Поиск новых маркеров окислительного стресса при ишемии мозга для оптимизации терапевтических подходов

Для разработки научных основ профилактики нарушений мозгового кровообращения важнейшее значение имеют такие направления ангионеврологии, как концепция факторов риска развития заболевания и концепция патогенетической гетерогенности инсульта [9].

Впервые о факторах риска стали говорить в связи с выявляемыми корреляциями между отдельными характеристиками населения и развитием в дальнейшем коронарной болезни сердца и инсульта [27]. Многочисленные зарубежные и отечественные эпидемиологические исследования [43] свидетельствуют о все возрастающем многообразии факторов риска развития ишемического инсульта.

В последние годы возрос интерес к исследованию роли факторов воспаления в патогенезе инсульта, а также прогнозированию риска первичных и вторичных цереброваскулярных катастроф по уровню воспалительных маркеров в различных популяциях [25, 29, 32, 46]. Механизм патогенного действия «традиционных» факторов риска инсульта в определенной степени связан с индукцией воспалительных и протромботических процессов в артериальном сосудистом русле, особенно у пациентов с атеросклерозом. Многочисленные экспериментальные исследования продемонстрировали, что даже незначительное повышение концентрации провоспалительных факторов способствует прогрессированию атерогенеза и развитию хронической ишемизации головного мозга с формированием энцефалопатии [25, 29, 32, 46].

В результате выраженного снижения уровня кровотока (до 70-80%) запускаются патофизиологические изменения, характерные для ишемии любого генеза, - ишемический каскад, сущность которого сводится к развитию энергетического дефицита и лактат-ацидоза по причине снижения доставки О₂ и глюкозы, а также уменьшения напряжения СО₂, что ведет к немедленному расщеплению аденозинтрифосфата (АТФ) для покрытия потребностей клеток в энергии. Впоследствии это приводит к снижению синтеза АТФ и формированию энергетической недостаточности.

Эти события способствуют повреждению функции натрий-калий-АТФ-зависимой ионной помпы, в результате чего ионы натрия и хлора входят в клетку, а калия - выходят из нее, что вторично повышает вхождение в клетку воды и способствует отеку [23, 28]. Последующие события характеризуются развитием мембранной деполяризации, которая открывает кальциевые каналы для дополнительного входа кальция в клетку и повышает рост внеклеточной концентрации глутамата и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) [7, 12]. Активация NMDA- и AMPA-рецепторов, а также рецепторов каината ведет к формированию ишемического цикла за счет вхождения в клетку ионов кальция, натрия, хлора и воды, что приводит к внеклеточному высвобождению провоспалительных цитокинов, медиаторов воспаления, высокоактивных свободных радикалов и острофазных астроцитарных белков (C-реактивный белок, сывороточный амилоидный А-белок, альфа1-антитрипсин, альфа2-макроглобулин, фибриноген, церулоплазмин, компонент комплемента C9 и фактор B, лактоферрин, белок SAA). Это оказывает негативное воздействие на межклеточные структуры, окружающие клеточные мембраны и, что особенно важно, на сосудистую стенку. Происходит повреждение базальной сосудистой мембраны, межэндотелиальных контактов и самой эндотелиальной выстилки церебральных сосудов, что запускает процессы эндотелиальной дисфункции (рис. 1) [17].

На разных стадиях микроциркуляторно-клеточного каскада эндотелий претерпевает ряд существенных изменений: структурные повреждения (разрыв, сморщивание и коагуляционный некроз) и функциональную перестройку, в ходе которой происходит экспрессия молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 в результате секреции интерлейкинов IL-1α и IL-1β тромбоцитами, фактора некроза опухолей α (ФНО-α), фактора активации тромбоцитов с экспрессией на их поверхности цитокина CD 40L, секреция фактора адгезии нейтрофилов IL-8 [16], тромбоксана, вазоконстрикторов, дисбаланс в системе вазорегуляции, приобретение гемостатических прокоагуляционных свойств, увеличение проницаемости базальной мембраны и реализация выхода фактора CXCL1 трасэндотелиальной миграции для нейтрофилов и жидкости на фоне угнетения абсорбции (рис. 2) [3, 7, 16, 17].

