Представления о старении как неуклонно прогрессирующем воспалительно-дегенеративном процессе были сформированы в начале 2000-х гг., однако способы его коррекции остаются недостаточно разработанными и неэффективными. Системное воспаление в пожилом и старческом возрасте слабо или умеренно выражено, развивается в отсутствие очевидных триггеров (очаги инфекционной инвазии, повреждение тканей), связано с устойчивой провоспалительной активацией макрофагов, провоцирует развитие возраст-ассоциированных сердечно-сосудистых, эндокринных, костно-мышечных, онкологических заболеваний, когнитивных и психоэмоциональных расстройств [1].

Определяющую роль в развитии воспалительно-дегенеративных изменений при старении играет хроническая избыточная кортизоловая активация, вызванная в свою очередь возрастной гиперактивацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГН) системы [2]. Катаболические/антианаболические эффекты глюкокортикостероидов (ГКС), опосредованные ГКС-рецепторами (ГР, NR3C1; лигандзависимые факторы транскрипции), сводятся к торможению синтеза белка и угнетению пластических процессов (митохондрио- и ангиогенез), активации протеолиза, липолиза и апоптоза, что имеет не только атрофогенные, но и прогипоксические последствия [3, 4]. ГКС-зависимое снижение плотности микрососудистой сети во всех тканях стареющего организма и ГКС-индуцированная вазоконстрикция вызывают устойчивую гипоксическую активацию гипоталамуса, повышенную реактивность ГГН оси и снижение ее чувствительности к отрицательной регуляции ГК [2, 5]. Продолжительная и чрезмерная ГКС/ГР активация вызывает подавление гипоталамо-гипофизарно-гонадной, гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной осей, секреции и сигнальных путей инсулина, что предопределяет развитие асептического воспаления, поскольку половые, тиреоидные гормоны и инсулин являются не только ключевыми регуляторами пластических процессов, индуцируют ангиогенез и биогенез митохондрий, но и контролируют противовоспалительную поляризацию иммуноцитов [6—10].

Иммуносупрессивные эффекты ГКС, обусловившие их широкое применение в коррекции воспаления, аутоиммунных и гематоонкологических заболеваний, не являются генно-опосредованными, основаны на ДНК-независимом белок-белковом взаимодействии ГР с провоспалительными факторами транскрипции, такими как NF-kB, AP1, STAT1 (непрямая трансрепрессия) [11]. Обусловленное транскрипционной активностью ГР сопряженное подавление анаболических/пластических программ препятствует полноценной противовоспалительной поляризации макрофагов, формируя дистрофический фенотип с ослабленным митохондриальным окислением и сниженной секрецией противовоспалительных и ростовых факторов, несостоятельный в реализации разрешения воспаления [12]. Более того, в условиях продолжительной избыточной ГКС-стимуляции снижается плотность микрососудистой сети во всех органах и тканях, что усугубляет роль гипоксии как триггера провоспалительной поляризации макрофагов и асептического воспаления [4, 13]. Таким образом, система противодействия атрофогенным и прогипоксическим генно-опосредованным эффектам ГКС должна совмещать свойства активатора противогипоксических механизмов (ангиогенный, митохондриогенный стимул), микрососудистой вазодилатации, противовоспалительной поляризации макрофагов, анаболических сигнальных путей.

Открытие в 2004 г. сукцинатного рецептора SUCNR1/GPR91 позволило объяснить плейотропные противогипоксические эффекты янтарной кислоты (сукцинат), связанные не только с поддержанием митохондриального окисления и гликолиза в условиях гипоксии, но и с SUCNR1-опосредованной индукцией ангиогенеза, эритропоэза, микрососудистой вазодилатации [14, 15]. В 2021 г. была продемонстрирована сукцинат/SUCNR1-зависимая индукция противовоспалительной гиперполяризации макрофагов, а миелоспецифическое выключение SUCNR1 оказалось связано с усилением воспаления [16, 17]. Сукцинат/SUCNR1-сигнализация индуцирует синтез белка, биогенез митохондрий, рост аксонов [18, 19]. Ранее нами было показано, что системная стимуляция сукцинатной сигнализации у старых крыс вызывала обращение фенотипа стареющей дистрофически измененной микроглии в префронтальной коре и поле CA1 гиппокампа в разветвленный (гомеостатический) фенотип, определяемый у молодых и взрослых животных, что было ассоциировано с увеличением уровня экспрессии противовоспалительных цитокинов, маркеров митохондрио-, ангио-, синаптогенеза [20—22]. В условиях хронического иммобилизационного стресса стимуляция сукцинат/SUCNR1-сигнализации ограничивала развитие стресс-индуцированного нейровоспаления в коре головного мозга (КГМ) старых крыс [23].

