Нейрогенез — процесс образования новых функционально полноценных нейронов из нейральных стволовых/прогениторных клеток (СПК), включая пролиферацию эндогенных СПК, их миграцию и дифференцировку в зрелые нейроны. В настоящее время считается, что в неповрежденном мозге нейрогенез происходит на протяжении всей жизни в двух различных регионах: субвентрикулярной зоне боковых желудочков и субгранулярной зоне в зубчатой извилине гиппокампа [1].

При ишемическом инсульте, как в эксперименте, так и в клинике, было выявлено усиление нейрогенеза [2, 3], что предполагает новую потенциальную мишень для терапии данной патологии. Процесс нейрогенеза можно разделить на три стадии: 1-я — пролиферация нейральных стволовых клеток, 2-я — миграция нейробластов и незрелых нейронов, 3-я — дифференциация в зрелые нейроны и расширение нейритов, что в итоге приводит к синаптогенезу и стабилизации синапсов [4].

Существует ряд молекул, которые влияют на одну или несколько стадий нейрогенеза, причем они различны в эмбриональном и постнатальном периодах. В регуляции нейрогенеза, вызванного инсультом, в пролиферации нейральных стволовых клеток, важную роль играют фактор роста фибробластов-2, инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), нейротрофический фактор мозга (BDNF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). В то же время стромальный фактор (SDF-1), моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 и матриксные металлопротеиназы-2, -3 и -9 играют важную роль в миграции нейробластов [5].

Мексидол (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат) — оригинальный российский лекарственный препарат, обладающий антигипоксической и антиоксидантной активностью [6]. В многоцентровых рандомизированных плацебоконтролируемых исследованиях он доказал свою эффективность при остром инсульте [7], хронической ишемии головного мозга у взрослых [8] и синдроме дефицита внимания и гиперактивности у детей [9].

В доклинических исследованиях было установлено, что Мексидол оказывает антиоксидантное, антигипоксическое, мембраностабилизирующее действие, подавляет развитие глутаматной эксайтотоксичности [6], однако влияние Мексидола на процессы нейрорегенерации при остром нарушении мозгового кровообращения на данный момент не изучались. Лишь в одной работе была показана способность Мексидола влиять на уровень VEGF и BDNF в коре головного мозга крыс при совместном применении с дексаметазоном [10].

Цель исследования — изучить влияние препарата Мексидол на уровень факторов, регулирующих нейрогенез.

Материал и методы

Исследование выполнено на крысах-самцах Wistar массой 200—250 г и было одобрено биоэтической комиссией (выписка №89 от 08.02.24).

Фокальная церебральная ишемия воспроизводилась под общей анестезией (золетил-ксилазин, 20—40 мг/кг + 5—10 мг/кг в/м) путем эндоваскулярной окклюзии-реперфузии правой средней мозговой артерии (СМА) по методу J. Koizumi (1986) [11]. Для этого после вскрытия кожных покровов по срединной линии шеи выделяли правый сосудисто-нервный пучок и аккуратно отделяли правую сонную артерию от нервного пучка. Затем перевязывали общую сонную артерию (ближе к грудине) и правую наружную сонную артерию. Отступив 3—4 мм от бифуркации, в общей сонной артерии делали пункционное отверстие в которое вставляли окклюдер (MCAO Sutures Rat/200—250 g/6—6 mm/0.33—0.35 mm/0,20 mm/5 cm, RWD, Китай) таким образом, чтобы он, пройдя через бифуркацию, оказался во внутренней сонной артерии. Затем, ориентируясь по метке на окклюдере, его вводили во внутреннюю сонную артерию на глубину 20—23 мм (но не более), далее общую сонную артерию обратимо затягивали для избежания кровопотери, операционная рана смачивалась физиологическим раствором и накрывалась марлевым тампоном. По истечении времени окклюзии окклюдер извлекался, общая сонная артерия перевязывалась, рана промывалась 0,05% раствором хлоргексидина, после чего ушивалась кисетным швом. Длительность окклюзии составила 60 мин. Во время начала реперфузии, то есть через 60 мин после начала окклюзии, вводились тестируемые вещества.

