В современных условиях ускорения темпа жизни, технологических и социально-экономических преобразований все большее место в структуре заболеваемости занимают невротические, связанные со стрессом расстройства. Невротические расстройства возникают и развиваются при психотравмирующих (стрессовых) ситуациях, вызывающих эмоциональное перенапряжение и изменение функционального состояния лимбической системы мозга. Высокая активность эмоциональных зон лимбической системы при стрессе нарушает регуляторную функцию ЦНС в отношении интеграции между нервной, иммунной и эндокринной системами и адаптацию организма к изменениям факторов среды [1, 2]. Установлено, что нарушение иммунного ответа при эмоциональном стрессе является существенным звеном патогенеза психической дезадаптации [3, 4]. Действие стрессора сопровождается также каскадом реакций врожденного иммунитета с усилением продукции цитокинов, острофазных белков и других медиаторов воспаления [5, 6]. Установлена связь функциональной активности факторов воспаления, в частности альфа-1-протеиназного ингибитора (α1-ПИ) и лейкоцитарной эластазы (ЛЭ), с выраженностью депрессивной симптоматики в рамках различных психических заболеваний (аффективные расстройства, шизоаффективный психоз, шизофрения) [7—9].
Вместе с тем исследованию нейровоспаления при непсихотических психических расстройствах в литературе практически не уделено внимания, отсутствуют данные, касающиеся дифференциации компонентов врожденного и приобретенного иммунитета при разных клинических формах невротических расстройств. Ранее нами было показано, что факторы воспаления (α1-ПИ и ЛЭ) вовлечены в патогенез невротических расстройств, в частности расстройств адаптации [10]. Клинические проявления расстройств адаптации вариабельны, но в целом они характеризуются преобладанием или сочетанием астенической, тревожной, депрессивной симптоматики, требующим различных терапевтических подходов.
Цель настоящего исследования — изучение состояния врожденного и приобретенного иммунитета при расстройствах адаптации с различными клиническими прявлениями заболевания — с преобладанием астенического или тревожно-депрессивного синдрома.
Материал и методы
В обследование включены 25 пациентов, поступивших на лечение в клинику НИИ психического здоровья Томского национального исследовательского медицинского центра РАН с диагнозом по МКБ-10 «расстройства адаптации» (F43.2), которые входят в общую диагностическую рубрику «Невротические, связанные со стрессом и соматоформные расстройства» (F4).
Средний возраст обследованных — 43,2±9,6 года, длительность заболевания — от нескольких месяцев до 2 лет, 86% составляли женщины.
Диагностическую оценку и клиническую квалификацию невротических расстройств проводили в соответствии с критериями МКБ-10. По ведущему синдрому пациенты были распределены на две клинические группы: 1-я группа — пациенты с ведущим астеническим синдромом (9 человек), 2-я группа — пациенты с ведущим тревожно-депрессивным синдромом (16 человек).
Контрольную группу составили 23 здоровых человека, сопоставимые по возрасту и полу с пациентами.
Все пациенты были обследованы с использованием разработанной на базе отделения пограничных состояний «Клинической карты обследования больного», адаптированной к задачам настоящего исследования.
Кровь для биологических исследований брали из локтевой вены утром натощак с использованием стерильной системы однократного применения Vacutainer (Becton Dickinson, США): для выявления фенотипов иммунокомпетентных клеток методом проточной цитометрии кровь забирали в пробирки с антикоагулянтом EDTA; для получения сыворотки крови — в пробирки с активатором свертывания крови; сыворотку разливали по 0,2—0,3 мл в пробирки для микропроб и хранили при –80°C до использования.
Для определения состояния приобретенного иммунитета использовали методы, которые изложены далее.
Фенотипирование субпопуляций лимфоцитов с поверхностными рецепторами к основным кластерам дифференцировки (CD) осуществляли в образцах крови с антикоагулянтом EDTA на проточном цитофлюориметре BD FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с применением набора реагентов фирмы. Выявляли общий пул лимфоцитов (CD45+); T-клетки (CD3+CD19–); T-хелперы (CD3+CD4+); цитотоксические T-лимфоциты (CD3+CD8+); B-лимфоциты (CD3–CD19+). Цитометрию проводили согласно протоколу к набору. Детекцию клеток с поверхностными рецепторами к основным кластерам дифференцировки проводили в программе Cell Quest Pro. Количество клеток выражали в процентах от общего пула лимфоцитов (CD45+).
