Мелатонин (МТ) — это гормон, который имеет четкий циркадианный профиль секреции. Он секретируется в темное время суток, а яркий свет, в том числе искусственный, подавляет его секрецию. Основная функция этого гормона — перевод нашего организма в ночной режим работы [1].

Несмотря на то что неоднократно изучалось влияние приема фармакологических препаратов МТ на засыпание и архитектуру сна, до сих пор мало изучено влияние качества сна и его нарушений на секрецию эндогенного МТ.

Ранее нами был показан рост секреции МТ на фоне экспериментальной фрагментации ночного сна [2]. Причем он наблюдался во время нарушения и ортодоксальной (медленной), и парадоксальной (быстрой) фаз сна [3]. Однако механизмы, приводящие к этому повышению, неясны. Известно, что синтез МТ контролируется паравентрикулярными ядрами гипоталамуса, проецирующимися на преганглионарные симпатические нейроны первого грудного сегмента спинного мозга. Далее проекции постганглионарных симпатических нейронов верхнего шейного ганглия достигают эпифиза. Норадреналин, выделяемый симпатическими терминалями в эпифизе, запускает синтез МТ. При этом адренергические рецепторы пинеалоцитов активируют N-ацетилтрансферазу (арилалкиламин-N-ацетилтрансфераза — AANAT), которая превращает серотонин в N-ацетилсеротонин — прекурсор МТ [1].

Известно, что активность симпатического отдела автономной нервной системы (АНС) по мере засыпания снижается, сменяясь преобладанием парасимпатического отдела, и наиболее низкая симпатическая активность характерна для самой глубокой, 3-й, стадии сна. Парадоксальный сон, напротив, характеризуется высокой симпатической активацией [4]. Поэтому можно предположить, что если стимуляция секреции МТ на фоне фрагментации сна вызвана усилением симпатической активации и норадренергической стимуляцией, то нарушение 3-й стадии сна должно приводить к наиболее выраженному повышению концентрации этого гормона.

Помимо норадреналина, другие нейротрансмиттеры тоже обнаруживаются в эпифизе и, по-видимому, участвуют в тонкой регуляции его секреции. В частности, серотонин оказывает модулирующее влияние на секрецию МТ [5]. После адренергической стимуляции пинеалоцитов серотонин индуцирует AANAT и усиливает секрецию МТ [6].

Известно, что серотонинергическая система высокоактивна в бодрствовании, постепенно снижает свою активность по мере засыпания и перехода в глубокий сон, но самый низкий уровень ее активности характерен для парадоксального сна [7]. Соответственно, если повышение секреции МТ на фоне фрагментации сна вызвано усилением серотонинергической модуляции, то можно предположить, что к наиболее выраженному повышению концентрации МТ будет приводить нарушение парадоксального сна.

Внешние стимулы, если они достаточно интенсивны, чтобы помешать спать, вызывают реакции активации (англ.: arousal) — краткие интрузии в сон бодрствования или поверхностного сна. Активации, возникающие в ортодоксальной фазе сна, сопровождаются резким всплеском симпатических влияний [8]. Во время парадоксального сна уровень активности симпатического отдела АНС и так очень высок, поэтому активации в этой фазе сна не приводят к изменениям вегетативного баланса. Зато они сопровождаются выраженным ростом активности серотонинергической системы, в частности нейронов дорсальных ядер шва [9].

Поэтому в настоящей работе мы попытались ответить на вопрос, что именно приводит к росту МТ при нарушениях сна — усиление симпатической активации или повышение активности серотонинергической системы.

Цель исследования — сравнить влияние на секрецию МТ фрагментации 3-й стадии и парадоксальной фазы ночного сна, а также оценить эффекты изменений вегетативного баланса и реакций активации, возникающих в ортодоксальной и парадоксальной фазах сна.

Материал и методы

В исследовании участвовали 15 здоровых добровольцев мужчин в возрасте от 19 до 27 лет. При наборе участников проводили анкетирование с целью оценки соматического и психического здоровья, режима сна и бодрствования и продолжительности ночного сна.

