Мигренозную головную боль испытывают более 1 млрд человек во всем мире [1]. Это заболевание оказывает крайне негативное влияние на качество жизни, приводит к инвалидизации людей молодого трудоспособного возраста и ведет к большим социально-экономическим и финансовым потерям [2]. Несмотря на большое распространение и социально-экономическое влияние, значение мигрени часто недооценивается, до сих пор имеются диагностические трудности, пациенты получают недостаточное и неадекватное лечение как в России, так и в других странах [3, 4]. Это свидетельствует о нехватке знаний о клинической и патогенетической картине болезни [5]. Поэтому ведутся обширные исследования по выявлению биологических и генетических маркеров, которые помогут в диагностике и лечении мигрени [6].
Одним из перспективных направлений поиска биомаркеров для мигрени на сегодняшний день считается изучение микробиома человека, в частности желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Известно о высокой коморбидности мигрени с инфекционно-воспалительными процессами в ЖКТ [7, 8] и носоглотке [9, 10]. Очевидно, что инфекционные заболевания изменяют микробиом полости рта, это, возможно, имеет значение в патогенезе мигрени [11]. Предполагается, что дисбиоз негативно влияет на взаимодействие по оси «кишечник—мозг» и приводит к хроническому нейровоспалению. В предыдущей работе [12] мы показали практически 100% коморбидность мигрени с хроническими заболеваниями ЖКТ и верхних дыхательных путей (ВДП) и характерные для большинства пациентов изменения микробиоты ротоглотки (снижение содержания нормальной флоры и повышение патогенной и условно-патогенной, свойственной для хронических заболеваний ВДП и ЖКТ). Выявленные изменения позволили выдвинуть гипотезу о сложных многоуровневых взаимоотношениях мигрени с заболеваниями ЖКТ и ВДП путем нарушения микробиотического состава.
Большинство работ посвящено исследованию роли кишечной микробиоты в этиологии и патогенезе мигрени [13—16]. Анализ слюны может стать полезным дополнением к микробиологическому анализу кишечника (двенадцатиперстной кишки и кала). Ежедневно мы проглатываем примерно 1 л слюны, которая содержит большое разнообразие видов микроорганизмов [17], заметно отличающихся от сообществ в кишечнике [18, 19], которые могут вносить свой отдельный вклад в развитие болезни.
Недавно китайские ученые [20] сравнили микробиоты полости рта пациентов с мигренью и здоровых субъектов с помощью секвенирования гена 16S рРНК и обнаружили значительные различия в их составе. Они предположили потенциальную связь между микробиотой полости рта и патогенезом мигрени через влияние на мозг посредством воспалительных и метаболических изменений. Слюна достаточно давно изучается на предмет наличия биомаркеров мигрени, оценивались содержание CGRP (кальцитонин-ген-связанный пептид) [21], уровни С-реактивного белка, интерлейкина-1β и -6 [22] и других нейропептидов и медиаторов воспаления [23], связанных с тригемино-ноцицептивной системой, которые могут быть использованы для изучения нейрональных механизмов мигрени [24], однако состав слюны с точки зрения микробных биомаркеров практически не изучен. В этом плане может быть полезным неинвазивное и простое исследование слюны методом масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) [25, 26] которое широко применяется в России [27—29] и за рубежом [30]. Для исследования биомаркеров мигрени в слюне МСММ использован нами впервые в этой работе.
Цель исследования — выявление изменений микробиома слюны и сравнительная оценка с микробиомом ротоглотки пациентов с мигренью.
Материал и методы
В исследование включены 60 пациентов с мигренью: 9 мужчин и 51 женщина в возрасте от 21 года до 56 лет (средний — 39,2±8,6 года). Набор пациентов осуществлялся в «Клинико-диагностическом центре МЕДСИ на Красной Пресне», Москва.
Критерии включения: 18—65 лет на момент включения, мигрень с или без ауры (МКГБ-3) [31], наличие информированного согласия, способность и готовность выполнять процедуры исследования на всем его протяжении.
