Протеин В1 высокомобильной группы и возможность амплификации воспаления при преэклампсии и угрозе преждевременных родов

Как преэклампсия (ПЭ), так и угроза преждевременных родов (УПР) сопровождаются воспалением. В связи с открытием аларминов все более актуальным становится выяснение их роли в индукции, поддержании и усилении воспаления. Нарастание воспаления является ключевым механизмом, определяющим прогрессирование ПЭ, степени ее тяжести. В случае с УПР возможен переход из угрозы в преждевременные роды. Одним из классических молекулярных паттернов, связанных с повреждением (damage-associated molecular pattern — DAMP), или аларминов, является протеин В1 из группы высокомобильных белков (high-mobility group box 1 protein — HMGB1), участвующий в выполнении многих критических функций, необходимых для физиологического протекания беременности [1]. Он связывается с рецептором конечных продуктов повышенного гликирования (receptor for advanced glycation end products — RAGE) [2], а также с Toll-подобным рецептором 4 (TLR4) [3]. Его связывание с этими рецепторами может как индуцировать воспаление, так и изменять его, так как этот алармин содержит в своей структуре провоспалительный и антивоспалительный домен [4]. HMGB1 является ядерным протеином, поэтому необходим стимул для его выхода в цитоплазму, а затем из клетки, после чего он может оказывать свое внеклеточное действие как сигнал опасности (danger signal). Пассивное освобождение HMGB1 из клетки индуцируется гипоксией, воспалением, различными формами гибели клеток, например пироптозом. Активация секреции HMGB1 может быть вызвана провоспалительными цитокинами, например фактором некроза опухолей альфа (TNF-α), активацией инфламмасом [5]. Все эти факторы, а именно гипоксия, воспаление, провоспалительные цитокины, пироптоз, зарегистрированы при ПЭ, а соответственно, могут повышать выход HMGB1 из клеток, в том числе из трофобласта.

Изучение уровня аларминов и других провоспалительных молекул как возможных амплификаторов воспаления при преэклампсии и угрозе преждевременных родов.

Обследованы 246 беременных (III триместр) женщин в возрасте от 20 до 36 лет. Они были разделены на три группы: 1-я группа — 158 женщин с преэклампсией; 2-я группа — 27 женщин с УПР, обязательным компонентом которых был сокращающийся миометрий; контрольная группа — 61 женщина с физиологически протекающей беременностью. Диагноз ПЭ ставили на основании МКБ-10. Всем беременным проведено традиционное комплексное клинико-лабораторное исследование. Ультразвуковое исследование проводилось на аппарате Voluson E6. В сыворотке крови определяли уровень HMGB1с помощью наборов HMGB1 ELISA (IBL International GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Чувствительность набора 0,1 нг/мл. Уровень интерферона гамма (IFN-γ) в сыворотке крови определяли с помощью набора «гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия). Чувствительность набора 20 пг/мл. Уровень мочевой кислоты (МК) общего протеина, альбумина, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови определяли на биохимическом анализаторе AU-680 (Beckman Coulter Inc., США) с помощью стандартных наборов. Уровень лактата определяли в капиллярной крови на аппарате Radiometer ABL 800 FLEX. Уровень стабильных метаболитов оксида азота (NO) в сыворотке крови определяли с использованием реактива Грисса [6]. Подсчет клеток крови осуществляли на автоматическом гематологическом анализаторе System XN-550 (Япония).

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica v. 10.0. Применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Различия считались достоверными при p<0,05.

Как видно на рис. 1, уровень HMGB1 повышается при ПЭ примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем. При УПР HMGB1 также был повышен в 1,6 раза по сравнению с контролем. Индивидуальные показатели при УПР были более гетерогенными, чем при ПЭ. Более высокие значения HMGB1 отмечались при тяжелой форме ПЭ, чем при умеренной ПЭ. Отметим, что исследования, касающиеся уровня HMGB1 при ПЭ и УПР, являются приоритетными и проведены впервые в России.

Рис.1. Уровень протеина B1 высокомобильной группы в сыворотке крови в контроле (1), при преэклампсии (2) и при угрозе преждевременных родов (3).

* — p<0,01 по сравнению с контролем.

Найденное нами повышение HMGB1 в сыворотке при ПЭ и УПР может индуцировать, поддерживать и усиливать стерильное воспаление в таких внутриматочных компартментах, как плацента, хорион, миометрий, где найдены рецепторы RAGE и TLR4 для этого протеина [7]. Возможно, в освобождении HMGB1 участвуют IFN-γ через TNF-α и янускиназный механизм [8]. B. Rendon-Mitchel и соавт. [8] рассматривают HMGB1 как медиатор позднего воспалительного ответа, способный утяжелять воспалительный ответ. Это возможно и по такому механизму, как его взаимодействие с липополисахаридом (ЛПС), в лизосомах внутри клетки этот механизм ассоциируется с последующей активацией каспазы-11, что ведет к пироптозу и усилению воспаления [9]. Особая роль HMGB1 как классического сигнала опасности определяется тем, что, как показали N. Gomez-Lopez и соавт. [10], его интраамниотическое введение экспериментальным животным индуцирует преждевременные роды. При ПЭ его высокая экспрессия в плаценте вместе с TLR4 может тормозить инвазию трофобласта [11], а также вместе с МК в периферической крови индуцировать дисфункцию эндотелия [12], ключевой механизм ПЭ. Специфика клинических проявлений, на наш взгляд, обусловлена локальным в первом случае и системным во втором случае действием HMGB1.

