Анализ дифференциальной экспрессии генов в тканях миокарда у пациентов с гипертрофической кардиомиопатией

Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) — одно из наиболее распространенных заболеваний миокарда с частотой встречаемости 1:200—1:500 [1]. Обычно оно фенотипически проявляется в форме гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ), нередко с выраженным утолщением межжелудочковой перегородки (МЖП) [2]. Гистологические маркеры ГКМП традиционно включают гипертрофию и нарушение архитектуры кардиомиоцитов (КМ), интерстициальный и заместительный фиброз, а также микроваскулопатию [3—6]. Постепенное ремоделирование миокарда при ГКМП приводит к снижению резерва перфузии миокарда [7], ишемии, прогрессированию фиброза, нарушению проводимости и возникновению аритмий, что, в свою очередь, негативно сказывается на гемодинамической функции сердца. При этом для ГКМП характерен очень широкий диапазон клинических проявлений: от бессимптомной формы до прогрессирующей сердечной недостаточности (СН) и внезапной сердечной смерти (ВСС) [8, 9].

Ранее было описано большое количество связанных с развитием заболевания мутаций, причем подавляющая их часть (60—70%) приходится на гены миозин-связывающего белка C (MYBPC3) и тяжелой цепи миозина (MYH7) [10]. При этом у 40% пациентов с клиническим диагнозом ГКМП отсутствуют семейный анамнез заболевания и мутации в генах белков саркомера, в связи с чем выделяют несемейную форму ГКМП. На основании результатов генетического тестирования, семейного анамнеза и наличия фенотипических проявлений пациенты с ГКМП могут быть разделены на ряд подгрупп [11—14]. Сравнительный анализ этих подгрупп может позволить выявить роль различных факторов в формировании клинической картины заболевания. Так, было показано, что для пациентов, несущих патогенные/вероятно патогенные варианты генома, в среднем характерно более раннее (на 5—10 лет) начало развития заболевания [15, 16]. Были выявлены некоторые особенности фенотипа, включая распределение гипертрофии и фиброза, и было отмечено, что обструкция выносящего тракта левого желудочка (ВТЛЖ) в большей степени характерна для саркомер-негативных пациентов [17, 18].

Одним из возможных подходов к изучению молекулярно-генетических механизмов патогенеза ГКМП является сравнительный анализ транскриптома тканей миокарда у пациентов с тяжелой формой заболевания с разными вариантами фенотипа. Данный метод позволяет выявить специфические особенности экспрессии генома у пациентов с семейными и несемейными случаями ГКМП и тем самым понять молекулярные основы дифференциации субфенотипов заболевания.

В исследование было включено 48 пациентов с тяжелой формой ГКМП, имеющих выраженную гипертрофию миокарда ЛЖ и МЖП и проходивших хирургическое лечение методом септальной миоэктомии на базе кардиохирургического отделения II ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского». В соответствии с Хельсинкской декларацией от всех пациентов было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Сразу после иссечения биоптаты миокарда МЖП помещали в раствор DNA/RNA-Shield (Zymo Research Corp., США), предназначенный для стабилизации и хранения тканевой РНК.

У большей части пациентов (98%) клинически была определена СН II-III функционального класса, при этом не было случаев инфаркта миокарда в анамнезе. Семейный анамнез заболевания выявлен у 25% пациентов, а у 10% в семье наблюдались случаи ВСС.

Полнотранскриптомное секвенирование миокарда было проведено у 23 пациентов. Секвенирование проводилось в компании «Геноаналитика» (г. Москва) на приборе HiSeq 1500 (Illumina, США) с генерацией не менее 15 млн коротких чтений длиной 50 нуклеотидов.

Из полученных FASTQ-файлов при помощи алгоритма AdapterRemoval V2 были удалены двусмысленные основания и основания низкого качества. Подрезанные файлы были выровнены на транскриптом, полученный на основе версии генома человека GRCh38 и аннотации генов GRCh38.102, при помощи команды RSEM rsem-prepare-reference с опцией —star для генерации индексов STAR. Выравнивание производили при помощи алгоритмов STAR и RSEM (команды rsem-calculate-expression с опцией —star). Полученные псевдокаунты были нормализованы при помощи алгоритма TMM, реализованного в пакете R edgeR, команды calcNormFactors и алгоритма CPM, реализованного в пакете R limma, команде voom. Метод pvcaBatchAssess из пакета R pvca был использован для выявления наиболее значимых факторов, влияющих на формирование распределения образцов миокарда в пространстве главных компонент. Выявленные при помощи pvca факторы были использованы в качестве контрастов для выявления в дальнейшем значимо дифференциально экспрессирующихся генов. Для выявления дифференциальной экспрессии нормализованные риды были обработаны при помощи команд voom (оценка соотношения среднего к дисперсии, определение весов для наблюдений), lmFit (создание линейной модели, описывающей наблюдения) и eBayes (определение параметров модели) из пакета R limma. Для дальнейшего исследования были отобраны дифференциально экспрессирующиеся гены (ДЭГ), согласно критерию fold change (FC)>1.5, p. value moderated t.test limma с поправкой FDR на множественное тестирование <0,05.