Критерии невключения: любые другие головные боли, органическая патология головного мозга, острые или обострения хронических заболеваний ЖКТ и/или ВДП, заболевания зубов, полости рта, травмы и операции головы и шеи в анамнезе, беременность и лактация, системные заболевания соединительной ткани, онкологические, психические или другие заболевания, которые, по мнению исследователя, могли помешать исследованию.
Длительность мигрени составила 15—25 лет. В анамнезе у всех пациентов использование комбинированной терапии нестероидными противовоспалительными препаратами и триптанами без достаточной эффективности, профилактической терапии не получали. Согласно анамнестическим данным и осмотру специалистов, у всех пациентов имелись коморбидные хронические заболевания ЖКТ и ВДП вне обострения. Все исследования пациентов проводились в межприступный период.
Клинико-неврологическое обследование включало анализ жалоб и анамнестических данных; дневник головной боли [32] с оценкой частоты, интенсивности головной боли по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) от 0 до 10 баллов, частоты использования анальгетиков; стандартный неврологический осмотр. Оценка влияния мигрени на повседневную активность и трудоспособность (за последние 3 мес) проводилась с помощью шкалы оценки мигрени (MIDAS-Migraine Disability Assessment) [4]. Все пациенты были консультированы гастроэнтерологом и отоларингологом.
Микробиологическое обследование слюны и мазка с задней стенки ротоглотки с анализом качественного и количественного состава микробиоты (57 микроорганизмов, включая грибы и вирусы) проводилось по методу МСММ, разработанному проф. Г.А. Осиповым и соавт. [33—35]. Метод основан на определении уровней биохимических маркеров (молекул высших жирных кислот, альдегидов, спиртов), обладающих индивидуальной специфичностью для каждого микроорганизма с последующим пересчетом на количество микробных клеток на 1 г биоматериала (105 кл./г образца). Проводилось сравнение показателя пациента с нормативными значениями (повышение значения более чем в 2 раза считается значимым отклонением от нормы). Метод имеет разрешение для диагностического использования с 2010 г. (разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2010/038 от 24 февраля 2010 г. выдано Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития).
Исследование было одобрено локальным независимым Этическим комитетом при образовательном частном учреждении дополнительного профессионального образования «Институт междисциплинарной медицины», протокол №68 от 11.01.22.
Статистическая обработка проводилась в программной среде R (2022) [36]. Для анализа корреляции между показателями использовали расчет критерия Спирмена в пакете pspearman [37]. При сравнении микробиоты слюны и ротоглотки использовали парные варианты статистических тестов. Межгрупповые различия оценивались с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни и Уилкоксона в связи с тем, что для большинства показателей характер распределения значений в выборках существенно отличался от нормального распределения. При достижении значения показателя p<0,05 результаты тестов считались статистически значимыми, а различия между группами — достоверными. Графический анализ проводили с использованием функций пакета ggplot2 [38].
Результаты
При анализе дневников головной боли пациентов было получено, что в среднем количество дней мигрени составило 9,35±5,9 в месяц, эпизодическая мигрень (<15 дней в месяц) отмечалась у 45 человек, хроническая (≥15 дней в месяц) — у 15. Количество приемов препаратов, купирующих головную боль, было 10,73 в месяц. Средняя интенсивность боли по шкале ВАШ в общей группе пациентов составила 9,22±1,28 балла, при этом у 54 человек наблюдалась сильная боль (от 7 до 10 баллов), у 6 — умеренная (от 4 до 6 баллов). По шкале MIDAS: сильная боль (значительное снижение повседневной активности) — у 47 (78,3%) человек, сильная боль (выраженное ограничение повседневной активности) — у 8 (13,3%), умеренная/выраженная боль (незначительное снижение повседневной активности) — у 3 (5%), слабая боль (отсутствие/минимальное снижение повседневной активности) — у 2 (3,3%).