Определение концентрации иммуноглобулинов M, G, A в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием стандартных наборов ИФА-БЕСТ (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Новосибирск, Россия), концентрацию выражали в г/л.
Определение уровня аутоантител (аАТ) к нейроспецифическим белкам S100b и общему белку миелина (ОБМ) в сыворотке крови проводили методом стандартного твердофазного ИФА. Для активации иммунологического планшета (Costar, США) использовали белок S100b или ОБМ (Sigma, США). Для идентификации связавшихся аАТ использовали конъюгат кроличьих антител, меченных пероксидазой хрена к IgG и IgM человека («ИМТЕК», Россия). Измерение оптической плотности (ОП) проводили через 2—3 мин после остановки реакции при длине волны 492 нм на спектрофотометре MultiskanRC (Labsystems, Финляндия). Уровень аАТ оценивали в единицах ОП, прямо пропорциональной интенсивности окраски. Чувствительность метода — 0,2 ОП, коэффициент вариации результатов определения уровня аАТ в одном и том же образце (10 определений) — не более 5%.
Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом селективной преципитации комплексов «антиген — антитело» из сыворотки крови раствором полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ-6000, Serva) в конечной концентрации 3,75% с последующим спектрофотометрическим определением ОП преципитата. Уровень ЦИК выражали в условных единицах по величине ОП опыта, умноженной на 1000.
Для определения состояния врожденного иммунитета фагоцитарную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов определяли методом, который основан на определении способности нейтрофилов периферической крови поглощать частицы меламиноформальдегидного латекса; размер частиц 1,5—2 мкм [11]. Высчитывали фагоцитарный индекс (ФИ — % фагоцитирующих клеток) и фагоцитарное число (ФЧ — среднее количество поглощенных частиц фагоцитирующими клетками).
Количество натуральных клеток-киллеров (NK-клеток) фенотипа CD3–CD16+CD56+ определяли описанным выше методом проточной цитометрии на цитофлюориметре BD FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с применением набора реагентов этой фирмы.
Эластазную активность сыворотки крови, обусловленную на 90% присутствием в сыворотке комплекса эластазы нейтрофилов (ЛЭ) с α1-ПИ, определяли ферментативным методом, предложенным В.Л. Доценко и соавт. [12]. Активность ЛЭ измеряли по скорости расщепления эластазой специфического хромогенного субстрата N-трет-бутоксикарбонил-L-аланин-паранитрофенилового эфира (BOC-Ala-ONp) (ICN Biomedicals Inc.) в условиях, подобранных для полного высвобождения фермента из комплекса ЛЭ-α1-ПИ, при 25°C. Регистрировали изменение ОП с помощью компьютерной программы SWIFT 1000 ReactionKinetics (Version 2.03, Biochrom Ltd) на спектрофотометре Ultrospec 1100 (Amercham) в течение 3 мин при длине волны 347 нм, соответствующей максимуму поглощения продукта реакции. Активность ЛЭ выражали в нмоль/мин*мл. Чувствительность метода — 40 нмоль/мин*мл, коэффициент вариации результатов определения активности ЛЭ в одном и том же образце (10 повторений) — не более 8%.
Метод определения активности α1-ПИ. Измерение активности α1-ПИ в сыворотке крови проводили с помощью спектрофотометрического метода [13]. Метод основан на взаимодействии этого ингибитора с трипсином при использовании в качестве субстрата N-α-бензоил-L-аргининэтилового эфира гидрохлорида (BAEE) (ICN Biomedicalnc): α1-ПИ образует с трипсином комплекс, не гидролизующий BAEE. Активность α1-ПИ в сыворотке крови определяли по степени торможения BAEE-эстеразной активности трипсина определенным количеством исследуемой сыворотки. Регистрировали изменение ОП с помощью компьютерной программы SWIFT 1000 Reaction Kinetics (Version 2.03, Biochrom Ltd) на спектрофотометре Ultrospec 1100 (Amercham) в течение 3 мин при длине волны 253 нм. Активность α1-ПИ выражали в ингибиторных единицах на мл (ИЕ/мл). Чувствительность метода — 5 ИЕ/мл, коэффициент вариации результатов определения функциональной активности α1-ПИ в одном и том же образце — не более 5%.
