2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат (мексидол) — синтетический препарат с широким спектром действия и показаниями к применению, создание и внедрение которого в клиническую практику является несомненным достижением отечественной фарминдустрии [1]. Это эффективный антиоксидант, антигипоксант, ноотроп, анксиолитик, церебро- и кардиопротектор с антиагрегантными, антиатеросклеротическими, антистрессорными и противосудорожными свойствами [1, 2]. Ингибируя свободнорадикальные процессы, активируя энергосинтетические функции митохондрий и улучшая энергетический обмен в клетке [1, 3], мексидол продемонстрировал свою эффективность в составе комплексной терапии целого ряда заболеваний [4]. Кроме того, как актопротектор препарат используется в различных видах спортивной деятельности человека для повышения работоспособности и адаптивных возможностей [5].

Известно, что под действием стрессирующих факторов в первую очередь в процессы изменения функционального состояния организма вовлекаются гормоны — глюкокортикоиды. Они являются универсальными регуляторами метаболизма, переключающими пластические процессы на энергетические. У человека наиболее высокой физиологической активностью обладает кортизол, а у мышей и крыс — кортикостерон [6].

Физическая нагрузка до состояния утомления является стрессирующим фактором [7]. Другим мощным стрессорным воздействием на организм является десинхроноз [8]. Показано, что постоянное освещение повышает уровень кортикостерона в плазме крови крыс [6].

Цель настоящего исследования — оценить влияние мексидола на уровень кортикостерона в сыворотке крови и состояние клеток пучковой зоны коры надпочечников крыс после световой или темновой деприваций и физической нагрузки.

Материал и методы

Экспериментальное исследование выполнено в весеннее время года (март 2017 г.) на 70 половозрелых крысах-самцах породы Wistar массой 220—250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном рационе со свободным доступом к воде и пище. Все процедуры с животными выполнены в соответствии с международными правилами и нормами обращения с лабораторными животными, не противоречившими Женевской конвенции 1985 г. «Международные принципы биомедицинских исследований с использованием животных» [9].

Для индукции экспериментального десинхроноза животные опытных групп в течение 10 сут круглосуточно находились при искусственном ярком освещении 150 Lx либо полном затемнении 2—3 Lx [10].

Моделью физической нагрузки выбрана методика в собственной модификации принудительного плавания крыс до полного утомления [11]. Плавательный тест проводили на всех группах животных параллельно в одно и то же время суток (с 10.00 до 11.00) в течение 5 дней подряд сразу после помещения животных из депривированных условий освещения в естественные.

Мексидол фармацевтической компании «Фармасофт» (Россия, Покров, ООО «Эллара») вводили внутримышечно в дозе 10 мг/кг, исходя из минимальной разовой дозы для человека (100 мг) [4] и коэффициентов пересчета [12]. Для этого заводской 5% раствор мексидола разводили до 1%, чтобы точно дозировать выбранную дозу из расчета 0,1 мл разведенного раствора на 100 г массы животного. После формирования десинхроноза и отмены световой или темновой деприваций препарат вводили с 1-го по 5-й день плавательного теста с нагрузкой за 30 мин до его предъявления. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили 0,9% раствор натрия хлорида в соответствующем объеме.

Экспериментальные животные были разделены на 7 групп по 10 особей:

1. Крысы, находившиеся в естественных условиях освещения и не подвергавшиеся никаким воздействиям, — интактная группа (1-я группа).

2. Крысы, находившиеся в естественных условиях освещения, подвергавшиеся физической нагрузке и получавшие 0,9% раствор натрия хлорида, — контрольная группа (2-я группа).

3. Крысы, находившиеся в естественных условиях освещения, подвергавшиеся физической нагрузке и получавшие мексидол (3-я группа).

4. Крысы, подвергавшиеся физической нагрузке после формирования у них экспериментального десинхроноза в виде круглосуточного освещения на протяжении 10 сут и получавшие 0,9% раствор натрия хлорида (4-я группа).

5. Крысы, подвергавшиеся физической нагрузке после формирования у них экспериментального десинхроноза в виде круглосуточного освещения на протяжении 10 сут и получавшие мексидол (5-я группа).

6. Крысы, подвергавшиеся физической нагрузке после формирования у них экспериментального десинхроноза в виде круглосуточной темноты на протяжении 10 сут и получавшие 0,9% раствор натрия хлорида (6-я группа).

7. Крысы, подвергавшиеся физической нагрузке после формирования у них экспериментального десинхроноза в виде круглосуточной темноты на протяжении 10 сут и получавшие мексидол (7-я группа).

После завершения плавательного теста животных выводили из эксперимента одномоментным декапитированием под CO₂ наркозом согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным и приказу Минздрава СССР №577 от 12.08.77 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» [9]. У декапитированных животных собирали кровь для получения сыворотки.