Критерии включения: здоровые добровольцы, мужчины.

Критерии невключения: острые или хронические заболевания, прием любых медикаментов, алкогольная или наркотическая зависимость, работа со сменным графиком, отсутствие регулярного режима сна и бодрствования, расстройства сна, перелеты со сменой часовых поясов в течение последнего месяца, кровоточивость десен и заболевания полости рта.

Все участники исследования имели регулярный цикл сна—бодрствования с длительностью ночного сна около 8 ч со временем отхода ко сну — 23.00—00.00 и временем подъема — 07.00—08.00 соответственно в течение последних 4 нед перед экспериментом. В целях объективного контроля индивидуального режима сна в течение недели до начала эксперимента испытуемые носили фитнесс-трекер (Xiaomi Mi Band) и вели дневник сна. За 1 сут перед участием в эксперименте им рекомендовали воздержаться от употребления алкоголя, кофе, чая, шоколада. Перед началом эксперимента испытуемые были осведомлены о предмете и процедуре исследования и подтверждали свое добровольное участие подписанием Информированного согласия. По завершении каждого эксперимента они получали денежное вознаграждение (1000 руб.).

Каждый из 15 испытуемых участвовал в трех ночных экспериментах: с фрагментацией 3-й стадии ортодоксального сна, фрагментацией парадоксального сна, и в контрольном, в котором сон не нарушался. Соблюдался строгий контрбаланс в чередовании экспериментов у всех участников исследования. Каждый испытуемый прибывал в лабораторию сна в 19.45 вечера и оставался до 09.00 утра. В 20.00 верхний свет в лаборатории выключали, уменьшали яркость экранов компьютеров, и до отхода ко сну участники исследования находились в условиях приглушенного освещения (<10 люкс) для того, чтобы свет не препятствовал вечернему выделению МТ. В лаборатории испытуемые проводили время за выполнением компьютерных психодиагностических тестов, чтением, беседами с сотрудниками института, интенсивная физическая активность исключалась. Ночью испытуемые спали в течение 8 ч, с 23.00 до 07.00, в специально оборудованной для сна комнате в полной темноте (0 люкс). Во время сна регистрировали полисомнограмму (ПСГ): 19 каналов электроэнцефалограммы (ЭЭГ) по международной системе 10-20, электрокардиограмму (ЭКГ), электромиограмму и два канала окулограммы. Регистрацию ПСГ проводили с помощью энцефалографов Энцефалан-EEGR-19/26 («Медиком», Таганрог, Россия) и Нейровизор БММ-36 (ООО «Медицинские Компьютерные Системы», Москва, Россия) с частотой дискретизации 250 Гц. ЭКГ регистрировали во втором отведении. По ПСГ отслеживали фазы и стадии сна. При наступлении 3-й стадии (в экспериментах с фрагментацией 3-й стадии сна) либо парадоксального сна (в экспериментах с фрагментацией парадоксальной фазы) подавали звуки нарастающей интенсивности до появления альфа-ритма или признаков перехода в поверхностный сон.

В каждом эксперименте вечером, ночью и утром собирали 7 проб слюны: в 20.00, 21.30, 23.00, 01.30, 04.00, 07.00 и 07.40. Слюну собирали в пробирки SaliCaps объемом 2 мл, забор одной пробы занимал в среднем 2 мин. Для сбора ночных проб испытуемых осторожно будили, слюна собиралась при выключенном свете (0 люкс), длительность пробуждения для взятия ночной пробы составляла в среднем 5 мин. Первая утренняя проба в 7.00 также собиралась в темноте. После ее сбора включали верхний свет (100 люкс), и последняя утренняя проба собиралась после 40 мин пребывания на свету. Эти 40 мин испытуемый проводил в лаборатории — после умывания выполнял компьютерные психодиагностические тесты, интенсивная физическая активность исключалась. Пробы замораживали и хранили при –60 °C. Далее с помощью тандемной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS/MS) в пробах оценивали содержание МТ. Анализ проводили в лаборатории «Клиники новых медицинских технологий АрхиМед».