У всех больных с мигренью в слюне выявлены маркеры транзиторных, в норме отсутствующих микроорганизмов и резидентных условно-патогенных микроорганизмов (приведен процент пациентов с более чем двукратным отклонением содержания микроорганизмов от нормы):
а) повышение содержания маркеров резидентных (условно-патогенных) микроорганизмов — кокков, свойственных для хронических заболеваний носоглотки: Enterococcus spp. — у 85% пациентов, Staphylococcus aureus — у 77% и Staphylococcus epidermidis — у 27%, Streptococcus spp. — у 40%;
б) появление маркеров транзиторных микроорганизмов, в норме отсутствующих, характерных для кишечной микрофлоры: анаэробных Blautia coccoides — у 85% пациентов, Fusobacterium spp./Haemophilus spp. — у 62%, Peptostreptococcus anaerobius 18623 — у 55%, Bacteroides fragilis — у 48%; анаэробных пропионобактерий Propionibacterium acnes — у 40%, Propionibacterium freudenreichii — у 38%, Propionibacterium jensenii — у 30%; анаэробных клостридий — Cl. difficile — у 35%, Cl. hystolyticum/Str. Pneumonia — у 32%, Cl. perfringens — у 15%, Cl. propionicum — у 38%, Cl. ramosum — у 45%; грамотрицательных палочек — Kingella spp. у 37% и Porphyromonas spp. — у 47%;
в) появление вирусных маркеров: группы герпеса — у 30% пациентов, цитомегаловируса — у 27%, вируса Эпштейна—Барр — у 8%;
д) понижение содержания грибов Aspergillus spp.
Снижения содержания нормальной флоры у большинства пациентов не отмечалось: Bifidobacterium spp. — Me=277,5 [4; 920] (среднее по группе — 328,5±258,8) при норме 225 кл.×105 и Lactobacillus spp. — Me=1040 [13; 2901] (среднее по группе 1188,92±859,16) при норме 659 кл.×105.
Проведенный нами корреляционный анализ зависмости тяжести и частоты головных болей по шкалам MIDAS, ВАШ и дневнику головной боли от состава микробиоты слюны лиц с мигренью не выявил достоверных взаимосвязей.
Сравнительный анализ микробиома (табл. 1, 2) показал значимое снижение в слюне по сравнению с ротоглоткой концентрации: кокковой флоры Enterococcus spp., Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, анаэробных бактерий Clostridium difficile и Clostridium perfringens; энтеробактерии Helicobacter pylori; грамотрицательных палочек Kingella spp., грибов и вируса Эпштейна—Барр. В слюне была значительно повышена в сравнении с ротоглоткой концентрация: Staphylococcus epidermidis, анаэробных Clostridium ramosum и Fusobacterium spp./Haemophilus spp. и грамотрицательных палочек Porphyromonas spp. Не обнаружено значимых различий в концентрации нормальной флоры, вирусов группы герпеса и цитомегаловирусов. Таким образом, в целом значимых изменений микробиома в слюне оказалось меньше, чем в ротоглотке.