Все животные были разделены на три группы. В каждой группе на каждый эксперимент (оценка площади поражения или уровня маркеров нейрогенеза) и на каждый экспериментальный срок было по 5 животных. Животные 1-й группы (контроль) подвергались ложной операции, через 60 мин после которой им вводили физраствор в объеме 5 мл/кг. Животным 2-й группы выполнялась окклюзия СМА и после начала реперфузии внутривенно вводился физиологический раствор в объеме 5 мл/кг. У животных 3-ей группы моделировалась окклюзия СМА, а с реперфузией внутривенно вводился Мексидол (ООО «НПК «Фармасофт») в дозе 50 мг/кг (раствор в концентрации 10 мг/мл в объем 5 мл/кг).

Для оценки нейропротекторной активности Мексидола через 24 ч после окклюзии-реперфузии выполняли количественную оценку размера некроза с помощью окраски мозга 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом. После окрашивания срезы фотографировали на цифровую камеру в одной плоскости с миллиметровой линейкой. Измерение площади окрашенной и неокрашенной ткани осуществляли при помощи программного обеспечения ImageJ 1.53t [12].

Для оценки влияния Мексидола на факторы, участвующие в нейрогенезе, через 4 ч, 8 ч и 24 ч после реперфузии животных трех групп выводили из эксперимента передозировкой золетила и ксилазина. Животных 1-й группы подвергали эвтаназии через 24 ч. Для исследования забирались образцы пораженного полушария головного мозга. Полученные образцы измельчали и гомогенизировали в буфере Ripa (Sigma Aldrich, США) с добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich, США) с помощью гомогенизатора Поттера (16—20 ударов) в соотношении масса ткани (мг):объем буфера (мл) 1:1, а затем инкубировали в течение 3 ч при 4 °C и постоянном перемешивании. Полученный гомогенат центрифугировали при 22440 g в течение 10 мин при 4 °C (AvantiJXN-3, BeckmanCoulter, США). Супернатант использовали для анализа. Количество белка анализировали методом Брэдфорда [13]. 20 мкг белков подвергали электрофорезу с использованием TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit (Bio-Rad, США) в буферной системе Laemmli (BioRad, США). Перед загрузкой образцы смешивали с буфером Laemmli (Bio-Rad, США), содержащим 2,5% 2-меркаптоэтанола (Bio-Rad, США) в соотношении 1:3, инкубировали 5 мин при температуре 70 °C. Гели прогоняли при 100 В в течение 90 мин. Перенос белков с геля на мембрану осуществлялся полусухим методом с помощью TransBlot Turbo (BioRad, США). Белки на мембране блокировали 1% раствором EveryBlot Blocking Buffer (Bio-Rad, США), содержащим 0,1% Tween в течение 30 мин при комнатной температуре.

С применением следующих первичных антител в разведении 1:500 и инкубацией в течение 2 ч при 37 °C оценивалось относительное количество маркеров нейропластичности: BDNF (DF6387 BDNF Antibody, Affinity, Китай); NGF (фактор роста нервов, DF6061 NGF Antibody, Affinity, Китай); VEGF (F5131 VEGFA Antibody, Affinity, Китай); IGF-1 (F6096 IGF-1 Antibody, 100 мкл, Affinity, Китай); тубулин-3 (PAE711 Hu01, Cloud-clone Corp., Китай).

Визуализацию первичных антител осуществляли с использованием вторичных козлиных антител (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, США) в разведении 1:4000 и инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. Хемилюминесценцию фиксировали с помощью ChemiDocXRS+ (Bio-Rad, США). Интенсивность полученных полос анализировали денситометрически с помощью программного обеспечения ImageLab (Bio-Rad, США).

Молекулярная масса анализируемых белков была подтверждена путем сравнения с маркерами молекулярной массы (Precision plus protein standards Dual Color, Bio-Rad, США). Содержание белков оценивали относительно глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH, AF7021 GAPDH Antibody, Affinity, Китай), разведение 1:2000, вторичные козлиные антитела (Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Invitrogen, США) в разведении 1:4000.

Статистический анализ результатов осуществлялся при помощи программы GraphPad Prism версии 8.1.2. Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение (M±SD). Статистическую значимость различий при сравнении более чем двух групп оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Фишера. Для сравнения двух групп использовали t-критерий Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при значении p<0,05.

Результаты

Летальность во 2-й группе составила 33,3% (p=0,0565), в 3-й группе — 16,7% (p=0,286). Различия между 2-й и 3-й группами были статистически незначимы (p>0,05).

