Рассеянный склероз (РС) — хроническое аутоиммунное заболевание, от которого в настоящее время страдают примерно 2,3 млн человек [1]. Для него характерно хроническое воспаление центральной и периферической нервной системы с сопутствующей демиелинизацией нейронов, причиной которого является активность аутоиммунных клеток, попадающих в ЦНС через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [2]. Вследствие демиелинизации при развитии РС происходит формирование бляшек в ЦНС. Симптомы РС достаточно вариабельны и могут включать в себя сенсорные и зрительные нарушения, расстройства двигательной активности, утомляемость, боль, а также когнитивные нарушения.

Диагностику и терапию РС усложняет крайняя гетерогенность заболевания. Несмотря на множество исследований, направленных на прояснение механизмов патогенеза РС, а также на поиск мишеней для эффективной терапии, многие проблемы, связанные с диагностикой и механизмами патогенеза, все еще остаются нерешенными. Картина развития заболевания достаточно похожа на некоторые функциональные неврологические расстройства, что иногда приводит к ложноположительным результатам [3]. МРТ-диагностика РС является общепризнанной [4]; тем не менее прямых способов диагностики, позволяющих точно подтвердить диагноз, до сих пор не существует. Также не обнаружены биомаркеры, специфичные для РС.

Омиксные исследования РС

В настоящее время повсеместно проводятся исследования, направленные на изучение РС, с использованием омиксных технологий. До сих пор одним из самых популярных направлений является GWAS (полногеномный поиск ассоциаций). Было опубликовано немало статей, посвященных поиску геномных ассоциаций у больных РС [5—7]. В результате были выявлены сильные ассоциации с SNP (single-nucleotide polymorphism — однонуклеотидный полиморфизм) генов IL2RA и IL7RA, а также с многочисленными полиморфизмами в локусе HLA-DRA [5]. В недавних исследованиях при помощи GWAS на выборке в несколько десятков тысяч человек Международным консорциумом по изучению РС (IMSGC) также было выявлено 233 статистически независимых ассоциаций, связанных с повышенным риском развития РС, что, по утверждению авторов, может объяснить примерно ¹/₂ случаев, связанных с наследственностью [6]. Что немаловажно, были также проанализированы данные РНК-секвенирования (RNA-Seq) с прицельным вниманием на гены, выявленные в результате GWAS. Было выявлено, что экспрессия некоторых генов в кортексе варьирует в зависимости от типа клеток (SLC12A5 больше экспрессируется в нейронах, а CLECL1 — в микроглии). Благодаря омиксным технологиям было показано, что около 5% случаев РС, связанных с наследуемостью, вызваны низкочастотными вариациями в кодирующей части генов [7]. При этом новые выявленные гены (PRF1, HDAC7, PRKRA), для которых характерны вышеупомянутые вариации, выполняют иммунологические функции или влияют непосредственно на них, что является еще одним подтверждением того, что развитие РС вызвано в первую очередь иммунной дисфункцией. Некоторые результаты GWAS-исследований были валидированы на российской популяции из 509 больных РС [8], в результате чего были подтверждены ассоциации CLEC16A и IL2RA с РС. Кроме того, были выявлены ассоциации CLEC16A и IRF8 у женщин и IL7RA и CD58 у мужчин.

Несмотря на то что исследования GWAS позволили значительно улучшить понимание природы полигенных заболеваний, данный подход имеет существенные ограничения, обусловленные самим методом. Во-первых, этот инструмент требует создания большой когорты пациентов; во-вторых, важно отметить, что найденные ассоциации не всегда являются каузальными; в-третьих, результаты GWAS, как правило, не позволяют предсказать риск развития заболеваний. В связи с этим также необходимо использование других омиксных технологий для исследования РС.