Существует необходимость разработки мер коррекции метаболических и функциональных ГКС-индуцированных нарушений в стареющем организме с ослабленными механизмами антикортизоловой защиты.

Цель исследования — оценка модулирующего влияния сукцинат/SUCNR1-сигнализации на негеномные иммуносупрессивные и генно-опосредованные воспалительно-дегенеративные эффекты активации ГР в КГМ старых крыс.

Материал и методы

Исследование было выполнено на самцах беспородных белых крыс в возрасте 18 мес (n=96), выращенных в стандартных условиях вивария ФГБНУ «НИИОПП» при естественной смене суточной освещенности, свободном доступе к пище и воде. Эксперименты проводили в соответствии с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Протокол эксперимента был одобрен локальным Этическим комитетом ФГБНУ НИИОПП.

Синтетический ГКС дексаметазон (ОАО НПК «ЭСКОМ», Россия), высокоспецифичный агонист ГР, вводили животным с целью провокации и потенцирования возраст-ассоциированных ГКС-индуцированных изменений [24]. Дексаметазон вводили в дозе 1 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б), ежедневно, в течение 10 дней [24]. В качестве лекарственной формы сукцината, преодолевающей гематоэнцефалический барьер, был использован препарат Мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (ЭМГП) сукцинат; 50 мг/мл, ООО «НПК «ФАРМАСОФТ», Россия). Мексидол вводили в дозе 100 мг/кг, в/б, через 1 ч после инъекции дексаметазона, ежедневно, в течение 10 дней.

С целью оценить влияние ЭМГП на анализируемые показатели был использован препарат Эмоксипин (ЭМГП гидрохлорид; 10 мг/мл; ООО «Московский эндокринный завод», Россия), через 1 ч после инъекции дексаметазона, в/б в дозе 68 мг/кг (содержит ЭМГП в количестве (54 мг/кг), эквивалентном его содержанию в примененной дозе Мексидола), ежедневно в течение 10 дней.

Были выполнены три серии эксперимента: 1-я — 10-дневное введение дексаметазона; 2-я — 10-дневное комбинированное введение дексаметазона с Мексидолом; 3-я — 10-дневное комбинированное введение дексаметазона с Эмоксипином. В каждой серии в соответствии с этапами выведения животных из эксперимента (через 1 сут после 1, 3, 7, 10-го дня курса) были сформированы четыре опытные (по 5 животных в каждой) и четыре контрольные (по 3 животных в каждой) группы. Контрольным животным вводился физиологический раствор в объемах, соответствующих вводимым препаратам. Крыс декапитировали под эфирным наркозом. Мозг извлекали, отделяли на льду КГМ. Образцы быстро замораживали и хранили в жидком азоте.

Замороженные образцы КГМ растирали в жидком азоте до порошкообразного состояния. Навески массой 100 мг лизировали на льду в течение 30 мин в охлажденном до 2 °C лизис-буфере в соотношении 1V ткань: 6V буфер [25]. После центрифугирования (30 мин, 14 000 g, 4 °C) супернатант смешивали с загрузочным буфером (4x Laemmli Sample Buffer), инкубировали 5 мин при 95 °C и хранили при –80 °C. Концентрацию общего белка в пробах определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Белки лизата КГМ разделяли в 10% полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроэлюцией. Мембрану инкубировали с первичными моноклональными антителами (разведение 1:500; 14 ч; 4 °C; «Santa Cruz Biotechnology», США) против цитокинов: IL-1β (Interleukin 1β, sc-515598), TNF-α (Tumor Necrosis Factor α, sc-52746), IL-10 (interleukin 10; sc-57245), TGF-β1 (Transforming Growth Factor β1, sc-130348); маркеров биогенеза митохондрий: PGC-1α (Peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α, sc-518025), NDUFV2 (NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Subunit V2, sc-515589), SDHA (Succinate Dehydrogenase Complex Subunit A, sc-166909), cyt c1 (Cytochrome c1, sc-514435), COX2 (Cytochrome с oxidase subunit II, sc-514489), ATP5A (ATP synthase mitochondrial F1 complex subunit alpha, sc-136178); маркера ангиогенеза VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor, sc-365578), нейротрофина BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor, sc-65514), GR (Glucocorticoid Receptor, sc-393232); с первичными поликлональными антителами (разведение 1:2000; 14 ч; 4 °C; «Abcam», Великобритания) против SUCNR1 (Succinate Receptor, ab140795); вторичными антителами (разведение 1:5000; 1 ч; 4 °C), коньюгированными с пероксидазой хрена (Anti-mouse sc-516102; Anti-rabbit ab6721). В качестве контроля использовали антитела к актину (sc-376421). Детектирование белков осуществляли в реакции с ECL-реагентами («Pierce Biotechnology, Inc.», США) на пленку фирмы «Kodak» с последующей денситометрией в программе Adobe Photoshop 7.0 («Adobe Systems», США). О содержании искомых белков судили по плотности окрашивания полосы связывания антител с белком. Результат выражали в относительных денситометрических единицах (ОДЕ).