По ЭКГ анализировали показатели вариабельности сердечного ритма и оценивали баланс АНС вечером перед отходом ко сну, во время 3-й стадии сна, во время парадоксального сна и утром после пробуждения. При этом с помощью программы HRVanalysis [10] вычисляли следующие показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС), среднее значение RR-интервалов и их стандартное отклонение, спектральную мощность модуляции сердечного ритма в высоком (ВЧ, 0,15—0,40 Гц) и низком (НЧ, 0,04—0,15 Гц) частотных диапазонах, а также соотношение НЧ/ВЧ, являющееся показателем баланса симпатических и парасимпатических влияний на сердечный ритм.

ПСГ разбивали на 30-секундные эпохи и независимо друг от друга анализировали два эксперта в соответствии со стандартными критериями [11] и с учетом поправок Американской академии медицины сна [12]. Вычисляли латентный период засыпания, общую длительность сна, общую продолжительность ночных пробуждений, длительность парадоксального сна и 1, 2 и 3-й стадий ортодоксального сна. В каждой ПСГ подсчитывали также количество активаций отдельно для ортодоксальной и парадоксальной фаз сна в соответствии с критериями Американской академии медицины сна [12]. Количество активаций ортодоксальной и парадоксальной фаз относили к общей длительности сна. В каждом эксперименте с фрагментацией подсчитывали также количество звуков, предъявлявшихся для нарушения сна.

Протокол исследования был составлен в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации и одобрен Этической комиссией ИВНД и НФ РАН. Все испытуемые подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ проводили в программе Statistica 10 («Stat Soft. Inc.», Талса, Оклахома, США). Для оценки нормальности распределения полученных данных применяли критерий Колмогорова—Смирнова. Выраженности эффектов фрагментации глубокого и парадоксального сна оценивали с помощью непараметрического теста Фридмана для повторных измерений (ANOVA Фридмана). Для апостериорного анализа использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Для проверки однородности исследованной выборки испытуемых применяли метод иерархического кластерного анализа. В иерархическом кластерном анализе в качестве меры расстояния в n-мерном пространстве использовалось так называемое манхэттенское расстояние, а в качестве правила объединения или связи для двух кластеров — метод Варда. Сравнение двух групп испытуемых, полученных в результате кластерного анализа, проводили по критерию Манна—Уитни. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Анализ содержания МТ в вечерних пробах слюны не выявил каких-либо различий между экспериментами, указывая на то, что состояние участников исследования в начале всех трех экспериментов было сходным и не могло повлиять на показатели (рис. 1, а). Анализ ночных и утренних проб показал, что фрагментация сна, как правило, приводила к повышению секреции этого гормона. В соответствии с тестом Фридмана значимые различия были выявлены в 07.00 сразу после утреннего пробуждения (χ2 (N=15, df=2)=12,24, p=0,002); апостериорный анализ с помощью критерия Вилкоксона показал, что и после ночного сна с фрагментацией 3-й стадии и после ночного сна с фрагментацией парадоксальной фазы концентрация МТ была выше, чем в контрольном эксперименте (p=0,014 и p=0,005 соответственно), причем после фрагментации парадоксального сна МТ был в 1,8 раза выше, чем в контроле (21,6 пг/мл, в контроле — 12,1 пг/мл), и в 07.40 все еще оставался повышенным (χ2 (N=15, df=2)=7,00 p=0,030; в соответствии с апостериорным анализом p=0,012 по сравнению с контролем и p=0,017 по сравнению с экспериментом с фрагментацией 3-й стадии).

Рис. 1. Влияние фрагментации сна на концентрацию МТ в слюне, вегетативный баланс и показатели архитектуры сна.