Для верификации выявленных ДЭГ методом ОТ-ПЦР тотальную РНК из тканей МЖП выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США) и набора Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corp., США) согласно рекомендациям производителя. Для количественной оценки полученной РНК использовали набор Qubit RNA HS (High Sensitivity) Assay Kit и флуориметр Qubit 3.0 (Invitrogen™, США).

Комплементарную ДНК (кДНК) получали методом реакции обратной транскрипции на амплификаторе Т3 Thermocycler (T3 Thermoblock, Biometra, Германия) с помощью набора реагентов «ОТ-1» (НПО «Синтол», Россия) с применением подхода комбинирования специфичных обратных праймеров и Oligo(dT)15 в соотношении 1:1.

ПЦР в реальном времени с TaqMan зондами проводили с использованием прибора QuantStudio 3 Real-Time PCR Systems (Thermo Fisher Scientific, США). В состав реакционной смеси из расчета на один образец входили следующие реактивы (ООО «НПФ "Синтол"» и ООО «ДНК-синтез», Россия), Thermo Fisher Scientific, США): 3 мкл — ПЦР-Буфер-Б для Taq ДНК-полимеразы (×10); 3 мкл — смесь дНТФ (по 2мМ); 1,5 мкл — MgCl₂ (25 нмоль/мкл); по 1 мкл — прямой и обратный специфичные праймеры (10 пмоль/мкл); по 1 мкл — TaqMan зонды, специфичные для референсной и мутантной аллелей (5 пмоль/мкл); 0,2 мкл — Taq-полимераза (5 е.а./мкл), 5 мкл — ДНК-матрица и доводили до 30 мкл деионизированной водой. Условия амплификации были следующими: 180 с — 95 °C, затем 45 циклов 5 с 95 °C — 20 с. Для каждого образца реакции проводились в трех повторностях.

Ген-специфичные праймеры и TaqMan-зонды были подобраны на основе последовательности генома человека в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) (сборка GRCh38) с использованием программного обеспечения Beacon Designer 7.0 Premier Biosoft International (Palo Alto, США) (табл. 1). В качестве референсных генов были взяты PSMD6 и AARS1, которые в раннее опубликованном исследовании были включены в панель оптимальных референсов для анализа относительной экспрессии генов в тканях патологического миокарда [19].

Таблица 1. Последовательности ген-специфичных праймеров и зондов для детекции транскриптов генов PLCB1 и ADAMTS10 методом ОТ-ПЦР в реальном времени

Примечание. * — регистрационные номера транскриптов в базе данных GenBank (NCBI); FAM — флуоресцентный краситель; BHQ1 — тушитель флуоресценции.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения MS Excel 2010 (Microsoft) и Statistica 8 (StatSoft). Результаты представлены в виде значения 2^-ΔΔCt. Полученные данные анализировали с помощью непараметрического теста Манна—Уитни U.

На первом этапе для выявления наиболее значимых факторов, влияющих на формирование распределения образцов транскриптома миокарда в пространстве главных компонент, был проведен PVCA по следующим параметрам и их парным комбинациям: «ВСС», «терапия амлодипином», «семейная история ГКМП», «терапия периндоприлом», «гипертензия», «шумы в сердце», «пол». В результате были выбраны пять наиболее значимых факторов: «ВСС», «пол», «семейная история ГКМП», «прием амлодипина» и «прием периндоприла».