При моделировании окклюзии-реперфузии СМА объем зоны некроза в пораженной гемисфере животных 2-й группы составил 37,75±7,46%. Введение Мексидола у животных 3-й группы приводило к снижению объема зоны некроза до 20,48±2,33% (p=0,0006) (рис. 1).

Рис. 1. Влияние Мексидола на объем зоны некроза в пораженном полушарии головного мозга. Окраска 2,3,5,-трифенилтетразолием хлоридом.

При окклюзии-реперфузии СМА наблюдалось повышение относительного количества NGF в ишемизированном полушарии головного мозга крыс через 4 ч после реперфузии на 175,1% (p<0,001), через 8 ч на 168,5% (p<0,01) по сравнению с контролем, а через 24 ч статистически значимо от него не отличалось (рис. 2). В 3-й группе при окклюзии-реперфузии СМА относительное количество NGF, напротив, увеличивалось через 8 ч на 151,8% (p<0,01) и через 24 ч на 188,4% (p<0,001) по сравнению с контролем, а через 4 ч достоверно от него не отличалось (p>0,05). Стоит отметить, что через 4 ч после введения препарата относительное количество NGF было ниже значений у животных 2-й группы на 59,3% (p<0,01), а через 24 ч превышало его на 72,9% (p<0,05) (см. рис. 2).

Рис. 2. Влияние Мексидола на относительное количество NGF, IGF-1, VEGF в пораженном полушарии головного мозга (M±SD).

Здесь и на рис. 3: * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001 — статистически значимые различия, дисперсионный анализ, post-hoc критерий Фишера.

Моделирование окклюзии-реперфузии СМА приводило к повышению относительного количества IGF-1 в ишемизированном полушарии головного мозга крыс через 4 ч после реперфузии на 149,6% (p<0,05), через 8 ч на 122,4% (p<0,05), через 24 ч на 121,1% (p<0,05) по сравнению с контролем (см. рис. 2). В 3-й группе после введения Мексидола при окклюзии-реперфузии СМА относительное количество IGF-1 также увеличивалось — через 4 ч после реперфузии на 133,5% (p<0,05), через 8 ч на 146,8% (p<0,05), через 24 ч на 249,8% (p<0,001) по сравнению с контролем. При этом через 24 ч после введения препарата относительное количество IGF-1 было выше значений животных 2-й группы на 58,2% (p<0,05).

Моделирование окклюзии-реперфузии СМА приводило к повышению относительного количества VEGF в ишемизированном полушарии головного мозга через 24 ч после реперфузии на 76,5% (p<0,05) по сравнению с контролем (см. рис. 2). В 3-й группе относительное количество VEGF увеличивалось через 4 ч на 87,1% (p<0,05), через 8 ч на 132,7% (p<0,01), через 24 ч на 95,4% (p<0,05) по сравнению с контролем (см. рис. 2). Также через 4 ч и 8 ч после введения препарата относительное количество VEGF было выше значений животных 2-й группы на 269,1% (p<0,001) и 295,2% (p<0,0001) соответственно (см. рис. 2).

Относительное количество BDNF в ишемизированном полушарии головного мозга крыс 2-й группы во все сроки эксперимента достоверно не отличалось от показателей контроля (p>0,05) (рис. 3). В 3-й группе относительное количество BDNF увеличивалось через 4 ч после реперфузии на 239,8% (p<0,05), а через 24 ч на 442,5% (p<0,001) по сравнению с контролем. При этом через 4 ч и 24 ч после введения препарата относительное количество BDNF было выше значений у животных 2-й группы на 402,7% (p<0,05) и 377,1% (p<0,001) соответственно (см. рис. 3).

Рис. 3. Влияние Мексидола на относительное количество BDNF, тубулина-3 в пораженном полушарии головного мозга.

Моделирование окклюзии-реперфузии СМА и введение физиологического раствора не влияло на относительное количество тубулина-3 в ишемизированном полушарии головного мозга крыс во все сроки эксперимента (см. рис. 3). Напротив, в 3-й группе при окклюзии-реперфузии СМА относительное количество тубулина-3 увеличивалось через 4 ч после реперфузии на 359,6% (p<0,001), через 8 ч на 338,9% (p<0,001), через 24 ч на 421,4% (p<0,0001) по сравнению с контролем. При этом через 4 ч, 8 ч и 24 ч после введения препарата относительное количество тубулина-3 было выше значений у животных 2-й группы на 327,4% (p<0,001), 300,1% (p<0,001) и 221,6% (p<0,001) соответственно (см. рис. 3).