а — значения концентрации МТ в пробах слюны в контрольном эксперименте (сплошная линия), эксперименте с фрагментацией 3-й стадии сна (прерывистая линия) и эксперименте с фрагментацией парадоксального сна (точки), на оси абсцисс — время сбора слюны; б — соотношение спектральной мощности низких и высоких частот кардиоинтервалограммы НЧ/ВЧ. На оси абсцисс — время регистрации ЭКГ: БВ — бодрствование вечером; 3С — 3-я стадия сна; ПС — парадоксальный сон; БУ — бодрствование утром. На а и б обозначена ошибка среднего; в — показатели архитектуры сна в контрольном эксперименте и экспериментах с фрагментацией 3-й стадии и парадоксального сна. По оси ординат: продолжительность (в минутах): 3-й стадии сна (верхняя панель), парадоксального сна (средняя панель), пробуждений (нижняя панель). К — контроль, Ф3С — фрагментация 3-й стадии сна, ФПС — фрагментация парадоксального сна. На графике обозначены ошибка среднего и стандартное отклонение. ^# — различия значимы между контролем и экспериментом с фрагментацией 3-й стадии сна; * — различия значимы между контролем и экспериментом с фрагментацией парадоксального сна; ^& — различия значимы между экспериментом с фрагментацией 3-й стадии сна и фрагментацией парадоксального сна. Различия считались значимыми при p<0,05.

Анализ ЧСС и результатов вариационной пульсометрии показал, что вечерние и утренние значения ЧСС и показателей баланса АНС были сходными во всех экспериментах (рис. 1, б). Фрагментация 3-й стадии приводила к значимому росту соотношения НЧ/ВЧ, что указывает на усиление симпатической активации (χ2 (N=15, df=2)=10,13, p=0,006; p=0,006 по отношению к контролю и p=0,003 по отношению к эксперименту с фрагментацией парадоксального сна). Фрагментация парадоксального сна не оказала значимого влияния на сердечный ритм.

Анализ ПСГ показал, что фрагментация как 3-й стадии, так и парадоксального сна сопровождалась многочисленными реакциями активации, т.е. появлением α-ритма или активности, характерных для неглубокого сна (1-й или 2-й стадии), вместе с усилением мышечного тонуса. В результате фрагментации 3-я стадия сократилась на 50% (p<0,001), а парадоксальная фаза — на 51% (p<0,001) в соответствующих экспериментах (рис. 1, в). При этом нарушение 3-й стадии не повлияло на общую продолжительность ночных пробуждений, тогда как в результате фрагментации парадоксальной фазы она значимо увеличилась (p<0,001 и p=0,002 по отношению к контролю и к ночи с фрагментацией 3-й стадии соответственно), несмотря на то, что среднее количество звуков, предъявлявшихся для нарушения быстрого сна (N=471,21), было несколько меньше, чем количество звуков в экспериментах с нарушением 3-й стадии (N=995,14), различия значимы на уровне тенденции (p=0,064). В экспериментах с фрагментацией 3-й стадии относительное количество активаций в ортодоксальной фазе сна (деленное на общее время сна) выросло с 0,11 до 0,20 (p<0,001), а в экспериментах с фрагментацией парадоксального сна в этой фазе количество активаций увеличилось с 0,09 до 0,16 (p<0,001).

Поскольку была обнаружена значительная индивидуальная вариабельность концентраций МТ в слюне, особенно заметная во второй половине ночи и утром, был проведен анализ однородности выборки испытуемых. Для этого нами применен метод иерархического кластерного анализа, используя девять параметров — значения концентрации МТ в трех последних пробах (04.00, 07.00 и 07.40) в трех экспериментах (в контроле и двух экспериментах с фрагментацией). В иерархическом кластерном анализе в качестве меры расстояния в 9-мерном пространстве использовалось так называемое манхэттенское расстояние, а в качестве правила объединения или связи для двух кластеров — метод Варда. Применение этого метода позволило построить дендрограмму, в которой расположенные рядом испытуемые обладали близкими характеристиками и расстояние до разделяющего их разветвления было небольшим.