Для этих признаков была составлена модель, используемая в пакете программ limma для вычисления дифференциальной экспрессии. С ее использованием был проведен анализ данных полнотранскриптомного секвенирования тканей миокарда МЖП пациентов с тяжелой формой ГКМП, который позволил выявить дифференциально экспрессирующиеся гены по трем наиболее значимым факторам: пол пациента, наличие или отсутствие больных ГКМП в семейном анализе, статус приема периндоприла. В табл. 2 приведен список ДЭГ для одного из наиболее значимых по данным анализа главных компонент фактора — наличия или отсутствия семейной истории ГКМП. Для подтверждения полученных при полнотранскриптомном анализе данных был проведен анализ экспрессии трех случайно выбранных генов (CHRM3, ADAMTS10 и PLCB1), дифференциально экспрессирующиеся у пациентов с отрицательным и положительным семейным анамнезом ГКМП, на расширенной выборке пациентов с ГКМП с использованием метода ОТ-ПЦР в реальном времени.

Таблица 2. Гены, дифференциально экспрессирующиеся у пациентов с положительным и отрицательным семейным анамнезом ГКМП

Примечание. log_FC — логарифм FC (fold change); жирным шрифтом выделены гены, отобранные для верификации методом ОТ-ПЦР в реальном времени.

Для анализа относительной экспрессии методом ОТ-ПЦР группы сравнения формировались с учетом семейного анамнеза ГКМП/ВСС, а также наличия мутаций в генах тяжелой цепи миозина (MYH7) и миозин-связывающего белка C (MYBPC3). Таким образом, оценку дифференциальной экспрессии целевых генов проводили в следующих группах: несемейная форма ГКМП (нГКМП; пациенты с отрицательным семейным анамнезом при отсутствии мутаций в генах MYBPC3 и MYH7; 21 человек; средний возраст 55,5±11,4 года; соотношение полов 11(Ж)/10(М)) и семейная форма ГКМП (сГКМП; пациенты с положительным семейным анамнезом и/или наличием мутаций в генах MYBPC3 и MYH7; 27 человек; средний возраст 49,7±13,5 года; соотношение полов 15(Ж)/12(М)).

Анализ выявленных ДЭГ на уровне мРНК подтвердил ранее выявленное усиление экспрессии генов ADAMTS10 и PLCB1 в группе пациентов с семейной формой ГКМП (табл. 3). Представленность транскриптов гена CHRM3 оказалась ниже порога детекции при использовании ОТ-ПЦР в реальном времени, в связи с чем оказалось невозможным оценить экспрессию данного гена в тканях миокарда исследуемых групп пациентов.

Таблица 3. Результаты анализа изменения экспрессии генов PLCB1 и ADAMTS10 в тканях миокарда пациентов с ГКМП методом ОТ-ПЦР в реальном времени

Примечание. сГКМП — семейная форма ГКМП; нГКМП — несемейная форма ГКМП; ¹ — медиана; ² — 25—75 процентили; ³ — p-уровень значимости.

Проведенный анализ дифференциально экспрессирующихся генов в сформированных с использованием метода главных компонент подгруппах пациентов с ГКМП показал, что группы семейной и несемейной форм ГКМП достоверно отличаются по уровню экспрессии генов CHRM3, PLCB1 и ADAMTS10. На расширенной выборке пациентов было подтверждено увеличение экспрессии генов PLCB1 и ADAMTS10 методом ОТ-ПЦР в реальном времени. В связи с этим представляет интерес рассмотрение потенциальной роли этихх генов в патогенезе ГКМП.

Дифференциальная экспрессия гена ADAMTS10 в рассматриваемых группах может свидетельствовать об особенностях процессов ремоделирования внеклеточного матрикса при разных формах ГКМП. Этот ген кодирует цинк-зависимую протеазу семейства ADAMTS — дезинтегриноподобных и металло-протеаз с мотивом тромбоспондина 1 типа [20]. Функционально данный белок взаимодействует с фибриллином-1 и регулирует сборку микрофибрилл. Также известно, что мутации в гене ADAMTS10 приводят к развитию редкого генетического заболевания соединительной ткани — синдрому Вейля—Маркензани (WMS) [21, 22]. При этом, стоит отметить, что у людей с WMS по причине мутации в ADAMTS10 чаще наблюдаются пороки сердца, чем у людей с мутациями в гене ADAMTS17 [23].