В результате этих событий происходит формирование цитотоксического отека глии и нейронов (в течение 6-72 ч после развития ишемии), проникновение токсических веществ из сосудистого русла в мозговую ткань на фоне продолжающихся оксидативных и прокоагулянтных реакций. В итоге происходит активация клеток микроглии, которые подобно нейтрофилам секретируют пероксидазы, в том числе и миелопероксидазу (МПО), что приводит к гибели жизненно важных нейронов с формированием инфарктного очага [19, 47]. Возрастание концентрации С-реактивного белка в крови больных уже в первые часы острой церебральной ишемии запускает активацию системы комплемента по классическому пути, что также способствует развитию воспаления в ишемизированной зоне и увеличению размера ишемического очага [38]. При ишемии мозга реперфузия ишемизированной мозговой ткани (вследствие установления коллатерального кровообращения или реканализации) приводит к усиленному образованию активных форм кислорода (АФК) клетками мозга и иммунными клетками. АФК стимулируют секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов, в результате чего повышается приток воспалительных клеток в зону повреждения [22]. Последние также начинают высвобождать АФК, матриксные металлопротеиназы, оксид азота и другие соединения, опосредующие повреждение клеток, гематоэнцефалического барьера и внеклеточного матрикса [34].

Все эти процессы лежат в основе вторичного ишемического повреждения мозга, проявляющегося отеком мозга, постишемическим микрососудистым стазом, вазомоторным и гемодинамическим дефицитом [48]. Можно предположить, что «традиционные» факторы риска оказывают влияние на взаимодействие воспалительных клеток с резидентными цереброваскулярными клетками, повышая чувствительность последних к воспалительной стимуляции и способствуя формированию атероматозных бляшек в крупных мозговых артериях и утолщению интимы с локальными тромбозами в артериолах [1].

Инфильтрация ишемизированных зон лейкоцитами сопровождается интенсификацией перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4-7, 10, 11]. Окисленные липиды обладают антигенными свойствами, запуская аутоиммунные процессы повреждения тканей. При изучении молекулярно-клеточных механизмов активации процессов липопероксидации высказана мысль о цитокинопосредованной интенсификации ПОЛ при ишемии. Характер этого влияния зависит от числа нейтрофилов и их фоновой активности.

Нейтрофилы (полиморфно-ядерные лейкоциты) обладают целым арсеналом гидролитических ферментов и бактерицидных белков, хранящихся в гранулах, которые под действием хемотаксических градиентов мигрируют в очаг воспаления. В результате активации клеток содержимое гранул постепенно переходит в фагосомы (компоненты клетки, участвующие в фагоцитозе) или во внеклеточное пространство. Рост концентрации внутриклеточного кальция, опосредованное при ишемии встраиванием в клеточные мембраны гидроперекисей липидов, способствует дегрануляции нейтрофилов [2, 8]. Ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что активация нейтрофилов может происходить и по Са²⁺-независимому механизму. Так, показано, что форболмиристатацетат (ФМА) активирует нейтрофилы независимо от Са²⁺ в цитозоле [35]. Тем не менее при увеличении концентрации Са²⁺ до 0,25 мкМ, происходит выброс содержимого секреторных пузырьков и третичных гранул, в состав которых входят альбумин, желатиназа, коллагеназа и другие белки, необходимые нейтрофилу для движения через плотные ткани к очагу воспаления. При увеличении концентрации внутриклеточного кальция до 0,7 мкМ происходит выброс содержимого из вторичных азурофильных гранул, содержащих огромное количество гемсодержащего фермента - МПО.

МПО образует гипохлорит-анион, который, будучи сильным окислителем, вызывает разрушение жировых атеросклеротических отложений в стенке сосуда и последующий тромбоз. Установлено, что повышенный системный уровень МПО (содержание в нейтрофилах и крови) ассоциирован с наличием заболеваний коронарных артерий [49]. Кроме того, повышенный уровень МПО в крови может повышать риск развития неблагоприятных кардиологических событий (инфаркт миокарда, внезапная смерть и др.) у больных с грудной болью и острым коронарным синдромом [13, 20]. За последние несколько лет проведенные клинические исследования показали, что высокие концентрации МПО связаны с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, независимо от «классических» факторов риска коронарных синдромов. В частности, в работе A. Stefanescu и соавт. [42] показано, что уровень МПО в крови у пациентов с заболеваниями сердца оказался выше контрольного. Более того, повышенный уровень МПО у пациентов с болью в груди значимо коррелировал с развитием крупных неблагоприятных коронарных событий в течение последующих 6 мес. Следует отметить, что содержание МПО в плазме крови оказалось более информативным показателем, чем содержание С-реактивного белка.

Известно, что нестабильность и разрыв атеросклеротической бляшки являются основными неблагоприятными процессами в развитии острых сердечно-сосудистых событий. МПО может играть определенную роль в дестабилизации атеросклеротической бляшки путем активации металлопротеиназ, тем самым ослабляя ее фиброзную капсулу [39]. В экспериментах in vitro было показано, что МПО может переводить липопротеины низкой плотности в так называемую атерогенную, легко захватываемую макрофагами форму за счет окисления лизиновых остатков и нитрирования аполипопротеина В-100 и инициации ПОЛ [36]. Кроме того, МПО может переводить липопротеины высокой плотности в дисфункциональную форму за счет нитрирования и хлорирования тирозиновых остатков в аполипотеине A-1, нарушая тем самым клеточный транспорт холестерина. Предполагают, что таким образом МПО может способствовать возникновению и росту атеросклеротической бляшки [31].

