Шизофрения — мультифакторное психическое заболевание, причиной которого является сложное взаимодействие наследственных компонентов, возможных перинатальных осложнений и воздействие более поздних факторов риска окружающей среды, например, таких, как осложненные роды или черепно-мозговые травмы (ЧМТ) в анамнезе [1—3].
У больных шизофренией, по данным ряда исследователей, чаще, чем в общей популяции, наблюдаются нарушения обмена фолатов [4—6], что приводит к увеличению уровня общего гомоцистеина в крови. Показано также, что повышение уровня гомоцистеина связано с риском развития шизофрении [4, 7]. Метлентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) — ключевой фермент метаболизма фолата в процессе одноуглеродного обмена. Снижение ферментативной активности MTHFR приводит к нарушению метилирования и может вызывать дефицит фолата и избыточное накопление гомоцистеина — промежуточного продукта синтеза метионина [4].
Ген, кодирующий MTHFR, находится на хромосоме 1р36.22. Полиморфизм C677T гена MTHFR связан с заменой нуклеотида цитозина (С) на тимин (Т), что приводит к замене аминокислотного остатка аланина на валин (Ala222Val) в участке молекулы фермента, ответственного за связывание фолиевой кислоты. Накопление в крови гомоцистеина и снижение активности фермента наблюдается у носителей генотипа ТТ полиморфного маркера C677T MTHFR [8]. Для ряда этнических групп показано, что данный генотип значительно чаще встречается у больных шизофренией [4, 9, 10]. Однако ассоциация обнаружена не во всех исследованиях [11—13]. Также делаются попытки связать полиморфизм с клиническими особенностями шизофрении [6]. До сих пор не проводили исследования влияния взаимодействия генетических вариантов в локусе C677T и средовых факторов, связанных с риском шизофрении, на выраженность симптомов заболевания.
Цель исследования — поиск ассоциации полиморфизма C677T MTHFR с риском развития шизофрении, установление связи этого полиморфизма с выраженностью симптомов шизофрении и оценка влияния на эти симптомы генетических вариантов и средовых факторов (осложнения при родах и наличие ЧМТ в анамнезе).
Материал и методы
Общая выборка больных включала в себя 1397 больных шизофренией и расстройствами шизофренического спектра (рубрики F20—F25 по МКБ-10), 533 мужчины и 864 женщины, средний возраст которых был 36,9±13,9 года.
Группу контроля составили 711 психически здоровых человек без наследственной отягощенности психическими заболеваниями, 393 мужчины и 318 женщин, средний возраст 29,7±12,9 года.
Более 95% в каждой группе являлись этническими русскими. Все обследованные давали информированное согласие на сбор биологического материала, сбор анамнеза, тестирование и проведение молекулярно-генетического исследования.
Выраженность симптомов у больных определяли с помощью шкалы PANSS (The Positive and Negative Syndrome Scale), позволяющей оценивать позитивные и негативные синдромы шизофрении. Психометрическое обследование провели у 1268 человек. Затем на основе анализа историй болезни были отобраны больные, для которых имелись данные о наличии или отсутствии в анамнезе ЧМТ, а также данные о наличии или отсутствии родовых осложнений. К родовым осложнениям относили родовые травмы, асфиксию, кесарево сечение и низкую массу тела (менее 2000 г) при рождении. В результате были сформированы две группы. Одна группа включала 121 человека с родовыми осложнениями и 350 без родовых осложнений. Во вторую группу вошли 80 человек с ЧМТ и 391 без ЧМТ. Для выявления генотип-средовых взаимодействий оценку влияния генотипа MTHFR (C677T) на выраженность симптомов шизофрении проводили отдельно в каждой группе.
ДНК выделяли из венозной крови стандартным методом фенол/хлороформной экстракции. Генотипирование локуса MTHFR (C677T) проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Для ПЦР использовали праймеры: прямой 5’ — TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’ и обратный 5’ — CCTCACCTGGATGGGAAAGATCC-3’. Реакцию проводили в 15 мкл в присутствии 2,5мM MgCl2, 2M Betain, 200мкМ смеси dNTP, 0,75ед Taq полимеразы (Сиб Энзим, Россия) и 10 пмол каждого праймера. Использовали следующий протокол ПЦР: 94 °С — 2 мин, 30 циклов (94 °С — 20 с; 60 °С — 20 с; 72 °С — 20 с), 72 °С — 3 мин. ПЦР-продукт обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HinfI. Для определения генотипов полиморфного сайта полученные фрагменты разделяли в 8% полиакриламидном геле. Размер ПЦР продукта составлял 146 п.о. После проведения рестрикции аллелю С соответствовало наличие фрагмента 146 п.о. и аллелю Т — наличие фрагментов 124 и 22 п.о.
При анализе данных отклонение частоты генотипов от равновесия Харди—Вайнберга оценивали с помощью критерия χ2. Для поиска статистических различий в распределении генотипов и аллелей полиморфного локуса в изучаемых подгруппах использовали критерий χ2 Пирсона. Различия между генотипами устанавливали, используя точный критерий Фишера. Так как шкала PANSS предусматривает балльную оценку симптомов, для изучения влияния генотипа на выраженность симптомов использовали непараметрический критерий Краскела—Уоллиса. Учитывая множественность сравнений в анализе, различия считали значимыми при уровне вероятности <0,01.