Статистическую обработку данных осуществляли с применением пакета программ Statistica для Windows, версия 12.0. Межгрупповые различия определяли с использованием критерия Манна—Уитни. Описательная статистика представлена медианой (Ме) и межквартильным интервалом (LQ—UQ). Корреляционный анализ проводили с расчетом коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (rs). Критический уровень значимости p=0,05.
Исследование было проведено с соблюдением принципов информированного согласия Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации и одобрено Локальным этическим комитетом при НИИ психического здоровья Томского национального исследовательского медицинского центра.
Результаты и обсуждение
При поступлении пациентов в стационар клинические проявления расстройств адаптации были крайне вариабельны и полиморфны.
Как указывалось выше, по ведущему синдрому все обследованные были распределены на две клинические группы: пациенты с ведущим астеническим синдромом (1-я группа) и пациенты с ведущим тревожно-депрессивным синдромом (2-я группа). В первом случае клинические проявления расстройства адаптации характеризовались повышенной утомляемостью, эмоциональной лабильностью, слабостью, головными болями, нарушениями сна, разной степенью выраженности симптомов психической и физической истощаемости. У пациентов 2-й группы, с ведущим тревожно-депрессивным синдромом, в клинической картине преобладало тревожное настроение. Тревожность проявлялась диффузным, часто неопределенным ощущением опасения чего-то, ощущением угрозы, чувством напряжения, повышенной раздражительностью. За раздражительностью нередко скрывались симптомы депрессии — сниженное настроение, пессимистические мысли в отношении текущих и будущих событий.
Результаты иммунологического исследования приведены в табл. 1.
Таблица 1. Показатели врожденного и приобретенного иммунитета в группах пациентов с расстройством адаптации, Me (LQ-UQ)
| Показатель | Группа обследованных | Достоверность различий между группами пациентов (p) | ||
| 1-я (n=9) | 2-я (n=16) | здоровые (n=23) | ||
| Лейкоциты, 109/л | 5,7 (5,5—7,3) | 6,6 (5,7—8,0) | 6,4 (5,7—6,9) | 0,411703 |
| Лимфоциты, % | 36 (30—40) | 37 (31—44) | 38 (34—40) | 0,671125 |
| Лимфоциты, абс. | 2,06 (1,76—2,63) | 2,66 (1,90—3,04) | 2,44 (2,15—2,70) | 0,269607 |
| CD3+CD19–, % | 72 (69—76) | 76 (73—80) | 77 (70—79) | 0,234483 |
| CD3+CD4+, % | 44 (38—47) p1=0,005317 | 50 (47—54) | 51 (46—56) | 0,029285 |
| CD3+CD8+, % | 30 (27—34) p1=0,014211 | 25 (23—31) | 25 (19—27) | 0,183379 |
| CD3+CD4+/CD3+CD8+ | 1,46 (1,20—1,74) p1=0,004092 | 2,02 (1,31—2,19) | 2,12 (1,79—2,76) | 0,074532 |
| CD3–CD19+, % | 13 (10—15) | 10 (8—12) p1=0,007277 | 13 (10—15) | 0,100632 |
| CD3–CD16+CD56+, % | 10 (7—14) | 11 (10—14) | 10 (9—14) | 0,798907 |
| IgM, г/л | 1,63 (1,16—2,57) | 1,90 (1,41—3,16) | 2,08 (1,43—2,38) | 0,571300 |
| IgG, г/л | 23,04 (16,89—30,10) p1=0,011911 | 20,07 (11,41—27,72) | 14,26 12,40—16,49) | 0,479149 |
| IgA, г/л | 1,23 (1,14—1,74) | 1,37 (1,09—2,73) | 1,46 (1,27—2,21) | 0,842929 |
| ЦИК, усл. ед. | 44 (29—75) p1=0,029297 | 73 (55—107) | 92 (54—114) | 0,084218 |
| ФИ, % | 60 (52—74) | 55 (51—60) | 58 (52—60) | 0,411703 |
| ФЧ | 6,6 (5,6—7,0) | 5,9 (5,1—6,1) p1=0,040246 | 6,2 (5,5—7,5) | 0,156377 |
| ЛЭ, нмоль/мин*мл | 249,5 (220,3—259,2) p1=0,036011 | 245,5 (221,7—263,6) p1=0,002984 | 220,3 (207,8—232,0) | 0,842929 |
| а1-ПИ, ИЕ/мл | 35,3 (29,5—38,8) | 43,1 (39,9—47,2) p1=0,000008 | 33,6 (29,6—36,3) | 0,000261 |
| аАТ к S-100b, Ед. опт. пл. | 0,74 (0,68—0,81) | 0,65 (0,60—0,67) | 0,72 (0,65—0,78) | 0,234483 |
| аАТ к ОБМ, Ед. опт. пл. | 0,66 (0,65—0,84) | 0,64 (0,55—0,70) | 0,76 (0,69—0,84) | 0,712881 |
Примечание. p1 — достоверность различий к контролю.
