Введение
Одним из фундаментальных свойств всех биологических процессов является ритмичность — формирующаяся в ходе эволюции модель приспособления к периодически меняющимся условиям окружающей среды, проявляющаяся в виде повторяющихся закономерных изменений характера и выраженности биохимических, морфологических и физиологических процессов на всех уровнях организации живой материи. Ритмы с разной периодичностью характерны для разных биологических систем. У млекопитающих, независимо от образа жизни, деятельность систем организма так или иначе зависит от цикла дня и ночи, и для них циркадные ритмы с периодом около 24 ч — один из наиболее значимых типов биоритмов [1]. Элементы хроноструктуры организма существуют в строго согласованном динамическом равновесии, что позволяет поддерживать гомеостаз и оптимальный уровень приспособляемости. Если этот баланс нарушается влиянием каких-либо внешних или внутренних факторов, прогрессирующее рассогласование ритмов организма между собой и с ритмами окружающей среды (десинхроноз) провоцирует развитие ряда патологий [2].
Одно из наиболее значимых мест в хроноструктуре организма млекопитающих принадлежит взаимодействию супрахиазматических ядер гипоталамуса и шишковидной железы. Последняя, будучи наиболее значимым циркадным водителем ритма, одновременно является основным звеном реализации циркадных сигналов. Продукция мелатонина, основного гормона шишковидной железы, имеет выраженную суточную периодичность, строго зависящую от режима освещенности [3].
Мелатонин действует как адаптирующий сигнал к циклу света и темноты для систем организма и сам является адаптогеном широкого спектра действия [4—10]. В свою очередь снижение содержания мелатонина в крови шишковидной железы или его отсутствие — основа развития ряда патологий, в том числе онкологических [11, 12], поскольку мелатонин обладает широким спектром противоопухолевых эффектов (прямые внутриклеточные антиканцерогенные свойства; участие в регуляции онкогенов и генов-супрессоров; ингибирующие свойства в отношении малигнизации клеток, метастазирования и неоангиогенеза; противоопухолевое иммуностимулирующее действие; антиоксидантная активность и ингибирующая активность в отношении роста опухолевых клеток) в отношении ряда новообразований [13—16]. Это также становится причиной повышенного интереса к мелатонину как потенциальному противоопухолевому терапевтическому средству, полный спектр действия которого на опухолевые клетки еще не установлен [17].
Имеется ряд сообщений о том, что дефицит мелатонина и нарушение структуры циркадных ритмов организма в результате светового загрязнения являются одними из факторов, вызывающих развитие меланомы кожи — распространенной, опасной злокачественной опухоли с непредсказуемым клиническим течением, которая характеризуется быстрым ростом и ранним образованием метастазов [18—21].
Ранее нами был проведен ряд патоморфологических, гистологических, иммуногистохимических, ультраструктурных исследований [22, 23], которые показали, что при подавлении синтеза мелатонина в условиях хронической темновой депривации меланома B16 демонстрирует ускоренный опухолевый рост и распространение опухоли за счет усиления пролиферации клеток меланомы, развитие выраженных вторичных изменений, наличие периваскулярного роста и усиление периневральной инвазии в сочетании с выраженной эмбрионизацией клеток меланомы, показанное с помощью электронной микроскопии, что свидетельствует о высокой агрессивности опухоли и быстром ее прогрессировании до метастатических стадий [24]. Нами также были продемонстрированы изменения в экспрессии часовых генов при меланоме, которые подтвердили, что постоянное освещение или темнота вызывают нарушение хроноструктуры опухолевых клеток. Светооптическое исследование опухолевых тканей животных, содержавшихся в условиях постоянной темноты, показало достоверное снижение интенсивности пролиферативного процесса в опухоли и регрессию опухоли при отсутствии признаков лимфо-, внутрисосудистой и интраневральной инвазии.
Для получения комплексной морфологической характеристики опухолей животных, содержащихся в постоянной темноте, нам представлялось актуальным исследовать ультраструктурную картину клеток меланомы животных, содержавшихся в постоянной темноте.