Трехкратное измерение стабильных продуктов NO (NO₂+NO₃) показало, что их уровень имел только тенденцию к повышению: 17,17±4,2 мкмоль/л в контроле и 21,85±6,3 мкмоль/л при ПЭ. В литературе имеются различные данные в отношении уровня NO при ПЭ (повышенный, нормальный, пониженный). Однако превалирующая точка зрения по этому вопросу такова, что биодоступность NO при ПЭ снижается. Биодоступность NO — это сложное и во многом непонятое состояние. NO — короткоживущий газотрансмиттер, однако при соединении его с другими структурами, например с альбумином или мочевой кислотой, срок его жизни существенно удлиняется. К примеру, в дитиол-динитрозил-железном комплексе срок жизни NO удлиняется до 4—8 ч. Существуют и более простые формы соединений Fe-NO, синтезируемые плацентой. Важность NO при ПЭ определяется его свойствами как дилататора сосудов, а также его участием в васкулогенезе и ангиогенезе. Найдена и непосредственная связь между HMGB1 и NO на уровне эндотелиальных клеток (ЭК). Так, Q. Zhou и соавт. [13] показали, что снижение уровня HMGB1 в ЭК ведет к снижению генерации NO, повышению артериального давления, торможению ангиогенеза. Важно и то, что именно с повышением освобождения HMGB1 из гипоксической плаценты связывают такой признак ПЭ, как тромбофилия [14]. Образование NO при ПЭ, то есть в условиях гипоксии в утеро-плацентарном пространстве, имеет характерные особенности. А именно: при нормоксии основным продуцентом NO становятся NO-синтазы, субстратом для которых являются L-аргинин и кислород. В условиях дефицита кислорода основным продуцентом NO становится ксантиноксидаза, субстратом для которой является нитрит-анион (NO₂^–). X.M. Williams и соавт. показали, что нитрит обладает непрямым антиоксидативным свойством за счет редукции ксантиноксидазой катализируемой продукции супероксида [15].

Уровень альбумина при ПЭ был снижен примерно на 15% при ПЭ средней степени тяжести и на 20% при тяжелой ПЭ. Мы исследовали динамику снижения уровня альбумина при тяжелой ПЭ в последние трое суток перед кесаревым сечением (КС). В последние сутки и меньше до КС включены значения сывороточного альбумина, определяемые непосредственно в день оперативного родоразрешения. Оказалось, что наиболее значимое снижение уровня альбумина регистрировалось в последние сутки перед КС, когда снижение составляло 2,36 г/л. После родоразрешения также отмечалось дальнейшее снижение уровня альбумина — на 1,19 г/л. Эти данные показывают, что в ходе развития ПЭ наступает критический период, в ходе которого требуется родоразрешение, каковым и было оперативное родоразрешение. Кроме того, сравнение снижения уровня альбумина после КС и в группе непосредственно перед КС показывает, что снижение в этой группе было более значительным, чем после КС. Это указывает на серьезное ухудшение состояния матери и, соответственно, плода.

Альбумин в настоящее время рассматривается как главный резервуар NO в виде S-нитрозоальбумина (SNO-альбумина) [16]. Важным обстоятельством в приложении к ПЭ является то, что для освобождения NO из SNO-альбумина требуются аскорбиновая кислота (АК) и одновалентная медь. АК способна переводить медь из двухвалентного в одновалентное состояние, взаимодействуя с SNO-альбумином, она способна катализировать освобождение NO из этого комплекса [16]. Отметим, что уровень аскорбата при ПЭ снижен [17]. Возможным механизмом снижения уровня АК может являться редуцированное поглощение АК в кишечнике под воздействием TNF-α за счет снижения активности натрий-зависимого транспортера 1 АК [18]. Ранее нами было показано повышение уровня TNF-α при ПЭ. Так замыкается ось «цитокины — алармины — NO» в патогенезе ПЭ. NO является важнейшим газотрансмиттером, осуществляющим релаксацию сосудов, а также такие функции, как васкулогенная и ангиогенная, которые нарушены при ПЭ. Снижение уровня аскорбата диктуется и тем условием, что он проявляет ангиостатические свойства, в то время как при беременности необходимы стимуляторы ангиогенеза. Исходя из вышесказанного, можно говорить, что альбумин несет не только антиоксидантную функцию, но также и, возможно, функцию донора NO при ПЭ, что необходимо учитывать при анализе состояния и хода течения ПЭ.

