Ранее в лаборатории нейроморфологии Научного центра психического здоровья [1] было установлено, что сыворотка крови (СК) нелеченых больных шизофренией, введенная в органотипическую культуру эмбрионального мозга человека, вызывает гипотрофию астроцитов с признаками дистрофических изменений, но не влияет на ультраструктуру нейронов и синаптических контактов между ними. Было высказано предположение [2], что эти изменения могут быть связаны с повышенным уровнем циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), обнаруженным в крови этих пациентов, что указывает на активную выработку у них антител, в том числе аутоантител. Это предположение подтверждается данными литературы [3—6] о наличии у больных шизофренией антител к ряду белков, экспрессируемых астроцитами. Что касается сохранности ультраструктуры нейронов и синапсов, следует иметь в виду, что астроциты — иммунокомпетентные клетки мозга, способные распознавать патогенные молекулы и индуцировать выработку нейропротективных медиаторов (интерлейкин-9 (ИЛ-9), -10, -11 и др.), улучшая выживаемость нейронов в культуре [7, 8].

Атипичные нейролептики способны влиять на гуморальные показатели состояния иммунной системы [9—12]. В аспекте приведенных выше данных представляет интерес влияние СК леченных нейролептиками больных на клеточные элементы в культуре эмбрионального мозга человека. Особое внимание в этом отношении привлекает к себе оланзапин — атипичный антипсихотик, не только эффективный в отношении позитивных и негативных симптомов шизофрении [13], но и способный влиять на уровни ЦИК и интерлейкинов в крови [2].

Цель настоящего исследования — изучение влияния СК больных шизофренией, полученной в процессе их лечения оланзапином, на ультраструктуру астроцитов в органотипической культуре эмбрионального мозга человека.

СК были получены от 20 (8 женщин и 12 мужчин; средний возраст 30,7±6,9 года) психически здоровых и 33 (17 женщин и 16 мужчин, средний возраст 33,24±9,9 года) больных шизофренией.

Диагностику психического заболевания, клиническое обследование больных и получение СК проводили в лаборатории психофармакологии (руководитель — д-р мед. наук. М.А. Морозова) Научного центра психического здоровья. В соответствии с МКБ-10 больные страдали приступообразно-прогредиентной шизофренией (рубрики — F20.02; F20.22). Средняя длительность болезни в группе пациентов составляла 10,7±9,4 года, их возраст к началу заболевания был 22,6±6,9 года.

Критериями включения пациентов в исследование были наличие острого психотического состояния, отсутствие алкогольной, лекарственной или иной зависимости по критериям МКБ-10, отсутствие лечения антипсихотическими препаратами пролонгированного действия (включая оланзапин) перед началом исследования, письменное информированное согласие пациентов на участие в нем. Более подробно критерии включения и исключения пациентов в исследование, а также принципы терапии оланзапином были изложены в ряде предыдущих статей [14, 15].

Больных лечили антипсихотическим препаратом оланзапин (ziprexa «Elli Lilly», США). Кровь для исследования брали до лечения, затем через 8 и 28 нед терапии. Исследовали влияние СК на культуру ткани эмбрионального мозга человека в процессе лечения.

Органотипическая культура эмбрионального мозга человека. Эмбриональный материал получали во время проведения медицинских абортов в гинекологических отделениях родильных домов и клиник Москвы по согласованию с их администрацией и с согласия женщин-доноров. Этические нормы получения и использования эмбрионального человеческого материала были согласованы также с этическим комитетом Научного центра психического здоровья. Критериями отбора женщин являлись возраст 20—35 лет; срок беременности 9—10 нед; отрицательные показатели реакции Вассермана, на ВИЧ и НВs-антиген.