Материал и методы
Объект исследования
Исследование проведено на гибридных мышах-самцах BDF1 8-недельного возраста (n=50) массой тела 21—22 г, полученных из вивария «Группы скрининга и доклинических исследований» ФГБУ «Федеральный исследовательский центр проблем химической и медицинской химии РАН». Выбор этой линии животных вместо мышей C57BL6 (обычно используемых для изучения меланомы) для исследования, где ожидаются мелатонин-опосредованные эффекты, обусловлен тем, что последние, по данным литературы, обнаруживают дефектную продукцию как пинеального, так и экстрапинеального мелатонина [25, 26]. Лабораторное содержание животных и все экспериментальные процедуры были стандартными и проводились в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Серия исследований меланомы, к которой относится данный этап, одобрена Биоэтическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека», протокол №34 (10) (14 марта 2022 г.).
Дизайн исследования
В исследовании использовались две равные группы мышей.
Животные контрольной группы (n=25) содержались в условиях фиксированного светового режима с применением искусственного освещения люминесцентными лампами (10:14 ч, при этом свет включался в 8:00 и выключался в 18:00). Опытная группа (n=25) содержалась в условиях постоянной темноты.
Интенсивность света на единицу площади клетки составляла 150 лк, что соответствует требованиям российских санитарных норм по освещению производственных помещений.
Образцы культуры клеток меланомы B16/F10 трансплантированы сотрудниками Группы экспериментальной химиотерапии опухолей отделения кинетики химических и биологических процессов Института проблем химической физики РАН (Черноголовка).
Образцы суспензии клеток меланомы B16/F10 по 0,5 мл в среде 199 в разведении 1:10 по массе вводили подкожно в область левого бока ближе к спине каждого животного иглой 1,2×40 после анестезии диэтиловым эфиром по стандартной методике [27—30].
Пальпируемые опухоли в обеих группах выявлялись на 7—8-е сутки.
Убой животных путем дислокации шейных позвонков с последующей немедленной эвисцерацией осуществляли на 15-е сутки после трансплантации меланомы в одинаковые циркадные моменты времени (9:00, 15:00, 21:00 и 03:00) для каждой группы.
Производили измерения длины, ширины и высоты опухолей, определяли массу животных и опухолей. Объем опухоли рассчитывали по формуле:
V=π/6·D1·D2·D3,
где D1 — длина, D2 — ширина и D3 — высота опухоли в сантиметрах.
Методы трансмиссионной электронной микроскопии
Образцы ткани меланомы объемом 2 мм3 фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), дополнительно фиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия (OsO4), обезвоживали в этаноле, с включением стадии дополнительного контрастирования образца 1% раствором уранилацетата в 70% этаноле в процессе обезвоживания и фиксировали в смеси эпон-аралдит по стандартной схеме.
Ультратонкие срезы тканей изготавливали на ультрамикротоме LKB-III («LKB Produkter», Швеция); срезы дополнительно контрастировали с помощью окраски цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX (JEOL, Япония).
Электронограммы препаратов ×6700, ×8000, ×10 000, ×14 000, ×20 000 и ×40 000 получали с помощью камеры Gatan ES500W Erlangshen (модель 782) («Gatan Inc.», США). Оценивали морфологическое состояние органелл клеток меланомы B16, в том числе форму их ядер.
Результаты
Влияние различных световых режимов на массу тела животных, массу и объем опухоли
В результате исследования установлено, что при постоянном воздействии темноты достоверных изменений массы тела животных по сравнению с контролем не происходит, но масса опухоли снижается до 3,25±0,28 г, что меньше, чем в контрольной группе — 4,98±0,27 г опухолевой массы; объем опухоли также достоверно ниже — 4,35±0,27 см3.
Ультраструктура клеток трансплантируемой злокачественной меланомы B16 в условиях фиксированного светового режима
В образцах меланомы B16 животных, содержавшихся при фиксированном световом режиме, наблюдалась ткань, состоящая из эпителиоидных клеток, в основном сохранившихся, но с некоторой тенденцией к потере контакта между соседними клетками (рис. 1, а). Клетки имели диаметр 20—25 мкм, форму неправильную, веретенообразную или округлую в участках с высокой митотической активностью. Клетки меланомы этой группы характеризовались сравнительно небольшим количеством митохондрий со светлым матриксом и небольшим количеством крист, хорошо развитым комплексом Гольджи, большим содержанием рибосом и лизосом, большим количеством вакуолей (в том числе липидсодержащих) в цитоплазме и умеренным содержанием меланина. Ядра клеток были крайне неправильной формы, с глубокими впячиваниями мембран, электронно-плотной нуклеоплазмой, одним или двумя крупными ядрышками и бугристыми краевыми конденсациями хроматина (рис. 1, б).
