Рассеянный склероз (РС) — аутоиммунное демиелинизирующее и нейродегенеративное заболевание ЦНС, которое поражает преимущественно молодых людей. В основе патогенеза РС лежит аутоиммунное воспаление по отношению к аутоантигенам ЦНС, таким как белки и липиды миелина. Длительное время предполагалось, что характерное для РС нейровоспаление опосредовано, главным образом, T- и B-лимфоцитами, которые рассматриваются как ключевая мишень для препаратов, изменяющих течение РС (ПИТРС) [1]. Однако наряду с клетками адаптивной иммунной системы, клетки врожденного иммунного ответа также имеют важное значение в развитии и поддержании аутоиммунного нейровоспаления [2]. Мононуклеарные фагоциты, включающие моноциты, макрофаги, дендритные клетки и резидентную микроглию, являются центральным звеном в функционировании врожденного иммунного ответа и способны участвовать как в индукции аутоиммунного воспаления, так и в поддержании иммунологической толерантности, в связи с чем модуляция их функций является важной задачей для иммуномодулирующей терапии РС [3,4].

Исследования последних 10 лет установили важную роль биогенных аминов в регуляции нейровоспаления при РС [5—7]. Было показано модулирующее действие серотонина, дофамина и норадреналина, а также таргетирования их рецепторов на функции Th17- и Th1-клеток — ключевых участников нейровоспаления при РС [5—7]. Среди рецепторов биогенных аминов, вовлеченных в нейроиммуномодуляцию, наиболее изученными являются D₁- и D₂-подобные рецепторы дофамина (D₁DR и D₂DR), которые экспрессируются клетками как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. В частности, было установлено, что блокада D₁DR подавляет продукцию интерлейкина (ИЛ)-17, интерферона-γ (ИФН-γ), ИЛ-21, а также гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) CD4⁺ T-клетками больных ремиттирующим РС [7]. Кроме того, было показано противовоспалительное влияние специфических антагонистов D₁DR на течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ, животная модель РС) [8]. В то же время роль D₁DR в регуляции мононуклеарных фагоцитов при РС нуждается в уточнении.

Представлены результаты собственного исследования влияния антагонистов D₁DR и D₂DR на продукцию цитокинов CD14⁺ моноцитами, а также макрофагами больных ремиттирующим РС. Установлен ингибирующий эффект специфического антагониста D₁DR SCH 23390 на продукцию цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1β, необходимых для дифференцирования Th17-клеток, и играющих критическую роль в патогенезе аутоиммунного нейровоспаления. В совокупности с результатами предыдущих исследований, полученные данные указывают на потенциальный дополнительный механизм иммунорегуляции при РС посредством таргетирования рецепторов дофамина на CD14⁺ моноцитах и макрофагах, расширяя их роль в нейроиммуномодуляции.

Материал и методы

Проведено комплексное клиническое и иммунологическое обследование 10 больных (6 женщин и 4 мужчины) в возрасте от 22 до 37 лет с ремиттирующим РС в соответствии с критериями МакДональда в модификации 2017 г. [9]. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 2 до 10 лет. Все больные получали терапию препаратом глатирамера ацетат более 9 мес. Все пациенты находились в стадии клинической ремиссии более 6 мес. Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале Expanded Disability Status Scale (EDSS) [10]. На момент забора крови все исследуемые больные более 6 мес не получали лечение глюкокортикостероидами или антидепрессантами. Контрольную группу составили 10 здоровых доноров (6 женщин и 4 мужчин). Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Клинико-демографические характеристики групп больных РС и здоровых доноров представлены в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-демографические характеристики больных РС и группы здоровых доноров

Все больные подписали информированное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ФГБУ «ФЦМН» ФМБА России (протокол №06/19-09-22).