Для культивирования использовали восемь эмбрионов в возрасте 9—10 нед с сохранным головным мозгом. Эмбриональный материал промывали охлажденным сбалансированным солевым раствором Эрла. Последующие манипуляции проводили в стерильных условиях. Под контролем бинокулярной лупы мозг освобождали от оболочек, выделяли продолговатый мозг и делали поперечные срезы толщиной 300—400 мкм. Из полученных срезов вырезали кусочки размером примерно 0,4×1×1 мм и переносили их во флаконы с питательной средой для последующего культивирования. Подробно методика получения органотипических культур эмбрионального мозга человека была описана нами ранее [16].

Через 3 нед культивирования кусочки-эксплантаты от каждого эмбриона распределяли по четырем флаконам, в которые вносили по 1 мл СК: в первый флакон добавляли СК, полученную от психически здорового донора (контрольная культура), во второй — от пациента, страдающего шизофренией, полученную до начала лечения, в третий — от этого же пациента через 8 нед от начала лечения оланзапином, в четвертый — от этого же пациента через 28 нед. Эксплантаты исследовали светооптическим и электронномикроскопическим методом через 7 дней после аппликации СК.

Микроскопические методы. Для световой микроскопии эксплантаты фиксировали в 4% растворе параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4 (ФБ) в течение 24 ч, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Полученные парафиновые срезы толщиной 20 мкм окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля.

Для электронной микроскопии эксплантаты фиксировали в смеси 3% глютаральдегида и 4% параформальдегида на ФБ в течение 24 ч, отмывали ФБ, обрабатывали в 4% растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпоксидную смолу аралдит. Полутонкие (1 мкм) срезы окрашивали толуидиновым синим и использовали для точной ориентировки в процессе получения ультратонких срезов, а также исследований в световом микроскопе. Ультратонкие срезы помещали на медные сетки, предварительно покрытые формваровой пленкой и напыленные углеродом, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе Philips-420.

Морфометрические методы. Для морфометрического анализа ультраструктуры астроцитов были отобраны клетки, в ядрах которых присутствовали ядрышки. Такой подход позволяет провести объективное сравнение площади клеток и их ядер, а также параметров распределения органелл. Для каждой из культур, подвергнутых действию СК здоровых и больных шизофренией на разных стадиях лечения оланзапином, получали микрофотографии 40—50 астроцитов с ядрышками. На негативах микрофотографий, полученных при увеличении 3300, измеряли следующие параметры астроцитов: площадь клетки, ядра и цитоплазмы, число митохондрий и липофусциноподобных включений. Площади измеряли с помощью тестовой сетки для двумерных подсчетов, накладываемой на негативы при конечном увеличении 26 000. Расстояние между точками сетки составляло 2 мкм для клеток и 0,2 мкм для органелл. На основании этих параметров вычисляли объемную фракцию (Vv) митохондрий и липофусциноподобных включений в цитоплазме. Vv органелл определяли как отношение суммарной площади срезов митохондрий или липофусциновых гранул к площади среза цитоплазмы астроцита.

Статистический анализ. Для анализа данных использовали пакет Статистика 6.0. Нормальность распределения для исследуемых параметров в группах сравнения тестировали с использованием критерия Колмогорова—Смирнова, гомогенность дисперсий — Levene-теста. При соблюдении условий нормальности распределения и гомогенности дисперсий различия между измеренными параметрами в группах культур после воздействия СК здоровых, больных до лечения и леченных в течение 8 и 28 нед оценивали с помощью серии дисперсионных анализов (ANOVA) и повторных измерений c последующим апостериорным сравнением групп.

В течение всего времени культивирования в эксплантатах, окрашенных по методу Ниссля, не было обнаружено признаков центрального некроза и постоянно обнаруживались митотические фигуры. Подробно структура и клеточный состав органотипической культуры эмбрионального мозга человека через 3—4 нед культивирования (включая иммуногистохимическую идентификацию клеток и ультраструктуру) были описаны нами ранее [16].