Рис. 1. Ультраструктура клеток трансплантируемой злокачественной меланомы B16 в условиях фиксированного светового режима.
Ядра неправильной формы с комковатой краевой конденсацией хроматина. Трансмиссионно-электронная микроскопия ×14 000.
Цитоплазма клеток меланомы и межклеточное пространство содержали гетерогенные меланосомы — зрелые электронно-плотные и полупрозрачные премеланосомы (рис. 2, а). Меланосомы были распространены преимущественно диффузно, однако встречались как развивающиеся, так и зрелые меланосомные комплексы сферической формы (рис. 2, б, в).
Рис. 2. Меланосомы разной степени зрелости (а); развивающиеся (б) и зрелые (в) меланосомные комплексы в клетках трансплантируемой злокачественной меланомы B16 под воздействием фиксированного светового режима.
Трансмиссионно-электронная микроскопия, ×20 000 (а); ×6700 (б); ×14 000 (в).
В отдельных участках опухоли наблюдались единичные случаи некротической и апоптотической (с маргинализацией конденсированного хроматина с последующим образованием микроядер, конденсированной цитоплазмы) гибели клеток. При этом в тканях меланомы B16 этой группы наличие воспалительного инфильтрата отмечалось лишь в единичных случаях.
Ультраструктура клеток трансплантируемой злокачественной меланомы B16 в условиях постоянной темноты
Ультраструктурные характеристики перевиваемой меланомы B16 животных, содержавшихся в условиях отсутствия освещения, имеют ряд заметных отличий от контроля (см. таблицу).
Различия ультраструктурных характеристик меланомы B16 под влиянием разных режимов освещения
| Параметр | Фиксированный свет (контроль) | Постоянная темнота |
| Форма ядра | Неправильная | Округлая или удлиненная, преимущественно без выраженной деформации |
| Локализация хроматина | Конденсированный маргинально расположенный | Преимущественно диффузно |
| Характеристика органоидов | Сравнительно небольшое количество митохондрий со светлым матриксом и небольшим количеством крист, хорошо развитый комплекс Гольджи, большое содержание рибосом и лизосом, большое количество вакуолей (в том числе липидсодержащих) | Умеренно развитая сеть и комплекс Гольджи, небольшое количество вакуолей и липидных включений по сравнению с контролем; большое количество митохондрий в преимущественно конденсированной форме с небольшим количеством крист |
| Форма клетки | Многогранная, неправильной формы, веретенообразная или округлая в участках с высокой митотической активностью | Эллиптическая или неправильная форма с низким полиморфизмом |
| Размер клетки, µm | 20—25 | 25—30 |
| Гетерогенность меланосом | Высокогетерогенные, разной степени зрелости | Низкогетерогенные, преимущественно зрелые |
| Локализация меланосомы | Внутри- и внеклеточная | Преимущественно внутриклеточная |
| Меланосомные комплексы | Большое количество развивающихся и зрелых комплексов | — |
| Некроз | Единичные случаи | Очаги некроза |
| Апоптоз | Единичные случаи | Единичные случаи |
| Инфильтрация лейкоцитами | Единичные случаи | Выраженный смешанный лимфоцитарно-эозинофильный инфильтрат |
| Фибросклероз | — | + |
| Потеря межклеточных связей | + | — |
В регрессивной части меланомы наблюдаются признаки кровоизлияний (рис. 3, а), дистрофически измененные эпителиоидные клетки с выраженным набуханием митохондрий и значительно расширенной эндоплазматической сетью (рис. 3, б), очаги клеток в состоянии некроза, количество которых значительно превышает контроль (рис. 3, в), наличие клеток в процессе апоптотической гибели (рис. 3, г, д), а также участков фибросклероза опухолевой стромы (рис. 3, д, е).
Рис. 3. Гибель клеток и фибросклероз стромы опухоли при трансплантируемой злокачественной меланоме B16 под воздействием постоянной темноты.
Трансмиссионно-электронная микроскопия, ×10 000 (а, е); ×14 000 (б—д).
Обращает внимание выраженное наличие смешанного лимфоцитарно-эозинофильного инфильтрата в опухолевой ткани животных этой группы (рис. 4).
Рис. 4. Лимфоциты (а, в) и эозинофилы (б) при трансплантируемой злокачественной меланоме B16 под воздействием постоянной темноты.
Трансмиссионно-электронная микроскопия, ×14 000.