В последние годы активно используются методы РНК-секвенирования, в том числе секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq). Благодаря этим методам возможен анализ дифференцированной экспрессии генов у клеток, которые тем или иным образом вносят вклад в патогенез РС, дифференцированный анализ популяций и субпопуляций лейкоцитов, а также компонентов микроглии и ЦНС. За последние 5 лет было опубликовано несколько статей, в которых представлены результаты анализа транскриптомов клеток глии больных РС [8—10]. Так, было показано, что клетки-предшественники олигодендроцитов менее многочисленны у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой, в то время как непосредственно олигодендроциты были представлены в большем количестве и характеризовались экспрессией C3, CD74, PTPRC, а также HLA-DR [11, 12]. Другое исследование было посвящено изучению нейронов в поражениях головного мозга при РС с использованием snRNA-Seq, после чего результаты секвенирования валидировались с применением гибридизации in situ [13]. В результате были идентифицированы сигнатуры, специфичные для реактивных астроцитов (GFAP, CD44, BCL16) и активированной микроглии (CD74, APOE, SPP1); экспрессия перечисленных генов не наблюдается в контрольных тканях. Также показано, что нейроны в верхних кортикальных слоях бляшек при РС более уязвимы в силу индукции окислительного стресса, митохондриальной дисфункции и активации путей, приводящих к гибели клеток.

Несмотря на значительные успехи в исследовании клеток ЦНС, задействованных в образовании бляшек — очагов демиелинизации при РС, проведение подобных работ является весьма нетривиальной задачей. В первую очередь это связано с недостаточно развитыми технологиями неинвазивного отбора биоматериала из ЦНС. Так, сбор образцов нервной ткани головного мозга для исследований возможен только посмертно, в связи с чем получение объемной выборки достаточно затруднительно. Более того, было показано, что в постмортемных образцах головного мозга человека меняется экспрессия генов в зависимости от времени, прошедшего после клинической смерти [14]. Следовательно, отслеживание динамики преобразований в ЦНС у больных РС с использованием высокопроизводительных методов затруднительно. В результате исследование ЦНС при РС является действительно трудоемкой задачей, сопряженной с многочисленными рисками.

При этом перспективно изучение клеток из биологических жидкостей пациентов с РС, таких как кровь и цереброспинальная жидкость (ЦСЖ). При этом исследованиям транскриптомов лимфоцитов крови и ЦСЖ уделяется не так много внимания по сравнению с клетками ЦНС (см. таблицу). Ряд публикаций посвящен дифференциальному анализу транскриптомов мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от больных РС и здоровых. Однако данный подход потенциально малоинформативен, поскольку МКПК человека представлены множеством различных субпопуляций клеток, в каждой из которых одни и те же гены могут экспрессироваться по-разному, но при обработке данных разница не будет обнаружена. Была предпринята попытка с использованием методов машинного обучения различить формы РС по данным транскриптомов МКПК [15]. Тем не менее анализ транскриптомов субпопуляций в отдельности может помочь в поисках биомаркеров и сигнатур, специфичных для РС. В последние годы успешно применяются методы получения транскриптомов единичных клеток, которые являются мощным инструментом, однако еще не обретшим при исследованиях РС массовую популярность. Тем не менее за последние 3 года было опубликовано несколько работ, в которых scRNA-seq был применен для анализа T- и B-клеток.

Результаты исследований транскриптомов МКПК и их популяций при РС

Было показано, что состав субпопуляций лимфоцитов при РС весьма специфичен — в особенности T-хелперов. В исследовании E. Galli и соавт. было проведено экстрагирование МКПК, после чего клетки были стимулированы и проанализированы на предмет экспрессии цитокинов, также были выявлены поверхностные маркеры [16]. В качестве групп сравнения были отобраны больные РС, здоровые, а также больные невоспалительными нейродегенеративными заболеваниями. Алгоритм машинного обучения отобрал субпопуляции клеток, сигнатура которых была специфична для РС, но не для других нейродегенеративных заболеваний. По большей части эта сигнатура включала в себя T-хелперы и лишь незначительно — CD8+ T-клетки. Для T-хелперов больных РС характерна экспрессия GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), IFN-γ (интерферон гамма), интерлейкина (IL)-2, а также хемокинового рецептора CXCR4. T-хелперы у больных РС, секретирующих GM-CSF, достаточно гетерогенны и в основном включают в себя Th1 и ThGM (T-хелперы, продуцирующие GM-CSF). Описанная сигнатура существенно редуцируется при лечении пациентов диметилфумаратом. Роль GM-CSF в развитии аутоиммунных заболеваний уже показана для таких патологий, как ревматоидный артрит, в связи с чем изучение влияния GM-CSF на патогенез РС представляет интерес.