Влияние сыворотки крови больных шизофренией на ультраструктуру астроцитов в органотипической культуре эмбрионального мозга человека: при качественном анализе не было выявлено различий в ультраструктуре нейронов, их отростков и синапсов в культурах, подвергнутых воздействию СК больных шизофренией (полученных как до лечения, так и в его процессе) и здоровых. При этом ультраструктурные изменения астроцитов зависели от того, на каком этапе лечения были получены сыворотки больных. В культурах, подвергнутых действию СК больных шизофренией, взятых до начала лечения оланзапином, астроциты отличались маленькими размерами и наличием в цитоплазме липофусциноподобных включений (рис. 1). При воздействии на культуру СК больных шизофренией, полученной через 8 нед после начала лечения, ультраструктура подавляющего большинства астроцитов не отличалась от таковой в контроле. Через 28 нед от начала лечения для большинства культур было характерно значительное увеличение размеров ядра и цитоплазмы части астроцитов. Такие астроциты содержали многочисленные митохондрии, но практически не содержали липофусциноподобных включений (см. рис. 1).

При морфометрическом ультраструктурном исследовании было подтверждено, что площадь астроцитов [F (3,96)=13,26, p<0,0001], их ядер [F (3,96)=14,85, p<0,0001] и цитоплазмы [F (3,96)=5,34, p=0,002] достоверно различается при введении в культуральную среду СК больных шизофренией, взятых до лечения и в его процессе (рис. 2). Размеры клеток, их ядер и цитоплазмы достоверно уменьшались при воздействии СК пациентов, взятых до начала лечения оланзапином (~ –14%), по сравнению с контролем, но не отличались от соответствующих параметров астроцитов в контроле при воздействии СК пациентов, взятой через 8 нед от начала лечения. При действии СК, полученной через 28 нед, достоверно увеличивались площади астроцитов (9%) и выявлялась тенденция (p≤0,06) к увеличению в отношении площади ядер и цитоплазмы астроцитов по сравнению с клетками в контрольных культурах. Показано достоверное увеличение площади астроцитов, их ядер и цитоплазмы в культурах, подвергнутых воздействию СК больных шизофренией, полученной через 8 (18%, р≤0,02) и 28 (24—30%, р<0,001) нед терапии по сравнению с астроцитами в культурах, подвергнутых воздействию СК, взятой до начала лечения оланзапином (см. рис. 2).

Выявлены различия в числе [F (3,96)=7,73, p=0,0001] и объемной фракции митохондрий [F (3,96)=5,0, p=0,003] в астроцитах при воздействии СК пациентов, полученной на разных этапах лечения (рис. 3).

Число митохондрий в астроцитах достоверно снижалось при действии СК, взятой до начала лечения, и увеличивалось при действии СК, взятой по окончании лечения по сравнению с таковым в астроцитах из контрольных культур. Последнее касается только СК, полученной через 28 нед, при действии которых число митохондрий в астроцитах было достоверно выше, чем в контроле (р=0,015) и культурах, подвергнутых действию СК, полученной до начала лечения (р<0,001). Число митохондрий в астроцитах при действии СК, полученной через 8 нед, было достоверно выше, чем полученной до начала лечения (р=0,02), и не отличалось от такового в контроле. При действии на культуру СК пациентов, полученной до начала лечения оланзапином, объемная фракция митохондрий в астроцитах снижалась (р=0,06). Vv митохондрий в астроцитах была достоверно больше в культурах при действии СК больных шизофренией, полученной в процессе лечения, по сравнению с действием СК, взятой до его начала (p≤0,005), но не отличалась от соответствующего параметра в контроле (см. рис. 3).

При действии на культуры СК больных шизофренией выявлены также достоверные изменения числа [F (3,96)=9,8, p<0,0001] и Vv [F (3,96)=6,7, p<0,001] липофусциноподобных включений в астроцитах. При этом как число (Duncan test; в 2,4 раза, p<0,0001), так и Vv липофусциноподобных включений (в 2,3 раза, p<0,001) были достоверно больше в астроцитах из культур, подвергнутых действию СК больных шизофренией, взятой до начала лечения по сравнению с астроцитами из контроля. При действии СК больных шизофренией, полученной через 8 и 28 нед после начала лечения оланзапином, число и Vv липофусциноподобных включений не отличались от соответствующих параметров для астроцитов в контрольных культурах.