МПО может участвовать в развитии нестабильности бляшки. В опытах in vitro было показано, что низкие концентрации генерированного МПО гипохлорита вызывают активацию эндотелиоцитов, сопровождающуюся увеличением экспрессии Р-селектина и тканевого фактора, что приводит к повышению тромбогенности эндотелиальной поверхности [26]. Патоморфологическое исследование поврежденных бляшек у внезапно умерших больных показало солокализацию МПО и гипохлорит-модифицированных белков, ассоциированных с внутрикоронарными тромбами [44]. Предполагают также, что за счет потребления эндогенного NO в качестве субстрата МПО может участвовать в развитии дисфункции эндотелия, являющейся одним из ранних изменений атерогенеза и характеризующейся развитием анормальной сосудистой реактивности и экспрессией различных провоспалительных и протромботических факторов [14].

В экспериментальных работах R. Weston и соавт. [45] и M. Breckwoldt и соавт. [19] получены данные, что МПО в достаточно большом количестве присутствует в ишемической ткани мозга, и ее концентрация коррелирует с размером пораженной зоны. С этой точки зрения МПО может рассматриваться как один из наиболее точных диагностических параметров прогрессирования ишемии.

Альфа-липоевая кислота (α-ЛК; тиоктовая кислота) является природной простатической группой в -кетокислотном дегидрогеназном комплексе митохондрий и играет важнейшую роль в метаболизме. Показано, что α-ЛК влияет на клеточные метаболические процессы in vitro, может влиять на редокс-статус клеток и взаимодействовать с тиолами и другими антиоксидантами [15, 24]. Дитиоловая природа α-ЛК делает ее высоко активной против ряда свободных радикалов и одновременно способствует регенерации окисленных антиоксидантов [15, 30, 33, 37].

К образованию свободных радикалов приводят самые различные виды реакций. Выше отмечалось, что в качестве ответной реакции на воспалительную стимуляцию высокореактивными кислородными ионами происходит резкое респираторное увеличение количества нейтрофилов. Образуется супероксид, который в присутствии супероксиддисмутазы образует Н₂О₂. Далее он конвертируется в НОСl под действием МПО. Выяснено, что α-ЛК обладает способностью к очищению как от Н₂О₂, так и НОСl [18, 21, 33, 40]. Следовательно, α-ЛК обладает важным терапевтическим потенциалом в состояниях, сопровождающихся окислительным стрессом.

По данным экспериментальных исследований и клинических испытаний, проведенных в последние 5 лет с использованием больших доз α-ЛК, были получены новые данные об эффективности этого препарата в лечении не только инсулинорезистентности и диабетической полинейропатии, но и инсульта [330, 41].

Использование «традиционных» факторов риска позволяет оценить вероятность сердечно-сосудистых катастроф лишь в половине случаев, а исследование факторов воспаления и эндотелиальной дисфункции при ишемии мозга может быть использовано в качестве дополнительных маркеров оценки как угрозы развития инсульта и прогрессирования хронической цереброваскулярной патологии, так и эффективности лечебных стратегий.

С учетом вышесказанного нами была поставлена цель настоящего исследования: изучить уровень МПО в острейшей стадии инсульта и проследить его изменение после проведенного курса антиоксидантной терапии.

В качестве антиоксидантного препарата была выбрана α-липоевая кислота.

В исследование были включены 55 человек: 45 больных с ишемическим инсультом давностью не более 48 ч в возрасте от 49 до 78 лет (средний - 61,2±8,8 лет) и 10 условно здоровых лиц, составивших контрольную группу.

Больные с инфарктом мозга были разделены на 2 группы. Пациенты 1-й группы получали базовую терапию инсульта гипотензивными, антиагрегантными, кардиальными и вазоактивными средствами. Пациенты 2-й группы получали дополнительно к базовой терапии препарат α-ЛК берлитион - по 300 мг в разведении на 200 мл физиологического раствора внутривенно капельно ежедневно в течение 10 суток. Исследование лабораторных маркеров окислительного стресса проводили до начала лечения (при поступлении в стационар - 1-е сутки) и после его окончания (10-е сутки).

Количественное определение содержания МПО в крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) проводили в соответствии с протоколом по стандартной методике, используя набор BenderMedSystems (Австрия). Кровь забирали утром натощак, центрифугировали (1200 g, 15 мин), полученную плазму разливали в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и замораживали при –20 °С. В качестве антикоагулянта использовали гепарин.