Представленные в табл. 1 данные показывают различия между обобщенными профилями иммунного статуса пациентов с разными клиническими проявлениями расстройств адаптации, которые заключаются в основном в преобладании отклонений от контроля показателей приобретенного иммунитета в 1-й группе и параметров врожденного иммунитета во 2-й группе.
У пациентов 1-й группы было отмечено снижение количества T-хелперов фенотипа CD3+CD4+ (p1=0,005317) и повышение количества цитотоксических T-лимфоцитов (CD3+CD8+), (p1=0,014211), за счет чего был снижен и коэффициент отношения этих субпопуляций эффекторных клеток (p1=0,004092). На фоне повышения концентрации сывороточного иммуноглобулина G (p1=0,011911) уровень ЦИК был снижен (p1=0,029297), что свидетельствует о нарушении иммуного процесса у пациентов с астеническим синдромом. Установлено также повышение одного из факторов врожденного иммунитета — активности ЛЭ (p1=0,036011).
Во 2-й группе пациентов имело место отклонение от показателей контроля одного из компонентов приобретенного иммунитета — B-лимфоцитов (CD3–CD19+) и большинства факторов врожденного иммунитета, кроме количества NK-клеток (CD3–CD16+CD56+). Процент фагоцитирующих клеток (ФИ) в группах пациентов и здоровых лиц был сопоставим, при этом среднее значение числа поглощенных частиц латекса (ФЧ) во 2-й группе было снижено (p1=0,040246). Наряду с высокой активностью ЛЭ (p1=0,002984) установлено значимое повышение активности острофазного белка α1-ПИ (p1=0,000008).
Количество периферических T-хелперов у пациентов 1-й группы было снижено по отношению к контролю (p1=0,0053) и к показателю во 2-й группе (p1=0,0293). Наиболее выраженным оказалось повышение активности α1-ПИ у пациентов 2-й группы как по отношению к контролю (p1=0,000008), так и по отношению к 1-й группе пациентов (p=0,000261).
Уровень аАТ к нейроспецифическим белкам в обеих группах пациентов не отличался от контроля, что свидетельствует об отсутствии значимых органических поражений мозга, поскольку нейроспецифические белки, в частности белок S-100b и основной белок миелина, являются ранними биомаркерами различных повреждений мозговой ткани [14, 15].
Дополнительная информация о вкладе системы иммунитета в особенности течения расстройств адаптации может быть получена на основе применения концепции, рассматривающей иммунную систему как сложную систему компонентов, работающую во взаимосвязи всех ее составляющих [16—18]. Согласно этой концепции, адекватный иммунный ответ на изменение внутренней и внешней среды обеспечивается взаимодействием всех компонентов системы. Изменение одного параметра распространяется на всю систему, и «сдвиг» системы может быть скомпенсирован изменениями других компонентов (состояние нормы) или декомпенсирован (состояние патологии). При этом структура взаимосвязей между компонентами системы в норме и при патологических состояниях может быть различной.
Анализ сопряженности компонентов системы иммунитета (без учета ФИ и факторов воспаления ЛЭ, а1-ПИ) показал, что как в контроле (табл. 2), так и при астеническом синдроме (табл. 3) практически все взаимосвязи образуют показатели внутри отдельных звеньев клеточного или гуморального иммунитета, кроме одной связи (CD8 и IgA) в контроле и одной при астеническом синдроме (Лц и IgA).