По данным настоящего исследования, органотипические культуры, полученные из продолговатого мозга человека, через 3—4 нед после начала культивирования представляют собой устойчивые клеточные системы без признаков деструктивных изменений и содержат нейроны, астроциты, микроглию и малодифференцированные клетки. Клеточный состав культуры был ранее подтвержден иммуноцитохимическим методом [16]. Плотные участки нейропиля между клетками состоят из профилей дендритов, аксонов и астроцитарных отростков, а также содержат синаптические контакты, что свидетельствует о развитых межклеточных взаимодействиях в этих культурах.

Следует отметить сохранность ультраструктуры нейронов и структуры нейропиля, включая синаптические контакты, в культурах при воздействии СК больных шизофренией, полученных как до начала лечения оланзапином, так и в его процессе. Как уже обсуждалось в предыдущей статье [1], сохранность нейронов, их отростков и синаптических контактов в культурах при воздействии СК пациентов может быть обусловлена нейропротективными свойствами иммунокомпетентных клеток, астроцитов и микроглии. Такая возможность подтверждается экспериментальными данными, согласно которым астроциты в культуре способны экспрессировать функционально активные TOLL-like-рецепторы. Взаимодействие этих рецепторов с патогенными факторами запускает в астроцитах экспрессию широкого спектра цитокинов и нейротрофических факторов, что, по мнению ряда авторов [7, 8], лежит в основе нейропротективных свойств астроцитов при действии повреждающих факторов на органотипические культуры мозга животных и человека.

Другой важный факт — это выявленные нами различия в реакции астроцитов на действие СК пациентов, взятых до начала и в процессе лечения оланзапином. Как уже обсуждалось ранее, дистрофические изменения астроцитов при воздействии СК пациентов, полученных до начала лечения, могут быть связаны с существенным повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов в СК [2], что свидетельствует об активации гуморального иммунитета и активной выработке антител, в том числе аутоантител. Имеются данные о наличии у больных шизофренией антител к мускариновым ацетилхолиновым рецепторам астроцитов, способных взаимодействовать с культивируемыми астроцитами [3], белкам ядер, в частности гистонам, а также NMDA-рецепторам глутамата, экспрессируемым астроцитами [4—6]. В пользу этого предположения свидетельствует и то, что дистрофические изменения астроцитов никогда не обнаруживались при воздействии на культуры СК, полученной в процессе лечения оланзапином, когда уровень циркулирующих иммунных комплексов не отличался от контрольного [2]. О том, что нейролептическая терапия способна снижать уровень циркулирующих в крови пациентов аутоантител к антигенам мозга или нормализовать показатели гуморального иммунитета у экспериментальных животных, сообщают и другие авторы [9—12].

По нашим данным, при воздействии СК, взятой через 8 нед после начала лечения, ультраструктура астроцитов, их размеры, а также число и Vv липофусциноподобных включений не отличались от соответствующих параметров астроцитов из контрольных культур, тогда как изменения ультраструктуры значительной части астроцитов в культурах при воздействии СК пациентов, полученной через 28 нед от начала лечения, свидетельствуют об их гипертрофии. Это проявлялось в достоверном увеличении как площади клеток, так и числа митохондрий в цитоплазме. Vv митохондрий не отличалась от таковой в астроцитах из контрольных культур. Перечисленные особенности свидетельствуют, что речь идет не о набухании, а именно гипертрофии клеток. Однако мы не наблюдали существенного увеличения числа глиофибрилл в цитоплазме гипертрофированных астроцитов. Хотя глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) экспрессируется в астроцитах через 4 нед культивирования, как показал проведенный нами ранее иммуногистохимический анализ, глиофибриллы в этих клетках немногочисленны и локализуются преимущественно в их отростках [16]. Известно, что в ответ на повреждения (механические или связанные с иммунными факторами) культивируемые астроциты способны к пролиферации и гипертрофии, что сопровождается усилением экспрессии ГФКБ и других маркеров глиоза [17—19]. Однако в нашем исследовании речь идет о культивировании эмбриональных астроцитов, которые, по некоторым данным [20], не способны к истинному астроглиозу до конца II триместра беременности. Можно предположить, что происходит активация астроцитов, проявляющаяся в их гипертрофии в соответствии с эмбриональным происхождением культуры.