В итоге были выделены две группы (кластера) испытуемых: 10 и 5 человек. Несмотря на то что концентрация МТ в вечерних пробах не различалась между группами, для 2-го кластера оказался характерен значительно более высокий МТ в ночных и утренних пробах (по критерию Манна—Уитни p=0,007, p=0,014, p=0,020 и p=0,007 для проб, взятых в контрольном эксперименте в 01.30, 04.00, 07.00 и 07.40, соответственно; p=0,049, p=0,020, p=0,007 и p=0,010 для ночных и утренних проб, взятых в эксперименте с фрагментацией 3-й стадии; p=0,057, p=0,002, p=0,002 и p=0,014 для ночных и утренних проб, взятых в эксперименте с фрагментацией парадоксального сна, рис. 2, а). Второй кластер отличался также более выраженным подъемом концентрации МТ в ответ на фрагментацию сна. Нарушение парадоксального сна приводило к значимому росту МТ в 04.00 (в соответствии с критерием Вилкоксона p=0,043 по отношению к фрагментации 3-й стадии), в 07.00 (p=0,043 по отношению и к контролю, и к фрагментации 3-й стадии), отмечена тенденция к его росту в 07.40 (p=0,080 по отношению к контролю). Нарушение 3-й стадии приводило к подъему МТ в 07.00 (p=0,043 по отношению к контролю). В 1-м кластере была выявлена только тенденция к росту концентрации МТ в экспериментах с фрагментацией сна в 07.00 (в соответствии с критерием Вилкоксона p=0,066 в эксперименте с фрагментацией 3-й стадии и p=0,058 в эксперименте с фрагментацией парадоксального сна).

Рис. 2. Концентрация МТ в слюне, длительность ночных пробуждений и активации в парадоксальном сне в двух группах испытуемых с высоким и низким уровнями МТ.

а — значения концентрации МТ в пробах слюны в двух группах испытуемых, выделенных посредством кластерного анализа, на графике обозначена ошибка среднего; б — сравнение продолжительности ночных пробуждений (в минутах) в двух группах испытуемых в контрольном эксперименте и экспериментах с фрагментацией 3-й стадии и парадоксального сна; в — сравнение относительного количества активаций в парадоксальном сне (деленного на общее время сна) в двух группах испытуемых в контрольном эксперименте и экспериментах с фрагментацией 3-й стадии и парадоксального сна. На графиках б и в обозначена ошибка среднего и стандартное отклонение. 1-й кластер — испытуемые с низкой концентрацией МТ в ночных и утренних пробах слюны, 2-й кластер — с высокой концентрацией. @ — различия между группами значимы. Остальные обозначения — как на рис. 1.

Анализ ЧСС и вариабельности сердечного ритма не выявил значимых различий между этими двумя группами испытуемых. Однако были обнаружены достоверные различия между ними по ряду показателей архитектуры сна. Так, общая длительность ночных пробуждений была значительно больше у испытуемых 2-го кластера во всех трех экспериментах: в контроле — в 1,9 раза, с фрагментацией 3-й стадии — в 1,7 раза и с фрагментацией парадоксального сна — в 2 раза (p=0,019, p=0,026 и p=0,039 соответственно, рис. 2, б).

Латентность сна во 2-м кластере также оказалась значимо больше во всех трех экспериментах (p=0,049 для контрольного эксперимента, p=0,037 для эксперимента с фрагментацией 3-й стадии и p=0,043 для эксперимента с фрагментацией парадоксального сна). При этом общее время сна во 2-м кластере было ниже, чем в 1-м. Значимые различия обнаружены в контрольном эксперименте (p=0,021), а также в эксперименте с фрагментацией парадоксального сна (p=0,019).

Анализ активаций показал, что их количество в ортодоксальном сне было сходным в двух кластерах испытуемых. Однако количество активаций в парадоксальном сне оказалось различным — во 2-м кластере в экспериментах с фрагментацией их было значимо больше, чем в 1-м (рис. 2, в), причем большее количество активаций было обнаружено в эксперименте не только с фрагментацией парадоксальной фазы (в 1,5 раза, p=0,031), но и с нарушением 3-й стадии сна (в 1,8 раза p=0,026).