Статистический анализ проведен с использованием непараметрического рангового U-критерия Манна—Уитни. Различия между сравниваемыми группами считали статистически достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Влияние изолированного введения дексаметазона и в комбинации с Мексидолом на уровень экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в КГМ старых крыс. Ранее нами было показано, что в КГМ белых беспородных крыс-самцов возрастзависимо (от 3 до 18 мес) увеличивается содержание провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β), а противовоспалительных (TGF-β1) — снижается, что связано с формированием воспалительно-дистрофического фенотипа стареющей микроглии и предопределяет развитие в мозге старых крыс хронического вялотекущего асептического воспаления [21].

Введение старым крысам высокоспецифичного агониста ГР дексаметазона в дозе 1 мг/кг ежедневно в течение 10 дней вызывало снижение содержания как провоспалительных (TNF-α, IL-1β), так и противовоспалительных (IL-10, TGF-β1) цитокинов в КГМ крыс через 1 сут после 1-й инъекции на 10—20%, 40—50% после 3-й и 7-й инъекций, на 70% — после 10-й инъекции, в сравнении с контролем (рис. 1). Динамика репрессии про- и противовоспалительных цитокинов была однотипной, что редко освещается в литературе, но является принципиально значимым для понимания роли ГКС/ГР-сигнализации в развитии эффективной иммуносупрессии, но не разрешения воспаления. Хорошо известно, что ГР по механизму непрямой трансрепрессии подавляют активность провоспалительных факторов транскрипции (NFkB, AP1, STAT1) [11]. Более того, ГР, гетеродимеризуясь со структурно близкими ядерными рецепторами/факторами транскрипции противовоспалительного действия (Peroxisome Proliferator Activated Receptor, PPAR; Estrogen Related Receptor, ERR; Androgen Receptor, AR; Progesterone Receptor, PR; Estrogen Receptor, ER), блокируют их активность и, таким образом, экспрессию противовоспалительных цитокинов [7]. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, показавших при системном введении гидрокортизона подавление экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в печени крыс [26]. Важно отметить, что ГКС/ГР-регуляция блокирует синтез белка на уровне инициации трансляции, что влечет за собой снижение экспрессии широкого спектра белков с регуляторной, сигнальной, ферментативной активностью и опосредует быстрые иммуносупрессивные эффекты супрафизиологических доз ГКС [27].

Рис 1. Динамика экспрессии провоспалительных (TNF-α, IL-1β) и противовоспалительных (IL-10, TGF-β1) цитокинов в КГМ 18-месячных крыс при изолированном введении дексаметазона (1 мг/кг, в/б, ежедневно, 10 дней) и в комбинации с Мексидолом (100 мг/кг, в/б, ежедневно, 10 дней; через 1 ч после введения дексаметазона).

Здесь и на рис. 2 и 3: ОДЕ — относительные денситометрические единицы. * — отличия статистически значимы по сравнению с контролем (К) (p<0,01). Δ — отличия статистически значимы по сравнению с группой крыс, получивших дексаметазон (Д, p<0,01), в соответствующем временном периоде. 1, 3, 7, 10 — дни курсового изолированного введения Д и в комбинации с Мексидолом (Д+М).

Введение Мексидола через 1 ч после введения дексаметазона сопровождалось слабым увеличением уровня экспрессии определяемых цитокинов, которое достигало достоверных значений для IL-10 и TGF-β1 (см. рис. 1). Ранее нами было показано, что курсовое введение Мексидола старым крысам сопровождается увеличением экспрессии противовоспалительных цитокинов, формированием высокоразветвленного гомеостатического фенотипа микроглии, характерного для молодых и взрослых особей крыс, что было сопряжено с активацией митохондрио- и ангиогенеза [20—22]. Индукция биогенеза митохондрий является критически значимым механизмом формирования противовоспалительного фенотипа микроглии/макрофагов [16].