Таблица 1. Сравнение концентраций патогенов в слюне и зеве пациентов с мигренью (n=60)
| Группа | Патоген | Норма, клеток ×105 | Среднее количество патогена, M±σ | Сравнение по тесту Уилкоксона—Манна—Уитни, Z (p) | |
| слюна | мазок с задней стенки ротоглотки | ||||
| Кокки, бациллы | Enterococcus spp. | 0 | 24,38±41,24 | 38,32±52,15 | –2,81 (0,005) |
| Streptococcus spp. | 45 | 293,42±598,45 | 237,85±415,84 | –1,31 (0,191) | |
| Streptococcus mutans | 114 | 182,28±193,1 | 337,28±320,88 | –3,01 (0,003) | |
| Staphylococcus aureus | 30 | 179,33±195,54 | 288,37±241,33 | –3,21 (0,001) | |
| Staphylococcus epidermidis | 0 | 62,8±286,09 | 38,22±90,04 | –2,7 (0,007) | |
| Анаэробы: нормальная флора | Bifidobacterium spp. | 225 | 328,52±258,81 | 331,73±383,07 | 1,59 (0,113) |
| Lactobacillus spp. | 659 | 1188,92±859,16 | 1496,28±1004,43 | –1,64 (0,1) | |
| Анаэробы | Bacteroides fragilis | 10 | 53,37±77,43 | 47,97±88,54 | 1,27 (0,203) |
| Blautia coccoides | 0 | 53,87±54,08 | 64,88±83,59 | 0,21 (0,832) | |
| Clostridium difficile | 0 | 19,08±59,89 | 22,97±30,19 | –2,72 (0,007) | |
| Cl. Hystolyticum/Str. pneumonia | 50 | 96±162,7 | 94,48±215,81 | –0,44 (0,658) | |
| Clostridium perfringens | 84 | 180,67±659,01 | 509,25±841,99 | –3,34 (0,001) | |
| Clostridium propionicum | 94 | 211,83±310,04 | 167,7±312,72 | 0,1 (0,916) | |
| Clostridium ramosum | 992 | 2293,33±2025,15 | 1201,17±1179,1 | 4,22 (0) | |
| Fusobacterium spp./Haemophilus spp. | 18 | 68,17±69,52 | 32,88±44,96 | 3,64 (0) | |
| Peptostreptococcus anaerobius 18623 | 378 | 1051,2±893,55 | 810,17±787,74 | 1,89 (0,059) | |
| Propionibacterium acnes | 44 | 141,42±247,8 | 152,67±292,33 | 1,28 (0,201) | |
| Propionibacterium freudenreichii | 243 | 548,38±473,13 | 441,93±300,86 | 0,94 (0,345) | |
| Propionibacterium jensenii | 17 | 40,67±65,57 | 68,75±173,72 | 1,05 (0,295) | |
| Энтеробактерии | Helicobacter pylori | 15 | 8,2±29,29 | 28,65±71,25 | –3,65 (0) |
| Грамотрицательные палочки | Kingella spp. | 0 | 28,22±59,04 | 42,73±112,14 | –2,6 (0,009) |
| Porphyromonas spp. | 0 | 9,8±17 | 2,92±6,16 | 3,07 (0,002) | |
| Грибы, дрожжи | Aspergillus spp. | Слюна: 980 Ротоглотка: 110 | 102,85±245,72 | 152,47±431,64 | –2,17 (0,03) |
| Candida spp. | 520 | 465,52±397,4 | 425,27±337,26 | 0,52 (0,602) | |
| Микр. грибы, кампестерол | 115 | 2,98±12,59 | 92,15±206,54 | –4,04 (0) | |
| Микр. грибы, ситостерол | 384 | 19,27±55,1 | 250,62±431,95 | –5,07 (0) | |
| Вирусы | Herpes spp. | 0 | 5,53±10,27 | 5,12±11,66 | 0,43 (0,67) |
| Цитомегаловирус | 0 | 5,68±11,04 | 6,67±17,56 | –0,67 (0,502) | |
| Эпштейна—Барр вирус | 7 | 3,7±10,36 | 7,3±14,12 | –2,25 (0,024) | |
Таблица 2. Сравнение концентраций патогенов в слюне и зеве пациентов с мигренью (пациенты с двукратным отклонением от нормы, %)
| Группа | Патоген | Пациенты с двукратным отклонением от нормы (%) | Статистическая значимость, тест Фишера, p | |
| слюна | мазок с задней стенки ротоглотки | |||
| Кокки, бациллы | Enterococcus spp. | 85 | 87 | 1 |
| Streptococcus spp. | 40 | 53 | 0,2 | |