По сравнению с больными инфекционными заболеваниями, а также здоровыми людьми, у больных РС выше количество цитотоксических T-клеток, экспрессирующих IL-2, а также больше цитотоксических T-клеток, экспрессирующих IL-6, по сравнению со здоровыми. Кровь больных РС значительно обогащена CD4+ T-клетками, продуцирующими GM-CSF, IFN-γ, IL-2 и фактор некроза опухолей (TNF) и CXCR4, показывает значительнные отличия по сравнению с образцами пациентов контрольной группы (p=0,005), больных невоспалительными нейродегенеративными заболеваниями (p=0,002) и инфекционными заболеваниями (p=0,032) [16]. Однако статистически значимая разница по этим параметрам по сравнению с больными клинически изолированным синдромом не была обнаружена. В ЦСЖ частота CD4+ клеток была выше, чем в периферической крови, в отличие от других типов лейкоцитов. При этом в ЦСЖ значительно увеличивалась доля клеток, соответствующих вышеописанной сигнатуре, по сравнению с периферической кровью. В бляшках ЦНС были также идентифицированы CXCR4+CD4+ клетки, продуцировавшие GM-CSF.

Помимо T-клеток, с использованием транскриптомного подхода активно изучаются и B-клетки. В 2020 г. A. Ramesh и соавт. опубликовали исследование транскриптомов суммарных B-лимфоцитов, отдельных клеток, а также был проанализирован спектр иммуноглобулинов B-клеток у больных РС [17]. Итоговая выборка включала в себя 16 больных ремиттирующим РС (РРС), другими неврологическими заболеваниями (5 пациентов) и здоровых (3 человека). Данные репертуаров единичных клеток были соотнесены с репертуарами суммарных B-лимфоцитов. Согласно полученным результатам анализа секвенирования единичных клеток, профили экспрессии B-клеток ЦСЖ у больных РС существенно отличаются от таковых в крови. При сравнении транскриптомов крови и ЦСЖ были выявлены дифференцированно экспрессирующиеся гены, некоторые из которых вовлечены в пути, связанные с биосинтезом холестерола, а также транскрипционный фактор NF-kB. При этом у здоровых людей было крайне мало B-клеток в ЦСЖ для детекции с применением существующих технологий изучения единичных клеток.

Мультиомиксные технологии: преимущества и ограничения

Результаты новейших исследований патогенеза РС демонстрируют, что омиксные технологии являются крайне эффективным и мощным инструментом. Более того, использование мультиомиксного подхода (например, сочетание анализа данных геномов, эпигеномов и транскриптомов) уже становится общепринятой практикой, поскольку использование лишь одного омиксного типа данных существенно ограничивает исследования заболевания, так как выводы, получаемые таким путем, основаны преимущественно на установлении корреляций и не дают полного представления о причинно-следственных связях. Без этого затруднительно выяснение причин развития заболевания у тех или иных пациентов. Особенно важно применять мультиомиксный подход при изучении гетерогенных заболеваний, к каким относятся появление злокачественных образований и РС. Комплексный анализ такого рода позволяет расширить возможности поиска и уточнения молекулярных механизмов, которые характерны при развитии того или иного заболевания.

Успехи мультиомиксного подхода можно проиллюстрировать на примере рака легкого и рака молочной железы: благодаря геномным, протеомным, транскриптомным и фосфопротеомным данным была уточнена информация о функциональных последствиях соматических мутаций, что позволяет осуществлять более эффективных поиск драйверных генов-кандидатов [24, 25].

Несмотря на существенный прогресс в исследованиях причин развития РС, а также диагностических и терапевтических направлений, мультиомиксный подход в клинической практике до сих пор не распространен. Это связано с тем, что его использование ограничено несколькими факторами. В первую очередь анализ мультиомиксных данных может являться весьма трудоемким и длительным процессом, из-за чего подбор терапии может быть затянут. Эффективность анализа может быть улучшена при разработке более мощных биоинформатических алгоритмов, а также с помощью машинного обучения. При множественном анализе гетерогенных типов данных необходима разработка статистических моделей, позволяющих скорректировать неодинаковость выборок. В клинической практике, как правило, представлено ограниченное количество образцов для исследования, и при этом не всегда удается получить все необходимые типы данных для каждого из них. Еще одним лимитирующим фактором является дороговизна: несмотря на то, что секвенирование дешевеет с каждым годом, обеспечение объемной выборки по всем типам данных — все еще довольно дорогостоящая задача. С дороговизной напрямую связана необходимость в большой глубине секвенирования — не только для более достоверного выявления новых транскриптов, аллелей и т.д., но также для минимизации технических артефактов (например, batch-эффекта), которые зачастую приводят к ложноположительным результатам. Также существует проблема гетерогенности выборок. Часто группы больных и здоровых очень разнородны ввиду множества различных факторов. Эта проблема частично решается за счет разделения людей на группы в зависимости от пола, возраста, типа питания и других отличий, однако данный подход ограничен тем, что ключевые факторы, способные исказить результат исследования, могут быть неизвестны при моделировании исследования.