Влияние изолированного введения дексаметазона и в комбинации с Мексидолом на уровень экспрессии белков-маркеров митохондриогенеза в КГМ старых крыс. Введение дексаметазона старым крысам вызывало снижение уровня экспрессии всех определяемых белков-маркеров митохондриогенеза: каталитических субъединиц дыхательных ферментов митохондрий (NDUFV2 комплекса I дыхательной цепи, SDHA комплекса II, цитохром (cyt) c1 комплекса III, COX2 комплекса IV), АТФ-синтазы (ATP5A комплекса V) и транскрипционного коактиватора PGC-1α, определяющего активность ключевых факторов транскрипции (Nuclear Respiratory Factor, NRF1/2, ERRα, PPARγ), вовлеченных в митохондриогенез (рис. 2). Наиболее раннее снижение содержания (через 1 сут после первой инъекции дексаметазона) выявляли для PGC-1α (см. рис. 2). ГКС/ГР подавляют экспрессию гена PGC-1α, что позволяет рассматривать этот регулятор биогенеза митохондрий как наиболее чувствительную и значимую мишень ГКС-опосредованной супрессии митохондриальной функции как при хроническом стрессе и старении, так и при терапии ГКС [3].

Рис. 2. Динамика экспрессии каталитических субъединиц дыхательных ферментов (NDUFV2, SDHA, cyt c1, COX2) и АТФ-синтазы (ATP5A), транскрипционного коактиватора PGC-1α в коре головного мозга старых (18-месячных) крыс при изолированном введении дексаметазона (1 мг/кг, в/б, ежедневно, 10 дней) и в комбинации с мексидолом (100 мг/кг, в/б, ежедневно, 10 дней; через 1 ч после введения дексаметазона).

После 3-й инъекции дексаметазона снижение содержания для NDUFV2, COX2, ATP5A, PGC1α варьировало от 20 до 30% и достигало 40—60% после 10-й инъекции (см. рис. 2). Наиболее значительная супрессия отмечалась для SDHA и cyt c1 (на 50—60% после 3-й инъекции и на 70—80% в конце курса), что свидетельствует о глубоких нарушениях в работе митохондрий (митохондриальная дисфункция) и механизмах энергопродукции, поскольку именно сукцинатдегидрогеназа, проявляя фумаратредуктазную активность в условиях гипоксии, стресса, воспаления, генерирует янтарную кислоту и поддерживает механизмы энергопродукции в экстремальных условиях [14]. Выявленный эффект можно рассматривать как подавление ГКС/ГР-сигнализацией митохондриальной продукции сукцината и сукцинат/SUCNR1-сигнализации, что обосновывает необходимость введения сукцината и усиления сукцинатной сигнализации как при старении, так и при терапии ГКС.

Введение Мексидола после каждой инъекции дексаметазона значимо увеличивало уровень экспрессии всех тестируемых белков-маркеров митохондриогенеза, а в случае NDUFV2, COX2, ATP5A, PGC-1α нормализовало экспрессию на протяжении 7 дней эксперимента. Содержание SDHA и cyt c1 увеличивалось в 1,6 и 2,5 раза после 3-го и 7-го комбинированного введения соответственно в сравнении с группой крыс, инъецированных дексаметазоном (см. рис. 2). Стимулирующее влияние сукцинат/SUCNR1-сигнализации на биогенез митохондрий и экспрессию PGC-1α ранее было показано у интактных крыс [18, 20], но в представленной работе впервые продемонстрирована положительная сукцинат/SUCNR1-зависимая регуляция биогенеза митохондрий в условиях дексаметазон-индуцированной супрессии PGC-1α и каталитических субъединиц дыхательных ферментов. Таким образом, Мексидол не влиял на иммуносупрессивную активность дексаметазона, но минимизировал один из наиболее опасных эффектов супрафизиологических доз ГКС — супрессию митохондриогенеза и митохондриальную дисфункцию.

Влияние изолированного введения дексаметазона и в комбинации с Мексидолом на уровень экспрессии ГР, SUCNR1, VEGF, BDNF в КГМ старых крыс. Повышенный уровень циркулирующих ГКС, характерный для старения, сопровождается подавлением экспрессии ГР, развитием резистентности к ГКС и гиперактивацией ГГН-оси [2]. В представленном исследовании введение дексаметазона в супрафизиологической дозе ожидаемо снизило уровень экспрессии ГР в КГМ старых крыс на 20% после 1-й инъекции и на 40—50% в последующие дни курса, в сравнении с контролем (рис. 3). Механизм подавления экспрессии ГР реализуется при связывании ГР-негативных ГКС-отвечающих элементов в промоторе собственного гена (отрицательная ауторегуляция) [6].