| Streptococcus mutans | 25 | 55 | 0,0014 | |
| Staphylococcus aureus | 77 | 92 | 0,043 | |
| Staphylococcus epidermidis | 27 | 52 | 0,009 | |
| Анаэробы: нормальная флора | Bifidobacterium spp. | 22 | 30 | 0,40 |
| Lactobacillus spp. | 15 | 5 | 0,125 | |
| Анаэробы | Bacteroides fragilis | 48 | 45 | 0,85 |
| Blautia coccoides | 85 | 75 | 0,254 | |
| Clostridium spp. (группа C. tetani) | 12 | 38 | 0,0013 | |
| Clostridium difficile | 35 | 58 | 0,017 | |
| Cl. Hystolyticum/Str. Pneumonia | 32 | 18 | 0,14 | |
| Clostridium perfringens | 15 | 42 | 0,002 | |
| Clostridium propionicum | 38 | 23 | 0,113 | |
| Clostridium ramosum | 45 | 17 | 0,0014 | |
| Fusobacterium spp./Haemophilus spp. | 62 | 35 | 0,006 | |
| Peptostreptococcus anaerobius 18623 | 55 | 42 | 0,201 | |
| Propionibacterium acnes | 40 | 35 | 0,706 | |
| Propionibacterium freudenreichii | 38 | 38 | 1 | |
| Propionibacterium jensenii | 30 | 25 | 0,683 | |
| Actinomyces viscosus | 25 | 32 | 0,544 | |
| Nocardia asteroides | 23 | 33 | 0,311 | |
| Энтеробактерии | Helicobacter pylori | 8 | 32 | 0,0025 |
| Грамотрицательные палочки | Kingella spp. | 37 | 60 | 0,017 |
| Porphyromonas spp. | 47 | 23 | 0,012 | |
| Грибы, дрожжи | Aspergillus spp. | 0 | 20 | 0,0003 |
| Candida spp. | 7 | 7 | 1 | |
| Микр. грибы, кампестерол | 0 | 13 | 0,006 | |
| Микр. грибы, ситостерол | 0 | 13 | 0,006 | |
| Вирусы | Herpes spp. | 30 | 32 | 1 |
| Цитомегаловирус | 27 | 35 | 0,43 | |
| Эпштейна—Барр вирус | 8 | 13 | 0,56 | |
Обсуждение
В данной работе у пациентов с мигренью проведена сравнительная оценка микробиоты слюны и мазка из ротоглотки с целью определения более информативного биотопа. Каждый из этих анализов полезен по-своему. Мазок из ротоглотки характеризует «входные ворота инфекции» и показывает наличие у пациентов с мигренью хронического очага воспаления в ВДП — фарингита и/или тонзиллита. В предыдущей работе [12] мы продемонстрировали характерные для пациентов с мигренью нарушения микробиоты ротоглотки (снижение содержания нормальной флоры, повышение уровня ряда условно-патогенной микрофлоры и появление патогенных микроорганизмов), что клинически сочеталось с наличием у всех пациентов хронических заболеваний ВДП. Слюна отражает состояние не только микробиоценоза ротоглотки и полости рта, но и внутренней среды организмы (поскольку на 50% состоит из сыворотки крови), и увеличение в ней других микробных маркеров (по сравнению с ротоглоткой) может быть связано с повышенной проницаемостью кишечника и более тяжелым течением мигрени (наличием заболеваний ЖКТ, системного воспалительного процесса).
Нарушения микробиоценоза слюны и ротоглотки при мигрени приводят в повышению уровня микробных эндотоксинов, увеличению содержания провоспалительных цитокинов, эти факторы негативно влияют на ЦНС, эндотелий сосудов и являются значимыми звеньями патогенеза при мигрени. Связь между нарушением микробиоценоза слюны и ротоглотки при мигрени показана в работе китайских ученых [19] и в нашем предыдущем исследовании микробиоты ротоглотки [12].