Особенно важна многоуровневая характеристика единичных клеток. Технологии секвенирования единичных клеток стремительно развиваются. В настоящее время разрабатываются мультиомиксные методы, позволяющие объединить анализ уровней мРНК с анализом других параметров, таких как метилирование ДНК, открытость хроматина и содержание различных белков в клетке. Получение информации об эпигенетическом статусе единичных клеток возможно благодаря методу scATAC-Seq (single cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing). При объединении данных scATAC-Seq и scRNA-Seq возможен более глубокий анализ экспрессии генов. Недавно была разработана технология, объединяющая scRNA-Seq и ATAC-Seq (SNARE-Seq — single-nucleus chromatin accessibility and mRNA expression sequencing) [26]. Технология основана на капельных платформах и может одновременно выполнять RNA-Seq и ATAC-Seq одной и той же клетки, что обеспечивает крупномасштабное высокопроизводительное и мультиомиксное секвенирование единичных клеток.

В настоящее время высокопроизводительные одноклеточные мультиомиксные технологии обычно сталкиваются с проблемами низкой чувствительности и геномного покрытия; доступные методы для комбинированного анализа модификаций гистонов и экспрессии РНК отсутствуют. Для решения этих проблем необходима дальнейшая оптимизация методов и разработка новых технологий и реагентов.

Обсуждение

Несмотря на существенный прогресс во внедрении мультиомиксных методов при исследовании онкологических заболеваний, использование данного подхода для изучения механизмов патогенеза РС, а также для разработки новых диагностических и терапевтических подходов к настоящему времени все еще не получило широкого применения. Так, с применением мультиомиксного подхода возможна более точная характеристика клеток микроглии, а также выявление их роли в патогенезе РС, поскольку специфические маркеры для них отсутствуют. Кроме того, комплексная обработка различных типов данных необходима для выявления реальной роли факторов окружающей среды, так же как и эндогенных механизмов. Наконец, чтобы облегчить извлечение биологически релевантной информации из больших наборов данных, должны быть созданы общедоступные базы данных по РС. В настоящее время доступно несколько баз данных секвенирования РНК клеток нервной системы — таких как GOAD [27], Brain RNA-seq [28], Neuroexpresso [29]. Для анализа отдельных участков головного мозга можно использовать атлас мозга мыши [30] или человека [31]. Также немаловажно получение результатов секвенирования эпигенома такими методами, как ATAC-Seq, ChIP-Seq (chromatin immunoprecipitation sequencing), Hi-C, и дальнейшая их интеграция с результатами РНК-секвенирования на уровне как тканей, так и единичных клеток. Так, D. Factor и соавт. показали, что элементы энхансера, регулирующие BRD3 и HEXIM1, напрямую связаны с геном риска РС и что эти энхансеры при РС регулируют экспрессию генов некорректно; вследствие этого ремиелинизация пораженных нейронов неэффективна [32].

Благодаря интеграции различных типов омиксных данных возможна более точная и глубокая характеристика гетерогенных клеточных популяций как в ЦНС, так и в крови, которые являются участниками патогенетических процессов при РС. Кроме того, из-за рецидивирующе-ремиттирующего характера РС вероятно, что глиальные клетки трансформируются в те или иные подтипы в зависимости от стадии развития заболевания [11]. В связи с этим крайне важно изучать динамику клеток, вовлеченных в патогенетический процесс.

Заключение

Таким образом, мультиомиксный подход может обеспечить существенный прогресс в понимании механизмов патогенеза РС, а также является мощным инструментом для поиска потенциальных биомаркеров, что может позволить вывести диагностику РС на принципиально новый уровень. Мультиомиксные данные могут облегчить установление типа РС, а также подбор индивидуальной терапии для каждого пациента и дальнейший мониторинг его состояния.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.