Определение уровня гормона в сыворотке периферической крови выполняли с помощью иммуноферментного метода. Измерения проводили на программируемом фотометре для микрострипов STARFAX 303 PLUS (США). При иммуноферментном анализе использовали поликлональные антитела кортикостерона согласно рекомендациям производителя. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм.

Гистологический анализ проводили по стандартной методике [13]. У животных после выведения извлекали левый надпочечник и фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в растворах этанола возрастающей крепости (70, 95, 98%), просветляли в бутаноле и заключали в парафин («LabPoint», Россия). Срезы толщиной 5—7 мкм изготавливали на ротационном микротоме RMD-3000 («MTPoint», Россия), окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Все процедуры проводили по стандартным методикам [13]. Микроскопию препаратов, изготовление снимков и измерения осуществляли с использованием системы из микроскопа AxioLab A1, камеры AxioCamERc 5s и программного обеспечения ZEN 2012 («Carl Zeiss Microscopy», Германия). На серийных микрофотоснимках измеряли максимальный (A) и минимальный (B) диаметры ядер для 30 клеток пучковой зоны коры надпочечника, а затем рассчитывали объем ядра по общепринятой формуле [14].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 8.0 («StatSoft», США). При обработке результатов проверяли группы на нормальность распределения исследуемого признака с помощью критерия Шапиро—Уилка. В зависимости от характера распределения для сравнения независимых выборок использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна—Уитни и для сравнения зависимых рядов данных — критерий Вилкоксона. Для описания вариационных рядов рассчитывали медиану (Me) и квартили (Q1 — 25%; Q3 — 75%). При проверке статистических гипотез принимали уровень статистической значимости <5% (p<0,05).

Результаты и обсуждение

В настоящее время исследования указывают на существование суточной и сезонной динамики содержания глюкокортикоидов в крови животных и людей [6, 15]. Ранее в наших работах при изучении сезонной динамики содержания кортикостерона в сыворотке крови лабораторных крыс был установлен наименьший его уровень в осенне-зимний период, а наибольший — весной [15]. С учетом этого данный эксперимент проводили в стрессчувствительный сезон года, т.е. весной. Как показали наши исследования, уровень кортикостерона в сыворотке крови интактных крыс (1-я группа) в этот сезон составлял 195 (108; 218,3) нг/мл (см. таблицу) и превышал таковой в другие сезоны в 3,5—8 раз [15].

Влияние мексидола на уровень кортикостерона в сыворотке крови и состояние клеток пучковой зоны коры надпочечника у крыс после световых десинхронозов и физической нагрузки до состояния утомления

Примечание. Полученные результаты представлены в виде медианы (Me) и квартилей (Q₁ — 25%; Q₃ — 75%), * — p₀<0,05 — уровень статистической значимости по отношению к интактной 0-й группе, ** — p₁<0,05 — уровень статистической значимости по отношению к 1-й контрольной группе.

У крыс контрольной 1-й группы, получавшей 0,9% раствор натрия хлорида за 30 мин до плавательной нагрузки ежедневно в течение 5 дней, уровень кортикостерона повышался по сравнению с аналогичным показателем интактных животных (1-я группа), но недостоверно. При этом объем ядер клеток пучковой зоны коры надпочечников увеличивался статистически значимо, что в совокупности указывает на активацию кортикостероидогенеза [16] и формирование, очевидно, стрессорной реакции у животных в фазе тревоги [7, 14], сохраняющейся на следующие сутки после отмены нагрузок в виде принудительного плавания и инъекций 0,9% раствора натрия хлорида.

Мексидол в этих условиях, не изменяя уровень кортикостерона в сыворотке крови в сравнении с показателем интактных и контрольных животных, снижал интенсивность увеличения объема ядер кортикоцитов по отношению к аналогичному показателю группы, получавшей 0,9% раствор натрия хлорида (показатель больше, чем в 1-й группе, но меньше, чем в 2-й группе, p₀ и p₁<0,05) (см. таблицу), что, очевидно, свидетельствует в пользу противострессорного действия препарата, о чем неоднократно указывалось в других исследованиях с использованием других моделей стресса и способов его оценок [1, 17].