Для исследования фагоцитарной активности исходных нейтрофилов использовался метод хемилюминесценции (ХЛ), вспышку ХЛ регистрировали при комнатной температуре на хемилюминометре SMARTLUM 5773 (Россия). Стандартный образец содержал: среду Хенкса (0,42 мМ Na₂HPO₄, 20 мМ KH₂PO₄, 137мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 5 мМ D-глюкозы), буфер активации (1 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺; рН 7,4), нейтрофилы (150 000 клеток), и 10 мкМ люминола. Результат представляли в виде светосуммы за первые 25 мин, начиная с момента добавления буфера активации в присутствии или в отсутствии активатора нейтрофилов (5 мкг/мл ФМА).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 8. В качестве критерия достоверности использовали тест Манна-Уитни для двух несвязанных групп и тест Краскелла-Уоллиса ANOVA для трех и более несвязанных групп. Достоверными принимались значения при р<0,05.

На рис. 3, а представлены результаты определения уровня МПО в плазме крови методом иммуноферментного анализа до лечения.

Известно, что в развитии общего системного воспаления нейтрофилы играют одну из ведущих ролей, являясь, помимо МПО, источником целого ряда гидролитических ферментов. Исходя из этого, представлялось целесообразным проследить развитие воспалительной реакции у больных с ОНМК на изолированных нейтрофилах. Для этого было проведено сравнение фагоцитарной активности исходных (неактивированных) и активированных ФМА нейтрофилов. На рис. 3, б видно, что уровень фагоцитарной активности неактивированных нейтрофилов не различается у группы больных и группы контроля, тогда как при активации нейтрофилов ФМА можно наблюдать достоверные различия (см. рис. 3, в). Этот факт можно объяснить тем, что находясь в системе in vivo, нейтрофилы больных и здоровых прибывают в состоянии отличного друг от друга биологического равновесия. В процессе развития острого ишемического процесса в кровотоке появляется множество факторов активации клеток (АТФ, белки мозгового повреждения и повреждения сосудистой стенки и др.), которые, оказывая влияние на рецепторы и активируя ионные каналы на мембране клеток, делают их кометированными к активации, что мы и наблюдаем при добавлении ФМА. В свою очередь, отсутствие различий в оценке неактивированных клеток можно объяснить одинаковыми и «стерильными» (отсутствие природных активаторов, использование в обоих случаях одних и тех же буферных растворов) условиями проведения эксперимента, а также естественными неблагоприятными воздействиями, которым подвергаются клетки в процессе выделения.

Проведенные ранее клинические исследования показали достоверную взаимосвязь между развитием системной воспалительной реакции и повышением уровня триглицеридов (ТГ) в крови. Причины этого остаются до конца не выясненными, хотя некоторые исследователи [42] связывают этот факт с липолизом жировой ткани, повышением заново синтезированных в печени жирных кислот, а также подавлением их окисления. Полученные нами результаты (см. рис. 3, г) согласуются с данными литературы. Насколько важным окажется изучение этого аспекта в прогнозе дальнейшего развития ишемических повреждений головного мозга и связанного с ним острого и хронического воспаления, может показать последующее динамическое наблюдение данной группы пациентов.

Анализ результатов проведенного лечения (рис. 4) выявил достоверное (р<0,05) снижение уровня МПО в обеих группах пациентов.

Полученные в исследовании результаты свидетельствуют об увеличении концентрации и активности МПО у больных в острейшей стадии ишемического инсульта, а также о высокой чувствительности данного показателя при оценке активности системного воспаления и связанного с ним окислительного стресса. Полученные результаты, а также литературные данные о прогностической роли МПО в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы и дисфункции эндотелия могут служить основанием для оценки МПО-зависимых реакций в увеличении риска развития ОНМК у пациентов с цереброваскулярной патологией.

Регистрируемая при ОНМК активизация системного воспаления и связанного с ним окислительного стресса требует медикаментозной коррекции. Нейропротективное действие α-ЛК, опосредованное через предотвращение повреждающего воздействия свободных радикалов на клеточные мембраны и уменьшение выраженности окислительного стресса, является патогенетическим обоснованием использования препаратов α-ЛК (берлитион) как антиоксидантных средств при ишемическом поражении головного мозга. Критерием эффективности лечения может служить изменение содержания МПО в плазме крови больных.

Полученные в настоящем исследовании результаты и приведенные данные литературы свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения роли воспаления при цереброваскулярной патологии, продолжения поиска маркеров окислительного стресса, а также углубленного изучения эффективности антиоксидантов при данной патологии, в частности нейропротективных свойств α-ЛК.