Рис. 3. Динамика экспрессии глюкокортикоидного рецептора GR, сукцинатного рецептора SUCNR1, фактора роста эндотелия сосудов VEGF, нейротрофина BDNF в коре головного мозга старых (18-месячных) крыс при изолированном введении дексаметазона (1 мг/кг, в/б, ежедневно, 10 дней) и в комбинации с мексидолом (100 мг/кг, в/б, ежедневно, 10 дней; через 1 ч после введения дексаметазона).

Введение Мексидола вызывало увеличение экспрессии ГР в КГМ крыс, инъецированных дексаметазоном, до уровня контроля (см. рис. 3). Полученный эффект увеличения экспрессии ГР можно расценивать как протективный, потенцирующий механизм подавления активности ГГН-оси, и направленный на ограничение ГКС-регуляции. Таким образом, ГКС/ГР- и сукцинат/SUCNR1-сигнальные системы оказывают взаимоподавляющее влияние: ГКС/ГР — через репрессию сукцинатдегидрогеназы и продукции янтарной кислоты, а сукцинат/SUCNR1 — через увеличение чувствительности ГГН-оси к отрицательной регуляции ГКС.

Экспрессия SUCNR1 также умеренно снижалась при введении дексаметазона, не более 20% на протяжении эксперимента (см. рис. 3). Введение Мексидола после каждой инъекции дексаметазона сопровождалось увеличением уровня SUCNR1 до контрольного (см. рис. 3). Сукцинат-индуцированное увеличение экспрессии SUCNR1 было показано в других исследованиях и является свидетельством активации рецептора и увеличения чувствительности клеток к сукцинату [15, 18].

ГКС в супрафизиологических концентрациях стимулируют атрофические процессы в головном мозге, подавляя ключевые регуляторы базовых процессов пластичности и выживаемости нейронов: BDNF (активатор митохонондриогенеза, главный синаптогенный фактор мозга), VEGF (активатор ангиогенеза), PGC-1α (интегратор вне- и внутриклеточных сигналов в индукции митохондрио- и ангиогенеза) [3]. В нашем исследовании введение дексаметазона вызывало снижение уровня экспрессии VEGF и BDNF в сходной динамике: на 20% после 3-й инъекции, на 60 и 70% после 7-й и 10-й инъекций соответственно (см. рис. 3).

Введение Мексидола через 1 ч после каждой инъекции дексаметазона вызывало увеличение уровня экспрессии BDNF и VEGF в 1,5 раза после 7-го и 10-го дней курса, в сравнении с крысами, инъецированными дексаметазоном (см. рис. 3). Сукцинат/SUCNR1-сигнализация активирует кальциевый сигнальный каскад, Ca²⁺/КМ-зависимую протеинкиназу, способствует индукции и активации PGC-1α — координатора активности широкого спектра ядерных рецепторов (PPAR, ERR, AR, ER, PR), оказывающих антиглюкокортикостероидное действие (ингибируют транскрипционную активность ГР), стимулирующих экспрессию генов IL-10, TGF-β, VEGF, BDNF, PGC-1α [7—9, 14, 16, 17]. Более того, сукцинат/SUCNR1-сигнализация стимулирует синтез белка (инициацию трансляции) [18], что может потенцировать в выявленный в настоящем исследовании Мексидол-индуцированный эффект увеличения содержания всех тестированных белков, включая противовоспалительные цитокины, маркеры митохондрио-, ангио-, синаптогенеза и собственно ГР.

Все наблюдаемые для Мексидола эффекты не воспроизводились при курсовом введении Эмоксипина после каждой очередной инъекции дексаметазона, что указывает на ключевую роль сукцинат/SUCNR1-опосредованного механизма наблюдаемых протективных эффектов ЭМГП сукцината (Мексидол).

Заключение

Таким образом, в исследовании впервые показано, что применение ЭМГП сукцината оказывает протективное действие при хроническом введении супрафизиологических доз ГКС в стареющий организм, минимизирует ГКС-индуцированную супрессию митохондрий и ангиостатические эффекты, активирует механизмы разрешения воспаления в условиях терапии ГКС воспалительных состояний в пожилом и старческом возрасте.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.