Возможная роль дифференциальной экспрессии гена PLCB1 у пациентов с несемейной и семейной формами ГКМП более неоднозначна. Кодируемая данным геном фосфолипаза C бета 1 (PLCβ1) посредством гидролиза фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP2) и образования вторичных мессенджеров — инозитол-1,4,5-трифосфата (IP₃) и 1,2-диацилглицерина (DAG) участвует в регуляции внутриклеточного уровня Ca²⁺, что в свою очередь активирует каскады передачи сигнала, участвующие в регуляции активности КМ [24]. Для PLCβ1 показано существование двух вариантов сплайсинга — PLCβ1a (150 кДа) и PLCβ1b (140 кДа), отличающихся C-концевой последовательностью, определяющих их локализацию в клетке [25, 26]. В частности, PLC1a локализуется в цитоплазме, в то время как PLC1b обнаруживается не только в сарколемме, как считалось ранее, но и в Т-трубочках и ядерной оболочке [27]. Изучение функциональной роли изоформ PLCβ1 на примере культуры изолированных желудочковых КМ новорожденных крыс показало, что аденовирусная гиперэкспрессия сплайс-варианта PLC1b, в отличие от PLC1a, приводит к развитию гипертрофического фенотипа (увеличение площади клеток, соотношения белок/ДНК, экспрессии предсердного натрийуретического пептида (ANP)) [28]. Кроме того, было показано, что у крыс экспрессия PLC1a теряется во время постнатального развития, и полностью дифференцированные КМ экспрессируют только PLC1b. В связи с полученными данными о временном профиле экспрессии изоформ PLCβ1, его внутриклеточной локализации, а также на основании анализа иммунопреципитации с Gq, D. R. Grubb et al. предположили, что именно PLC1b является функционально активным вариантом сплайсинга PLCβ1 в КМ [25].

Вместе с тем стоит отметить, что активация PLCβ1 может опосредовать различные физиологические процессы в зависимости от внутриклеточной компартментализации, которая позволяет КМ отличать Ca²⁺, необходимый для сокращения, от Ca²⁺, необходимого для транскрипционной сигнализации [27]. На примере желудочковых КМ взрослых мышей E.F. Dahl et al. показали, что локальная активация PLCβ1 и достигаемый эффект зависят от типа рецептора, в частности рецепторы ангиотензина (AT-R) индуцируют сигнализацию в сарколемме, в то время как альфа-1 адренергические (a₁-AR) — в ядре, активируя IP3-зависимый ядерный экспорт HDAC5 [27]. При этом авторы предполагают, что a₁-AR/Gq-сигнализация является кардиопротекторной, в то время как сарколемальная Gq опосредует патологические изменения. D.R. Grubb et al. уже в другой работе показали, что повышенная экспрессия PLC1b в сердцах мышей, с демонстрацией профиля локализации в сарколемме и Т-канальцах приводила к сократительной депрессии, что в свою очередь может способствовать прогрессированию заболевания. Вместе с тем экспрессия PLC1b также приводила к снижению фосфорилирования фосфоламбана (PLN) и истощению запасов Ca²⁺ в саркоплазматическом ретикулуме, а также к снижению максимальных скоростей развития давления (+dP/dt) и повышению конечного диастолического давления ЛЖ [29]. Таким образом, эффект от активации PLCβ1 зависит от внутриклеточной локализации и вышестоящего эффектора, и потенциально может иметь как кардиопротекторное, так и патологическое влияние.

Однако стоит отметить, что по мере прогрессирования СН, как, например, при ГКМП, происходит деградация системы поперечных аксиальных трубочек (ТАТ), что, в свою очередь может сопровождаться нарушением внутриклеточной компартментализации сигнала [30]. В связи с этим также актуален вопрос изучения изменения специфики локальной внутриклеточной активации PLCβ1 на примере КМ с гипертрофическим фенотипом и дезорганизованной системой ТАТ для более точного понимания молекулярных механизмов патологической гипертрофии.

Более высокие уровни экспрессии генов PLCB1 и ADAMTS10 у пациентов с семейной формой ГКМП относительно пациентов с несемейной формой ГКМП могут свидетельствовать о наличии специфических молекулярно-генетических процессов, вовлеченных как в ремоделирование внеклеточного матрикса, так и во внутриклеточную Gq-сигнализацию. Однако с учетом перекрестной активности PLCβ1, зависящей от внутриклеточной локализации, актуально дальнейшее изучение выше/нижележащих мишеней в сигнальных путях с целью конкретизации молекулярной специфики патогенеза ГКМП у пациентов с несемейной и семейной формами заболевания.

Финансирование работы. Работа выполнена частично за счет Российского научного фонда (номер гранта 22-15-00243) и частично в рамках выполнения государственного задания Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».

Соблюдение этических стандартов. Исследование было одобрено этическим комитетом НИЦ «Курчатовский институт» — ИМГ (протокол №22/5 от 16.12.2022) и проведено в соответствии со стандартами Хельсинкской декларации. Для всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.