Для изучения слюны пациентов с мигренью мы впервые применили метод МСММ. МСММ позволяет легко проводить повторные заборы слюны, что привлекает как альтернатива более сложных диагностических процедур [39, 40], например забора анализа крови, в ряде случаев не только дополняя, но даже заменяя его [41]. Достижения в области масс-спектрометрической протеомики показывают многообещающие результаты использования слюны для изучения биомаркеров в диагностических целях [42—45]. В патофизиологии мигрени все большая роль отводится нейровоспалению и нарушению иммунной системы, в которых микробиологический состав сред организма принимает непосредственное участие [46].
У всех наших пациентов с мигренью анализ микробиома слюны показал наличие нарушений. Характерные изменения микробиоты включали повышение содержания ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, свойственных для хронических заболеваний ВДП и ЖКТ, что соответствовало информации о коморбидных заболеваниях, полученной из анамнеза и при осмотре пациентов отоларингологом и гастроэнтерологом. У большинства пациентов в слюне выявлено повышенное содержание стафилококков и стрептококков, характерных для заболеваний верхних и нижних дыхательных путей и анаэробных микроорганизмов, характерных только для кишечной микрофлоры (большинство лиц с мигренью имели высокие уровни клостридий, блаудиа и фузобактерий, пептострептококков и бактероидов). Достаточно часто встречался высокий уровень вирусных маркеров (вирусы герпеса 1-го и 2-го типов обнаружены у 30% пациентов, цитомегаловирус — у 27%). Уровень бифидо- и лактобактерий был в пределах нормы, что может свидетельствовать о сохранении резервных способностей микрофлоры, иммунитета (бифидо- и лактобактерии — антагонисты патогенной микрофлоры) у обследованных нами пациентов с мигренью.
По сравнению с микробиотой ротоглотки, в слюне отклонений от нормы было меньше, поскольку она в большой степени отражает состояние внутренней среды организма, которую организм эффективно поддерживает в нормальном состоянии. Поэтому в диагностических целях при мигрени мазок с задней стенки ротоглотки более информативен. При наличии у пациентов с мигренью клинических признаков интоксикации, системного воспалительного процесса, более тяжелого течения мигрени мы рекомендуем проводить оценку микробиоценоза методом МСММ как в слюне, так и в мазке из ротоглотки. Таким пациентам также рекомендуется консультация врача — отоларинголога и гастроэнтеролога и лечение сопутствующих заболеваний ЖКТ и ВДП.
Патогенетические механизмы, связывающие мигрень и изменения микробиома, сегодня активно изучаются, предполагается влияние индуцированных иммунных, воспалительных и сосудистых реакций с высвобождением иммунных клеток, воспалительных и вазоактивных агентов в слизистую оболочку, ведущее к гиперчувствительности церебральных структур, связанных с болевым восприятием [15]. Высокое распространение дисбиоза в ротоглотке и слюне при мигрени, а также наличие у 100% таких пациентов хронических заболеваний ЖКТ и ВДП диктует необходимость дальнейших исследований в этом направлении.
Заключение
1. С помощью метода МСММ в слюне пациентов с мигренью обнаружено нарушение микробиоценоза, характерными особенностями которого являются повышение содержания микробных маркеров:
— резидентных (условно-патогенных) микроорганизмов — кокков, свойственных для хронических заболеваний носоглотки;
— транзиторных микроорганизмов, в норме отсутствующих, характерных для кишечной микрофлоры;
— вирусов группы герпеса (1-го и 2-го типов, цитомегаловируса).
2. Сравнительная оценка микробиоты слюны и мазка с задней стенки ротоглотки показала наличие дисбиоза как в слюне, так и в ротоглотке пациентов с мигренью, однако в слюне отклонений от нормы было меньше, поэтому в диагностических целях мазок с задней стенки ротоглотки клинически более значим.
3. Применение метода МСММ расширяет лабораторно-клинические возможности при мигрени и позволяет разработать более эффективные комплексные схемы терапии и междисциплинарный подход к ведению больных с мигренью.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.