Результаты и обсуждение
Молекулярно-генетическое исследование общей выборки больных (1357 человек) показало следующее распределение генотипов MTHFR (C677T): CC — 703 (50%), TC — 566 (41%), ТТ — 128 (9%). Распределение генотипов в группе здорового контроля было: CC — 322 (45%), TC — 314 (44%), ТТ — 175 (11%). Частота минорного аллеля Т в контрольной группе (33%) и группе больных шизофренией (29%), по данным проекта, «1000 геномов» [14] очень близка к значению частоты Т-аллеля в европейских популяциях (36%). Распределение частот генотипов в обеих выборках соответствовало равновесию Харди—Вайнберга (в группе больных χ2=0,83, р=0,37; в группе контроля χ2=0,01, р=0,93). Частоты аллелей и генотипов у мужчин и женщин значимо не отличались между собой как в контрольной группе, так и в группе больных шизофренией. Достоверных отличий распределения генотипов в выборках больных и контроля не обнаружено.
Анализ влияния генотипа MTHFR (C677T) на балльную оценку позитивных, негативных и общих психопатологических симптомов шизофрении не выявил значимых эффектов. При сравнении выраженности симптомов в зависимости от генотипа отдельно у мужчин и женщин не обнаружено значимых различий. В табл. 1 приведены средние балльные значения симптомов у носителей разных генотипов в зависимости от пола.
Оценивая влияние осложнений при родах и ЧМТ на уровень симптомов, мы не обнаружили значимых эффектов ни для позитивной, ни для негативной, ни для общей психопатологической симптоматики. Затем было изучено влияние генотипа на выраженность симптомов в группах с родовыми осложнениями и без них. Ни в одной из групп не было обнаружено ассоциации между полиморфизмом MTHFR (C677T) и симптомами шизофрении. Значимых отличий в уровне симптомов между группами также отмечено не было (табл. 2).
Для того чтобы выявить влияние эффекта взаимодействия генотипа и средового фактора ЧМТ на уровень симптомов, мы сравнили средние балльные значения симптомов у носителей различных генотипов в группах с ЧМТ и без нее (табл. 3). Проведенный анализ не обнаружил значимых отличий выраженности симптомов шизофрении в зависимости от наличия ЧМТ.
В настоящей работе мы исследовали влияние C677T полиморфизма MTHFR, одного из факторов риска шизофрении, а также средовых факторов (осложнения при родах и ЧМТ), связанных с риском этого заболевания, на тяжесть шизофрении.
За последнее время проведено много исследований, касающихся изучения ассоциации полиморфизма С677Т MTHFR с шизофренией в разных этнических группах [15, 16]. Однако результаты этих исследований противоречивы. В нашей работе, проведенной на большой выборке (1357 человек), мы не подтвердили ассоциацию минорного Т-аллеля с риском развития шизофрении. Действительно, в ряде исследований выявлена значительная связь между аллелем Т локуса С677Т MTHFR и шизофренией [4, 7], однако результаты других исследований говорят об отсутствии такой ассоциации. Не были выявлены существенные отличия в частоте аллеля Т между группами здорового контроля и больными шизофренией в болгарской, норвежской и некоторых других популяциях [11—13]. В нашей работе мы впервые изучили ассоциацию аллелей и генотипов полиморфизма С677Т MTHFR на обширной выборке этнических русских. Полученные нами результаты не показали связи между изучаемым полиморфизмом и риском развития шизофрении.
Мы также не обнаружили влияния генотипа С677Т MTHFR на выраженность позитивных, негативных и общих психопатологических симптомов шизофрении. Ранее рядом авторов сообщалось о том, что в некоторых популяционных группах носители генотипа ТТ имеют более выраженную негативную симптоматику по сравнению с носителями других генотипов [17—20]. Подобные исследования были проведены и в русской популяции [6]. Авторы показали, что у носителей аллеля Т выраженность ряда симптомов, оцениваемых по шкале PANSS, в частности, негативных симптомов, была выше, чем у носителей генотипа СС. Однако выборка, на которой исследовали ассоциацию, состояла всего из 38 человек, что вызывает сомнения в достоверности полученных результатов. Результаты, полученные нами на большой выборке, обеспечивающей большую мощность исследования, не подтверждают эти данные.
Учитывая, что выраженность симптомов шизофрении может иметь сложную зависимость не только от генетического фактора, но и от факторов среды, мы изучили взаимное влияние генетического варианта и средовых факторов (родовых осложнений и ЧМТ). Показано, что низкая масса тела при рождении, асфиксия и другие осложнения при родах могут рассматриваться как фактор риска возникновения расстройств шизофренического спектра [21, 22]. Кроме того, показано, что у носителей аллеля Т полиморфного маркера C677T MTHFR беременность часто сопровождается дефицитом фолиевой кислоты, что может приводить к дефектам развития нервной трубки плода [23].
Показано, что после ЧМТ у лиц с генетической предрасположенностью к психозу наблюдается повышенный риск развития шизофрении [24]. Кроме того, генотип ТТ С677T гена MTHFR рассматривается исследователями в качестве предиктора тяжелых патологических последствий, таких как посттравматическая эпилепсия после перенесенной ЧМТ [25]. Оценивая влияние таких факторов, как преждевременные или осложненные роды и наличие ЧМТ в анамнезе, на риск возникновения шизофрении, с одной стороны [24, 26], и связь этих факторов с фолат-гомоцистеиновым статусом, с другой стороны [27, 28], мы включили их в свое исследование. Однако проведенный нами анализ не выявил влияния изучаемых средовых факторов на выраженность симптомов шизофрении. Также мы не обнаружили совместного влияния генетических и средовых факторов (ЧМТ и осложнения при родах) на выраженность симптомов этого заболевания.
В заключение следует отметить, что изучение разных аспектов связи С677T MTHFR с шизофренией указывает на то, что аллель Т не является ни фактором риска заболевания, ни фактором, усугубляющим ее тяжесть в русской популяции.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.