Обсуждение

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагментация сна приводит к росту содержания МТ в слюне. Причем фрагментация парадоксального сна вызывает более выраженное усиление секреции этого гормона, чем фрагментация самой глубокой, 3-й, стадии сна.

Поскольку синтез МТ запускается норадреналином, выделяемым симпатическими терминалями нейронов верхнего шейного ганглия [1], сначала мы предположили, что рост МТ на фоне фрагментации сна может вызываться повышением симпатической активации. Однако выраженные сдвиги вегетативного баланса в сторону преобладания симпатического отдела АНС были выявлены только в эксперименте с нарушением 3-й стадии, и не были отмечены при фрагментации парадоксального сна. Это позволяет заключить, что усиление секреции МТ не связано с норадренергической стимуляцией и, по-видимому, объясняется усилением активности серотонинергической системы, сопровождающим нарушение глубины и непрерывности сна.

Полученные результаты указывают на то, что более выраженный рост МТ при фрагментации парадоксального сна может быть связан с большей продолжительностью ночных пробуждений, отмеченной в этих экспериментах. Причем при фрагментации этой фазы сна увеличение общей длительности эпизодов бодрствования — состояния, когда серотонинергическая система высокоактивна, — происходит за счет времени парадоксального сна, когда эта система неактивна [7], и, следовательно, может приводить к более выраженному усилению серотонинергической стимуляции секреции МТ в эпифизе, чем при нарушении ортодоксального сна. Конечно, при условии, что нарушение сна производится в темноте. Следует отметить, что различие в общей продолжительности пробуждений в двух типах экспериментов с фрагментацией было вызвано прежде всего методическими особенностями экспериментальной фрагментации этих стадий сна: если нарушение 3-й стадии сна обычно приводит к переходу в более поверхностную, 2-ю, стадию сна, то нарушение быстрого сна часто сразу вызывает переход в бодрствование. Сама же степень нарушения сна в экспериментах с фрагментацией быстрой фазы была даже несколько ниже, чем при фрагментации 3-й стадии, по крайней мере, если судить по количеству пробуждающих звуков (995,14 — в экспериментах с фрагментацией 3-й стадии и 471,21 — в экспериментах с фрагментацией парадоксального сна, p=0,064).

На связь секреции МТ с активностью серотонинергической системы указывают и различия, выявленные нами между двумя кластерами испытуемых, характеризовавшихся разным уровнем ночного и утреннего МТ. Лица с высокой концентрацией МТ в ночных и утренних пробах слюны, вошедшие во 2-й кластер, значимо позже засыпали, бодрствовали ночью в течение более длительного времени и имели менее продолжительный сон. И поскольку эти особенности наблюдались не только в экспериментах с фрагментацией сна, но также и в контроле, они могут указывать на нарушения сна инсомнического характера. Интересно, что у этих испытуемых выявлено большее количество активаций в парадоксальной фазе сна, чем у испытуемых из 1-го кластера. Причем их оказалось значимо больше не только на фоне фрагментации этой фазы сна, но также и в экспериментах с фрагментацией 3-й стадии сна, когда парадоксальный сон не нарушался. Согласно данным литературы, активации, возникающие во время парадоксального сна, приводят к резкому усилению активности нейронов ядер шва — центров серотонинергической системы [9]. Соответственно, можно предположить, что высокий уровень ночного и утреннего МТ испытуемых 2-го кластера может объясняться нарушением непрерывности ночного сна, и, прежде всего, его парадоксальной фазы.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагментация ночного сна вызывает рост секреции МТ, причем он особенно сильно выражен при фрагментации парадоксальной фазы сна. Повышение уровня МТ при фрагментации сна не зависит от изменений вегетативного баланса. Поскольку известно, что серотонин потенцирует секрецию МТ в эпифизе, можно заключить, что рост концентрации МТ при фрагментации сна связан с повышением активности серотонинергической системы, сопровождающей нарушение глубины и непрерывности сна.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда проект РНФ №23-28-01742.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.