Десинхроноз, развившийся у животных после 10-суточной темновой депривации [10] в сочетании с ежедневным плавательным тестом и инъекцией 0,9% раствора натрия хлорида, вызывал значительное повышение уровня кортикостерона в сыворотке крови по сравнению с аналогичным показателем как интактных (1-я группа), так и контрольных (2-я группа) крыс. При этом объем ядер кортикоцитов пучковой зоны надпочечников не отличался от такового у интактных животных (1-я группа), но существенно уменьшался в сравнении с тем же показателем контрольной группы (2-я группа), что в целом может указывать на развитие стрессорной реакции в фазе субкомпенсации [14], предшествующей фазе истощения. Мексидол в этих условиях показал себя как препарат, ослабляющий стрессорное истощение. Хотя под его влиянием объем ядер клеток пучковой зоны надпочечников уменьшался аналогично таковому сравниваемой группы (5-я группа), уровень гормона поднимался менее значительно, чем в сравниваемой группе, и его подъем становился статистически незначимым по отношению к аналогичному показателю интактных (1-я группа) и контрольных (2-я группа) животных (см. таблицу). Согласно исследованиям [14], такая ситуация соответствует фазе баланса, в которой еще сохраняется удовлетворительная адаптация к стрессу. Она предшествует фазе субкомпенсации, переходящей в фазу истощения. Таким образом, под влиянием мексидола у животных, подвергнутых сочетанному стрессу (десинхроноз в виде круглосуточного освещения + болевой стресс в виде инъекции + плавательный тест до состояния утомления), происходила отсрочка фазы истощения.

Еще более обнадеживающие результаты в отношении противострессорного действия мексидола получены в последней серии экспериментов со световой депривацией. Сочетание десинхроноза в виде круглосуточной темноты, плавательного теста, предъявляемого ежедневно на протяжении 5 дней, и введения инъекций 0,9% раствора натрия хлорида сопровождалось менее значительным подъемом кортикостерона в сыворотке крови крыс, чем аналогичное сочетание раздражителей после темновой депривации, поскольку этот показатель достоверно отличался от такового только интактной, но не контрольной группы (2-я группа). Кроме того, объем ядер адренокортикоцитов под воздействием этих трех стрессирующих нагрузок увеличивался достоверно по отношению к интактной (1-я группа), но уменьшался по отношению к контрольной (2-я группа) группе. Следовательно, животные в этой ситуации также находились в стрессовом состоянии в фазе тревоги, но она была качественно другая, чем та, которая переживалась животными контрольной 2-й группы, получавшими ту же плавательную нагрузку и инъекции 0,9% раствора натрия хлорида в условиях естественного освещения, и тем более животными 4-й группы. Следует подчеркнуть, что наблюдаемые нами неоднозначные стрессовые реакции крыс при разных типах световых десинхронозов связаны, очевидно, с противоположным направлением фазового сдвига. В весенний период в случае расширения световой фазы до максимума направление фазового сдвига совпадало с генетически детерминированной программой роста продолжительности светового дня, в то время как при расширении темновой фазы до максимума направление фазового сдвига становилось в противофазе с эндогенной генетической программой. О разнокачественности световых десинхронозов при разнонаправленных фазовых сдвигах свидетельствуют работы других авторов [6]. Обращает на себя внимание тот факт, что в нашем исследовании сочетаются 3 стрессирующих фактора, последовательно воздействующих на животных, поэтому, возможно, мы наблюдали не совсем классические фазы стресса по Г. Селье, а скорее переходные состояния между фазами, о наличии которых указывают также работы других исследователей [14, 16].

Оценивая эффект мексидола в обсуждаемых условиях, можно с еще большей уверенностью констатировать наличие у него противострессорной активности. Препарат предупреждал как подъем уровня содержания сывороточного кортикостерона, так и увеличение объема ядер эндокриноцитов надпочечников, причем настолько, что указанные показатели достоверно отличались от аналогичных у интактных животных, но не достигали уровня таковых в контрольной группе.

Установлено [18], что такими свойствами обладают многие адаптогены растительного и животного происхождения. Кроме того, эталонный актопротектор этилтиобензимидазол гидробромид (метапрот, бемитил) также обладает некоторыми адаптогенными эффектами. Например, уменьшает инволюцию тимуса, селезенки, но при этом не предупреждает гипертрофию надпочечников и эрозивно-язвенные поражения желудка [18].

Таким образом, мексидол в условиях сочетанных последовательно предъявляемых стрессорных нагрузок продемонстрировал противострессорные свойства не только на уровне содержания гормона кортикостерона в сыворотке крови крыс, но и на состоянии адренокортикоцитов пучковой зоны надпочечников. Выраженность этого воздействия препарата зависела от фазы стресса и характера депривации. При естественных условиях освещения и после световой депривации, когда животные находились в фазе стресса, близкой к тревоге, препарат срабатывал выраженнее, чем после темновой депривации в условиях развивающегося истощения. Тем не менее даже в последнем случае он показал себя как средство, предупреждающее истощение у животных и срыв адаптации.

Полученные нами данные в совокупности с известными сведениями об антигипоксических, антиоксидантных и анксиолитических свойствах препарата [3] в полной мере объясняют актопротекторные его эффекты, продемонстрированные нами в этом же эксперименте параллельно и опубликованные ранее [19], а также другими авторами [1]. Нами было показано, что мексидол повышал работоспособность крыс в плавательном тесте как в естественных условиях освещения, так и при обсуждаемых выше световых десинхронозах, способствуя формированию перекрестной адаптации к физической нагрузке в естественных условиях освещения и пролонгируя это состояние в условиях десинхронозов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.