометрия без атипии — 36 [32; 38] лет. Распределение в зависимости от возраста и различий исходов представлены в таблице.

Результаты применения программ ВРТ в зависимости от возраста

Примечание. Б+ — пациентки с удачными исходами программ ВРТ; Б– — пациентки с неудачными исходами программ ВРТ.

При сравнительном анализе по возрасту различия не наблюдались (p>0,05). При исследовании социального фактора различия также не наблюдались: 27 (87,1%) пациенток проживали в городе, имели высшее образование 21 (67,7%) пациентка и по социальному статусу относились к рабочим 23 (74,0%) пациентки. В первом браке состояли 27 (87,1%) женщин. По числу экстрагенитальных заболеваний не было достоверных различий (p>0,05). При внутригрупповом сравнении (r=0,3) отмечено увеличение у пациенток с неудачными исходами программ ВРТ (p<0,05): заболеваний органов дыхания (ОШ 20,0; 95% ДИ 1,6—42,9), пищеварения (ОШ 20,0; 95% ДИ 1,6—42,9) и патологии щитовидной железы (ОШ 20,0; 95% ДИ 1,6—42,9). При межгрупповом сравнении (r=0,7) у пациенток с гиперплазией эндометрия выявлялись заболевания щитовидной железы (45,0%), ожирение (45,0%). Следует отметить, что наблюдался высокий процент пациенток с сердечно-сосудистой патологией во всех сравниваемых группах. Пациентки основной группы с гиперплазией эндометрия имели достоверно большее число гинекологических заболеваний (5,4 на 1 пациентку), чем пациентки контрольной группы без гиперплазии (4,3 на 1 пациентку) и больше операций (p<0,05) за счет различий в проведенных тубэктомиях по поводу гидросальпинкса (ОШ 10,0; 95% ДИ 1,1—93,4), по поводу эктопических беременностей (ОШ 10,0; ДИ 95% 1,1—93,4), что оказало заметное (r=0,6) влияние на результативность. Средний возраст менархе не различался в группах и составил 13±2 года. Пациентки с неудачным исходом начинали половую жизнь (18 лет) несколько раньше, чем пациентки с удачным исходом (20 лет). У пациенток без гиперплазии эндометрия в основном имелось первичное бесплодие длительностью от 2 до 5 лет; в сочетании с гиперплазией — вторичное бесплодие, с длительностью от 5 до более 10 лет (95,0%; ОШ 10,8; 95% ДИ 1,6—70,9; p<0,05). У пациенток основной группы было больше патологических беременностей (p<0,05): эктопических (ОШ 1,3; 95% ДИ 0,1—23,2) и неразвивающихся (ОШ 1,0; 95% ДИ 0,03—11,9). При сравнении гормональных показателей имелись достоверные различия по уровню лютеинизирующего гормона (>1,8±0,8 мМЕ/мл; p<0,05) у пациенток основной группы при внутригрупповом сравнении, а при межгрупповом сравнении — по уровню фолликулостимулирующего гормона (<12,6±0,4 мМЕ/мл; p<0,05).

При гистероскопии седловидная матка выявлена в 3 (9,7%) наблюдениях: у 2 пациенток — с удачным исходом, в одном наблюдении — с неудачным исходом. В одном наблюдении у пациентки с гиперплазией эндометрия в анамнезе проведена миомэктомия субмукозного узла. В анамнезе до применения программ ВРТ у 7 (22,6%) пациенток были проведены стимуляции суперовуляции клостилбегитом, в результате у 4 пациенток наступили эктопические беременности (у одной — с положительным исходом ЭКО в данной программе и у 3 — в группе пациенток с гиперпластическими процессами в эндометрии); у 3 пациенток основной группы беременность прервалась на раннем сроке.

До вступления в программу пациенткам проводили противовоспалительную терапию, лечение урогенитальной инфекции, гормональную коррекцию пероральными контрацептивными препаратами (микрогенон), синтетическими прогестинами (дюфастон, оргаметрил). Протокол с аГнРГ применен у 22 (70,9%) пациенток, протокол с антГнРГ — у 9 (29,0%). Технология ЭКО/ИКСИ использована у 9 (29,0%) пациенток. Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся всем пациенткам. При морфологической оценке ооцитов и эмбрионов при внутригрупповом сравнении различий не установлено. Так, удачный исход: число ооцитов 6,0 [5,0; 8,0], число эмбрионов — 3,0 [1,0; 5,0], эмбрионы хорошего качества — 3,0 [1,0; 5,0]; неудачный исход: число ооцитов — 6,0 [4,0; 9,0], число эмбрионов — 3,0 [2,0; 4,0], эмбрионы хорошего качества — 3,0 [2,0; 3,0], что в целом не различалось при внутригрупповом сравнении (p>0,05).