Что касается причин выявленной гипертрофии астроцитов, большой интерес представляют данные о том, что их активация весьма чувствительна к воздействию ИЛ. У пациентов, СК которых использована в нашем исследовании, уровни продукции ИЛ-1ß и ИЛ-10 до начала лечения не отличались от таковых у здоровых [2]. Однако в процессе лечения уровень продукции ИЛ-1ß значимо увеличивался, превышая таковой у психически здоровых, тогда как уровень продукции ИЛ-10 снижался, достигая статистической значимости через 28 нед от начала лечения [2]. Можно предположить, что именно изменения уровней продукции этих ИЛ, особенно соотношения между ними, могут вносить существенный вклад в описанную нами гипертрофию астроцитов.

Повышение экспрессии ИЛ-1β неоднократно описано для СК и цереброспинальной жидкости больных шизофренией, в том числе у вновь заболевших [21]. По данным генетических исследований [22, 23], существует тесная связь между полиморфизмом гена, кодирующего ИЛ-1β, и шизофренией. Некоторые авторы рассматривают астроциты как ключевой элемент в медиации воспалительных процессов в мозге [24], при этом именно ИЛ-1β способен индуцировать продукцию астроцитами ИЛ-6, фактора некроза опухолей, цитокинов [25], а также хемокинов и факторов адгезии, стимулирующих рекрутирование лейкоцитов в мозг при различных воспалительных заболеваниях ЦНС [24]. Более того, введение противовоспалительного ИЛ-10 заметно подавляло проявления глиоза, в том числе вызванного ИЛ-1ß и ИЛ-6 [19, 26, 27]. Можно предположить, что одной из причин отмеченной нами гипертрофии астроцитов было нарушение в СК пациентов соотношения между ИЛ-1ß и ИЛ-10, наиболее выраженное через 28 нед от начала лечения оланзапином.

Нельзя не принимать во внимание также возможность непосредственного влияния оланзапина на морфологию астроцитов. Имеются данные, что введение высоких доз атипичного нейролептика рисперидона непосредственно в культуральную среду вызывало изменение формы культивируемых астроцитов, которые становились звездчатыми [27], усиливало секрецию белка S100B и оказывало выраженное стимулирующее влияние на параметры обмена глутамата в них [28]. В нашем исследовании концентрация оланзапина в сыворотке крови пациентов не определялась, однако тот факт, что через 8 нед после начала лечения ультраструктура астроцитов практически не отличалась от таковой в контроле, свидетельствует против такого предположения.

Таким образом, результаты настоящего исследования в совокупности с полученными нами ранее данными свидетельствуют о том, что воздействие СК больных шизофренией на органотипическую культуру эмбрионального мозга человека вызывает изменения только со стороны астроцитов. О специфичности реакции астроцитов свидетельствует тот факт, что изменения их ультраструктуры носили дистрофический характер при воздействии СК пациентов, полученных до начала лечения, а СК пациентов через 28 нед от начала лечения оланзапином вызывала гипертрофию астроцитов. При этом ультраструктура нейронов, их отростков и синаптических контактов оставалась неизмененной. Можно предположить, что астроциты как иммунокомпетентные клетки мозга реагируют на содержащиеся в СК пациентов факторы, связанные с нарушениями иммунитета, и оказывают при этом нейропротективное действие.

Конфликт интересов отсутствует.