Уровень МК был в контроле 241±6,1 мкмоль/л, при ПЭ средней степени тяжести — 311±14,0 мкмоль/л, при тяжелой ПЭ — 446±21,1 мкмоль/л. Ее концентрация по ходу развития ПЭ нарастала и в 31% случаев превышала 420 мкмоль/л, то есть границу образования микрокристаллов, относящихся к DAMP, играющих важную роль в активации клеток иммунной системы по классическому пути, в то время как для успешной беременности требуется альтернативная активация. Повышенный уровень МК, зафиксированный нами при ПЭ, способен снижать уровень NO за счет связывания его с МК и образования 6-аминоурацила [19].

Исследование содержания IFN-γ в сыворотке при ПЭ показало его повышение (11,1±0,263 пг/мл против 7,7±0,152 пг/мл в контроле, p<0,01). IFN-γ является модификатором ремоделирования спиральных артерий. Децидуальные естественные киллерные клетки — главный источник этого цитокина [20]. Кроме того, IFN-γ способен усиливать продукцию МК за счет положительной регуляции экспрессии ксантиноксидредуктазы [21], а также может индуцировать освобождение HMGB1 через TNF-α-зависимый механизм [22].

ЛДГ, в нашем случае ЛДГА, так как именно эта изоформа активируется при гипоксии, также была повышена как при умеренной, так и при тяжелой ПЭ (рис. 2).

Рис. 2. Уровень лактатдегидрогеназы при нормальной беременности (1), преэклампсии средней (2) и тяжелой степени (3).

* — p<0,01 по сравнению с контролем.

Анализ индивидуальных данных показал, что при тяжелой ПЭ отмечается бóльшая гетерогенность показателей, чем при умеренной ПЭ.

В некоторых случаях концентрация ЛДГ превышала 500—600 Ед/л. В особо тяжелых случаях, примерно в 1% случаев, ее концентрация превышала 1000 Ед/л. Клинически это было связано с тяжелой внутриматочной гипоксией плода. Возможно, что ее сверхвысокие концентрации указывают на критический уровень травматизации ткани плаценты при нарастающей гипоксии.

Лактат как показатель, отражающий повышенный гликолиз при гипоксии, также был повышен при ПЭ (рис. 3). Лактат участвует в формировании ацидоза. Ацидоз в настоящее время признан как DAMP [23], способный изменять функцию ферментов, цитокинов, факторов роста. Повышенный уровень ЛДГ, найденный нами, а также повышение уровня лактата, зарегистрированное при ПЭ, обусловливают лактилирование гистонов, индуцируя пироптоз через HMGB1, и гипоксию в утероплацентарном пространстве [24].

Рис. 3. Процентное соотношение различных уровней лактата при преэклампсии средней степени тяжести и тяжелой преэклампсии (ммоль/л).

На основе полученных данных и данных литературы мы представляем возможную схему амплификации воспаления при ПЭ (рис. 4).

Рис. 4. Возможный механизм амплификации воспаления при преэклампсии.

NLRP3 — NOD-подобный рецептор, содержащий домен с протеином 3.

Из схемы видно, что инициирующим фактором может быть повышение уровня IFN-γ, который через свой рецептор стимулирует наработку МК, которая через TLR4 активирует ядерный фактор каппа-В (NF-κB), приводящий к повышению синтеза и секреции провоспалительных цитокинов и индукции воспаления [25]. Гипоксия через ацидоз, активацию NLRP3-инфламмасом и пироптоз ведет к повышенному освобождению HMGB1, который через рецепторы TLR4 и RAGE способен усиливать воспаление. На этом примере хорошо видно взаимодействие цитокинов и аларминов в амплификации воспаления.

Важность определения нарастания воспаления трактуется тем, что только при нарастании воспаления, в основе которого может быть гипоксия или другие рассматриваемые факторы, идет прогрессия ПЭ; или в случае с УПР может происходить переход УПР в реальные преждевременные роды. Более того, быстрое нарастание воспаления при ПЭ является предиктором возможного перехода в терминальную стадию, когда необходимо родоразрешение, что и подтверждается клинически.

1. Оценка уровня HMGB1 при преэклампсии и угрозе преждевременных родов имеет большие перспективы как для понимания роли аларминов при этих патологиях, так и для клинической характеристики уровня воспаления. С другой стороны, этот показатель и его нарастание может быть предиктором исхода преэклампсии и угрозы преждевременных родов.

2. Связка «альбумин — оксид азота» и формируемый при этом S-нитрозоальбумин может быть показателем нитративного стресса при преэклампсии.

3. Лактат и лактатдегидрогеназа могут служить показателем гипоксии и переключения с окислительного фосфорилирования на гликолиз при преэклампсии.

4. Комплексная оценка этих показателей позволяет более полно охарактеризовать два основных механизма, участвующих в развитии преэклампсии, — гипоксию и воспаление.

Источник финансирования. ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины».

Авторы заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Source of funding. Federal State Budgetary Budgetary Institution “Federal Research Center for Fundamental and Translational Medicine”.