При межгрупповом сравнении качественно-количественные характеристики были снижены: число ооцитов — 5,0 [3,0; 7,0], число эмбрионов — 2,0 [1,0; 3,0], эмбрионы хорошего качества — 1,0 [1,0; 2,0]. Беременность наступила у 6 (19,4%) женщин, число живорожденных — 6 детей. Положительных исходов у пациенток с гиперплазией эндометрия не было. При исследовании ферментной системы у пациенток с сочетанными формами бесплодия уровень ММП-1 составлял 1,3 [1,2; 1,6] нг/мл; 95% ДИ 1,5—2,2 (среднее значение — 1,6 [1,3; 6,9]; 95% ДИ 1,8—7,8) [25]. Низкие уровни ММП-1 объясняются патогенетически обусловленной гиперэстрогенемией, которая подавляет экспрессию металлопротеиназ [14, 15]. Уровень ТИМП-1 в ФЖ: с удачными исходами — 2400—2450 нг/мл, с неудачными — 2550 [2550; 2775] нг/мл (95% ДИ 1015,1—4057,1 нг/мл; p<0,01), достигая 2694 нг/мл и более у пациенток с гиперплазией эндометрия. В результате исследования доказано, что с возрастом происходит увеличение уровня ТИМП-1 в ФЖ (r=0,6; 95% ДИ 1984,8—3035,2 нг/мл; p<0,05). При увеличении длительности бесплодия также достоверно увеличивается уровень ТИМП-1 (r=0,2; 95% ДИ 1534,5—3158,2 нг/мл; 95% ДИ 1440,8—3308,8 нг/мл; p<0,05) [25]. Полученные положительные результаты у 2 пациенток в возрасте 38 лет можно объяснить тем, что у них имелось первичное бесплодие длительностью менее 4 лет и не проводились хирургические операции на репродуктивных органах (уровень ТИМП-1 2450 нг/мл). Из 5 пациенток в возрасте 35,8±0,2 года с неудачным исходом у 4 также было первичное бесплодие с длительностью до 4 лет, хирургические вмешательства выполнены за 2 года до момента проведения программы ВРТ (уровень ТИМП-1 2550—2590 нг/мл). При этом у пациенток с гиперплазией эндометрия без атипии в возрасте 32,2±0,9 года и вторичным бесплодием длительностью от 5 до 10 лет и более, наличием патологических беременностей, экстрагенитальной, гинекологической патологии, оперативными вмешательствами, проведенными более 2 лет назад от момента вхождения в программы ВРТ (p<0,05), достоверно увеличивается уровень ТИМП-1 в ФЖ (2694 нг/мл и выше), что приводит к склерозированию стромы яичников, нарушению фолликулогенеза и влияет на исход лечения бесплодия [16, 18, 19, 25]. Таким образом, повышенные уровни ТИМП-1 подавляют активность ММП-1 и приводят к увеличению массы коллагеновых волокон, что служит биомаркером развития фиброзно-склеротических процессов и отражает тяжесть дисфункции эндотелия с выраженным иммунным воспалительным ответом [16]. При исследовании ФЖ методом клиновидной дегидратации у пациенток без гиперплазии эндометрия выявлен 3-й тип (реактивный) фаций (рисунок), однако у пациенток с неудачными исходами в фациях выявляются маркеры, указывающие на нарушение перфузии органа («трехлучевых» в центральной зоне; ОШ 10,4; 95% ДИ 4,6—23,1), выраженные ишемическо-гипоксические проявления («жгутовые» трещины; ОШ 3,7; 95% ДИ 1,7—7,9), наличие напряженного состояния компенсации (трещины «закрутка»; ОШ 3,9; 95% ДИ 0,2—66,7). У пациенток с гиперплазией эндометрия в анамнезе установлен 4-й (хаотичный) тип фаций (см. рисунок) и выявляются маркеры, указывающие на нарушение эластичности сосудов (дисфункция эндотелия, «дуговые» трещины в фациях 4-го типа (ОШ 4,1; 95% ДИ 1,9—8,5) и ангиоспазм («гребешковые трещины»; ОШ 23,8; 95% ДИ 13,6—41,5). В хаотичном типе фаций выявлен маркер склерозирования сосудов — «листовидные структуры» (27,1%). Наличие маркеров коррелирует с уровнями ТИМП-1 в ФЖ (r=0,7). Чем выше уровень ТИМП-1 (2694 нг/мл и более), тем больше маркеров, указывающих на деструктивные изменения в яичниковой ткани, тем меньше шансов на наступление беременности в программах ВРТ.

Типы фаций пациенток с сочетанным генезом бесплодия, полученные в ходе исследования методом клиновидной дегидратации, ув. 80.

1-й тип — нормотип (показан для сравнения); 3-й тип — реактивный тип фаций; 4-й тип — хаотичный тип фаций.

Заключение

У пациенток с сочетанными факторами бесплодия (миома матки в сочетании с эндометриозом) в возрасте 36 [32; 38] лет, с вторичным бесплодием, длительностью более 4 лет, наличием патологических беременностей, экстрагенитальной и гинекологической патологии (с гиперпластическими процессами в эндометрии в анамнезе), оперативными вмешательствами на репродуктивных органах в анамнезе, статистически значимо (p<0,05) увеличивается уровень ТИМП-1 (2694 нг/мл и более) в ФЖ и выявляются маркеры, указывающие на деструктивные изменения в яичниковой ткани (склерозирование сосудов, ангиоспазм и дисфункция эндотелия), что снижает шансы на наступление беременности в программах ВРТ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.А. Маринова

Сбор и обработка материала — О.А. Маринова

Статистическая обработка — О.А. Маринова

Написание текста — О.А. Маринова

Редактирование — Л.И. Трубникова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of the authors:

Concept and design of the study — O.A. Marinova

Data collection and processing — O.A. Marinova

Statistical processing of the data — O.A. Marinova

Text writing — O.A. Marinova

Editing — L.I. Trubnikova

Authors declare lack of the conflicts of interests.