Обсуждение

Нарушение мозгового кровотока сопровождается нарушением энергетики клетки, митохондриальной дисфункцией, развитием гиперпродукции свободных радикалов и окислительного стресса [14], нейровоспалением, способствует ионному дисбалансу, глутаматной эксайтотоксичности и перегрузке клеток кальцием [15]. Эти изменения стимулируют различные протеазы, липазы, киназы, фосфатазы, эндонуклеазы, а также биологические процессы, вызывающие гибель клеток [16].

С целью защиты нейронов и терапии нарушения мозгового кровообращения разрабатывались лекарственные препараты, ингибирующие отдельные звенья данного патологического каскада. После открытия способности нейронов к регенерации [1] все больше исследователей пытаются повлиять на данный процесс. В рамках настоящего исследования изучалось влияние препарата Мексидол на основные регуляторные молекулы нейрогенеза, в частности на NGF, IGF-1, BDNF, тубулин-3 и VEGF.

NGF является нейротрофом, который поддерживает выживание и дифференцировку нейронов [17], замедляя дегенерацию нервов и запуская регенерацию. NGF имеет решающее значение для выживания и поддержания нейронов после церебральной гипоксии-ишемии [18]. IGF-1 играет важную роль в росте и развитии мозга. Хотя IGF-1 в основном вырабатывается в печени, мозг также может синтезировать этот пептид, что указывает на роль эндогенного IGF-1 в нейрогенезе [19]. Несколько исследований показали, что применение IGF-1 снижает потерю нейронов и усиливает нейрогенез после церебральной ишемии [20]. При ишемии головного мозга может существовать пять механизмов действия IGF-1: предотвращение внутриклеточной перегрузки кальцием, ингибирование активности nNOS, активация HIF-1α, регуляция Bcl-2 для подавления апоптоза и стимуляция эндотелия [21].

BDNF, член семейства нейротрофических факторов NGF, необходим для пролиферации, дифференциации и выживания определенных нейронов в головном мозге. Во взрослом мозге ишемия увеличивает экспрессию BDNF и его рецептора trkB для усиления нейропротекции и нейрогенеза [22]. Мыши с выключенным геном BDNF характеризовались более крупным очагом инфаркта мозга [23], а блокада эндогенного BDNF снижала выживаемость нейронов после ишемического инсульта [24].

Микротрубочки являются одним из основных компонентов клеточного цитоскелета и состоят из гетеродимеров α- и β-тубулина. Микротрубочки представляют собой высокодинамичные нитевидные структуры, которые играют решающую роль в клеточных процессах, включая везикулярный транспорт, подвижность клеток и митоз. Гетеродимеры α/β-тубулина состоят из комбинаций различных изотипов α- и β-тубулина, из которых у человека в настоящее время существует восемь и семь различных изотипов α- и β-тубулина соответственно. Каждый из изотипов кодируется различным геном и демонстрирует различную экспрессию в тканях и стадиях развития. Экспрессия тубулина-β3 наблюдается на ранних стадиях нейрогенеза плода. Сам тубулин-β3 в первую очередь рассматривается как нейрональный белок, наблюдаемый в нейронах и участвующий в нейрогенезе и росте аксонов [25].

Важным звеном в патогенезе ишемического инсульта является ангиогенез в периинфарктной области. Например, повышение плотности микрососудов коррелирует с более длительным сроком выживания пациентов с ишемическим инсультом. Поэтому усиление ангиогенеза является одной из стратегий, способствующих функциональному восстановлению после ишемического инсульта. Одним из основных факторов, стимулирующих ангиогенез, является VEGF [26].

В настоящем исследовании было установлено, что моделирование окклюзии-реперфузии СМА сопровождается активацией нейротрофических факторов IGF-1, NGF и VEGF. Однократное внутривенное введение Мексидола в дозе 50 мг/кг во время реперфузии повышает уровень нейротрофических факторов IGF-1, NGF, BDNF, VEGF в ишемизированной области головного мозга по сравнению с введением физраствора, что приводит к усилению нейрорегенерации на всех сроках наблюдения (4 ч, 8 ч и 24 ч после реперфузии), маркером которой является тубулин-3.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Мексидол не только оказывает защитное действие на нейроны за счет антиоксидантной, антигипоксантной и мембраностабилизирующей активности, но также может стимулировать нейрорегенерацию, повышая уровень основных регуляторных молекул.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.