Обсуждение
В результате проведенного исследования мы установили некоторые отличия в ультраструктуре клеток меланомы B16 у мышей, содержавшихся в режиме постоянной темноты, от таковых у мышей, которые содержались в стандартном режиме фиксированного освещения. В условиях световой депривации, способствующей усилению выработки мелатонина — основного гормона шишковидной железы, опухоль не только характеризуется менее интенсивным ростом, но и ее ультраструктурные морфологические характеристики существенно отличаются от таковых при развитии опухоли в стандартных условиях. Клетки меланомы в этой группе были мелкими, преимущественно многогранными, неправильной или иногда округлой формы, с характерными признаками злокачественного новообразования, такими как значительная потеря полярности и организации и относительно высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение клеток [31].
Как показали наши предыдущие исследования, меланома в постоянной темноте характеризуется значительно меньшей пролиферативной активностью, чем в контроле. На ультраструктурном уровне мы обнаружили, что при столь низкой интенсивности пролиферации клетки меланомы этой группы также характеризуются существенно более высокой дифференцировкой без признаков активной эмбрионизации, свойственной для быстрорастущих опухолей, ткань опухоли не имеет признаков деградации, внеклеточного матрикса и разделения клеток, приводящего к метастазированию. Объяснение этих фактов, по-видимому, кроется в повышенной концентрации мелатонина в крови этих животных, который, как показали экспериментальные исследования, обладает широким спектром антипролиферативного, онкостатического и антимиграционного действия на различные модели опухолей, включая меланомы, из-за его влияния на организацию цитоскелета и количество метаболических путей в клетке [32—34].
В контрольной группе наблюдались преобладание незрелых меланосом I и II стадий зрелости и относительно низкое содержание меланина в зрелых меланосомах, что характерно для активно пролиферирующих клеток меланомы [35]. В группе животных, находившихся в постоянной темноте, преобладали зрелые меланосомы вследствие значительно меньшей митотической активности, меланосомы преимущественно располагались внутриклеточно, их распределение было неравномерным. В то же время в клетках животных, содержавшихся в постоянной темноте, в отличие от контрольных, не было отмечено признаков наличия фагоцитарных меланосомных комплексов (меланизированных аутофагосом), возникающих в результате аутофагии в активно прогрессирующих опухолях [36—40].
На фоне снижения пролиферации опухолевых клеток этой группы отмечается высокая частота их некротической и апоптотической гибели вследствие характерных цитотоксических эффектов мелатонина, описанных для ряда опухолей, в том числе меланомы [41, 42], что способствует ее регрессу.
Для опухолей животных этой группы характерно также наличие выраженной лимфоплазмоцитарной инфильтрации с примесью эозинофилов. По данным литературы, наличие выраженного лимфоцитарного инфильтрата в опухолях коррелирует с благоприятным исходом заболевания при многих типах опухолей, в том числе при меланомах, особенно при инфильтрации опухоли лимфоцитами в фазе вертикального роста. Примечательно, что при поздних стадиях меланомы обычно отмечают наличие инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. По клиническим и экспериментальным данным, наличие эозинофильных гранулоцитов в опухолях также связано с благоприятным прогнозом. Предполагается, что они оказывают противоопухолевое действие, опосредованное секрецией цитотоксических веществ или являющееся следствием активации других эффекторных клеток. Однако точные механизмы этих процессов в настоящее время до конца не ясны [43, 44].
Проведенное исследование служит дополнительным подтверждением того, что изменчивость светового режима оказывает существенное влияние на морфофункциональное состояние трансплантируемой меланомы. Таким образом, наше исследование показывает, что меланома B16 демонстрирует замедление роста и признаки деградации (низкая пролиферация, высокие показатели гибели клеток, фибросклероз) при отсутствии эмбрионизации и признаков разрушения внеклеточного матрикса, потери целостности тканей, приводящих к метастазированию, на фоне высокой интенсивности иммунного ответа у животных в условиях постоянной темноты, что в совокупности существенно отличает ее от опухолей, развивающихся при фиксированном и ранее изученном постоянном освещении. Особенности биоритмологических показателей опухоли в разных световых режимах, которые, несомненно, имеют большое значение для течения ее развития и прогноза, требуют дальнейшего детального изучения.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Арешидзе Д.А., Козлова М.А., Гиоева З.В.
Сбор и обработка материала — Козлова М.А.
Статистический анализ данных — Козлова М.А.
Написание текста — Арешидзе Д.А., Козлова М.А.
Редактирование — Арешидзе Д.А., Козлова М.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.