Таблица 2. Структура корреляционных связей между показателями врожденного и приобретенного иммунитета в группе здоровых
| Показатель | Критерии Спирмена | |
| Rs | p | |
| CD3 и CD4 | 0,778330 | 0,000012 |
| CD3и CD19 | –0,608979 | 0,002042 |
| CD3 и CD16 | –0,760184 | 0,000026 |
| CD4 и CD16 | –0,657585 | 0,000650 |
| CD8 и CD19 | –0,560021 | 0,005452 |
| IgM и аАТ к ОБМ | 0,630903 | 0,001247 |
| IgM и IgA | 0,423628 | 0,043973 |
| IgG и ОБМ | 0,448566 | 0,031805 |
| аАТ к S-100b и аАТ к ОБМ | 0,655012 | 0,000694 |
| CD8 и IgA | 0,498390 | 0,015500 |
| ЦИК и ЛЭ | 0,486888 | 0,018465 |
| аАТ к S-100b и ФИ | 0,428718 | 0,041233 |
Примечание. Здесь и в табл. 3, 4. Курсив — связь между параметрами клеточного и гуморального иммунитета; жирный шрифт — связь между параметрами врожденного и адаптивного иммунитета (кроме CD16); Лц — лейкоциты.
Таблица 3. Структура корреляционных связей между показателями врожденного и приобретенного иммунитета в группе пациентов с астеническим синдромом
| Показатель | Критерии Спирмена | |
| Rs | p | |
| Лц и CD 3 | 0,845196 | 0,004117 |
| Лц и CD4 | 0,760504 | 0,017353 |
| Лц и CD16 | –0,719672 | 0,028819 |
| IgA и ЦИК | 0,833333 | 0,005266 |
| Лц и IgA | 0,761513 | 0,017117 |
| CD19 и ЛЭ | –0,866667 | 0,002495 |
| IgA и ФИ | –0,677830 | 0,044809 |
| ЦИК и ФИ | –0,769881 | 0,015240 |
Иная картина сопряженности между компонентами иммунитета, отражающая интегративные процессы в системе, была установлена при тревожно-депрессивном синдроме (табл. 4). Выявлены множественные отрицательные ассоциации между показателями клеточного и гуморальногго иммунитета (Лц и IgM; Лц и ЦИК; CD4 и igG; CD8 и IgM; CD19 и IgM); кроме того, общее количество взаимосвязей в 1,6 раза превышает количество ассоциаций, выявленных при астеническом синдроме, что свидетельствует о большей напряженности функционирования системы иммунитета.
Таблица 4. Структура корреляционных связей между показателями врожденного и приобретенного иммунитета в группе пациентов с тревожно-депрессивным синдромом
| Показатель | Критерии Спирмена | |
| Rs | p | |
| Лц и CD16 | 0,765961 | 0,009787 |
| CD4 и CD8 | –0,640256 | 0,046140 |
| IgG и IgA | 0,648485 | 0,042540 |
| аАТ к S-100b и аАТ к ОБМ | 0,675844 | 0,031935 |
| Лц и IgM | –0,778119 | 0,008033 |
| Лц и ЦИК | –0,636364 | 0,047912 |
| CD4 и IgG | –0,646353 | 0,043454 |
| CD8 и IgM | 0,668696 | 0,034510 |
| CD19 и IgM | –0,697584 | 0,024914 |
| CD3 и ЛЭ | 0,668696 | 0,034510 |
| CD4 и ФИ | –0,685018 | 0,028827 |
| Лц и α1-ПИ | 0,769697 | 0,009222 |
| ЦИК и α 1-ПИ | –0,721212 | 0,018573 |
Возникает вопрос, почему исследуемые показатели, в частности клетки с различными кластерами дифференцировки (CD), образуют достоверные корреляционные связи не с лимфоцитами, а с лейкоцитами. Возможно, это обусловлено тем, что в общем пуле лейкоцитов основную долю (до 70%) составляют нейтрофилы, которые, по данным литературы последних лет, не только играют значимую роль как эффекторы врожденного иммунитета, но также участвуют в механизмах взаимодействия между врожденным и приобретенным иммунным ответом, усиливая воспаление [19, 20].
При анализе корреляционных связей между компонентами приобретенного и врожденного иммунитета (за исключением NK-клеток CD16) выявлены следующие особенности. В контроле и у пациентов с астеническим синдромом показатели приобретенного иммунитета были связаны с показателями фагоцитоза и активности ЛЭ (ЦИК и ЛЭ; аАТ к S-100b и ФИ — в контроле; CD19 и ЛЭ; IgA и ФИ; ЦИК и ФИ — при астеническом синдроме). При тревожно-депрессивном синдроме обнаруживается вовлеченность в «межсистемную» (система врожденного и система приобретеного иммунитета) интеграцию α1-протеиназного ингибитора (Лц и α1-ПИ; ЦИК и α1-ПИ).
Ранее нами было показано, что астения в рамках различных заболеваний, в частности при шизофрении, имеет свой иммунологический портрет, который заключается в сниженном или сопоставимым с контролем уровне активности ЛЭ на фоне повышения других маркеров воспаления, в том числе и α1-ПИ [21]. В данном исследовании, включающем небольшую выборку пациентов, повышение активности ЛЭ выявлено в обеих рассматриваемых группах пациентов с расстройством адаптации. В первую очередь это может быть объяснено, в частности, особенностями патогенеза и разными причинами, запускающими процесс воспаления при эндогенных психозах, психосоматических заболеваниях и невротических, связанных со стрессом расстройствах. Ведущим этиологическим фактором расстройств адаптации является психоэмоциональный стресс, активирующий стресс-реализующую систему, нейрональную и микроглиальную активность с усилением продукции медиаторов воспаления [5, 6]. Тем не менее полученные результаты позволяют предположить, что для ведущего астенического синдрома важным фактором развития иммунного ответа на действие психотравмирующих ситуаций является активность ЛЭ, и это косвенно подтверждается данными корреляционного анализа, выявившего достоверную связь между фагоцитарной активностью нейтрофилов (ФИ) и их протеолитическим ферментом — ЛЭ (см. табл. 3). Однако полученные результаты должны оцениваться как предварительные в связи с относительно небольшой численностью выборки в рассматриваемых группах.
Таким образом, проведенное исследование показало, что при расстройствах адаптации выявляются нарушения преимущественно в системе приобретенного иммунитета в группе пациентов с преобладанием в клинической картине астенического синдрома и в системе врожденного иммунитета — в группе с преобладанием тревожно-депрессивного синдрома. В группе пациентов с ведущим тревожно-депрессивным синдромом наряду с высоким уровнем активности ЛЭ установлено повышение активности α1-ПИ как по отношению к контролю, так и по отношению к группе пациентов с астеническим синдромом, что свидетельствует об усилении роли воспалительных факторов в патогенезе этих состояний. Вероятно, это связано с тревожно-депрессивной симптоматикой, что подтверждается данными исследований факторов воспаления при других заболеваниях, характеризующихся наличием депрессивных расстройств [7—9].
Выявлены существенные различия в структуре корреляций исследуемого комплекса иммунологических показателей при различном клиническом течении расстройств адаптации с повышением при тревожно-депрессивном синдроме общего числа связей, а также отрицательных ассоциаций между компонентами клеточного и гуморального иммунитета, усилением вовлеченности в интеграцию приобретенного и врожденного иммунитета α1-ПИ.
Таким образом, особенностью реакции на психоэмоциональный стресс у пациентов с ведущим тревожно-депрессивным синдромом является высокая активность α1-ПИ, что наряду с усилением корреляционных межсистемных ассоциаций и вовлеченности данного острофазного белка в интеграцию приобретенного и врожденного иммунитета позволяет рассматривать α1-ПИ в качестве дополнительного параклинического критерия, повышающего точность и объективность диагностики характера течения расстройства адаптации. Более точная диагностика ведущего синдрома заболевания может способствовать своевременному выбору адекватных психическому состоянию пациента психофармакологических средств и повышению эффективности лечения.
Исследование выполнено за счет бюджетного финансирования тем НИР АААА-А19-119020690013-2 и АААА-А19-119040490097-2.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.