Для оценки продукции цитокинов моноцитами из венозной крови, взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с гепарином, выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (МНКПК) путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (ООО НПП «ПанЭко», Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH7,3) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 (ООО НПП «ПанЭко», Россия) с добавлением 2 mM L-глутамина (ООО НПП «ПанЭко», Россия) и 2% донорской AB-сыворотки (PAA, Австрия). Затем из образцов МНКПК методом иммуномагнитной сепарации (негативная селекция) (Miltenyi Biotec, Германия) выделяли CD14⁺ моноциты. Согласно данным многоцветной проточной цитометрии, чистота выделения CD14⁺ моноцитов составляла более 90% (данные не представлены). Затем образцы CD14⁺ моноцитов в количестве 10⁵ в 200 мкл на лунку вносили в 96-луночный плоскодонный планшет (SPL, Республика Корея), преинкубировали с ИФН-γ (1000 МЕ/мл; ООО «НПП "Фармаклон"», Россия) в течение 4 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего стимулировали липополисахаридом (ЛПС, 100 нг/мл; Sigma, США) [11]. В отрицательный контроль вместо ИФН-γ и ЛПС вносили эквивалентный объем культуральной среды. Далее CD14⁺ моноциты культивировали 24 ч в CO₂-инкубаторе, после чего отбирали супернатант и замораживали при –70 °C. Для оценки влияния блокады рецепторов дофамина на продукцию цитокинов, образцы CD14⁺ моноцитов преинкубировали в присутствии специфических антагонистов D₁DR или D₂DR (SCH 23390 и сульпирид соответственно; Tocris, Швейцария) в конечной концентрации 10^–5 М [7].

Для получения макрофагов, выделенные CD14⁺ моноциты культивировали с рекомбинантным человеческим ГМ-КСФ (40 нг/мл; Miltenyi Biotec, Германия) в течение 6 сут [12]. Для анализа продукции цитокинов макрофаги высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты по 4·10⁴ клеток на 200 мкл среды на лунку. Затем в течение 4 ч клетки преинкубировали с 1000 МЕ/мл ИФН-γ при 37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего вносили ЛПС в конечной концентрации 100 нг/мл [11]. В отрицательный контроль вместо ИФН-γ и ЛПС вносили эквивалентный объем культуральной среды. Далее планшеты инкубировали при +37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 ч. С целью активации NLRP3-инфламмасомы и индукции выработки ИЛ-1β, за 30 мин до окончания инкубации в макрофаги вносили аденозинтрифосфат в конечной концентрации 5 mM (A9187; Sigma, США) [13]. По окончании инкубации от культуры клеток отбирали супернатант и замораживали при –70 °C. Для оценки влияния блокады рецепторов дофамина на продукцию цитокинов образцы макрофагов преинкубировали в присутствии специфических антагонистов D₁DR или D₂DR в конечной концентрации 10^–5 М, после чего стимулировали по вышеописанной схеме [7].

Уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-6 и ИЛ-1β в супернатантах клеточной культуры определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы Invitrogen (США). Уровни аналитов выражали в пг/мл или процентах по отношению к стимулированной продукции цитокинов в отсутствии антагонистов D₁DR и D₂DR.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы GraphPad Prizm 6. Для оценки различий двух групп использовались непараметрический U-критерий Манна—Уитни или знаковый ранговый критерий Уилкоксона. Статистически значимыми различия считались при p<0,05.

Результаты

Согласно данным ИФА, продукция ИЛ-6 и ИЛ-1β как нестимулированными, так и ИФН-γ/ЛПС-стимулированными CD14⁺ моноцитами была сопоставима между группами (табл. 2). Внесение антагониста D₁DR SCH 23390 оказало ингибирующий эффект на продукцию цитокинов стимулированными CD14⁺ моноцитами в обеих группах, тогда как блокада D₂DR сульпиридом, напротив, стимулировала продукцию цитокинов в обеих группах (рис. 1, а—г).

Таблица 2. Продукция ИЛ-6 и ИЛ-1β CD14⁺ моноцитами больных РС и здоровых доноров, Me [Q₂₅; Q₇₅]

Рис. 1. Влияние антагонистов D₁DR или D₂DR на продукцию цитокинов CD14⁺ моноцитами больных РС и здоровых доноров in vitro.

CD14⁺ моноциты (в количестве 10⁵ в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС или здоровых доноров были преинкубированы с/без антагонистов D₁DR или D₂DR (SCH 23390 и сульпирид, соответственно) в конечной концентрации 10^–5 М, после чего были активированы ИФН-γ/ЛПС. После 24-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-6 (а, б) и ИЛ-1β (в, г) методом ИФА. Данные представлены в виде Me [Q₂₅; Q₇₅], символы обозначают значения, полученные от каждого больного РС или здорового донора. * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001; **** — p<0,0001.

Продукция цитокинов макрофагами также не различалась между группами (табл. 3). Как и в случае с CD14⁺ моноцитами, блокада D₁DR снижала продукцию ИЛ-6 и ИЛ-1β в обеих группах (рис. 2, а—г). В то же время блокада D₂DR не оказывала какого-либо влияния на продукцию цитокинов стимулированными макрофагами ни в одной из групп (см. рис. 2, а—г).

Таблица 3. Продукция ИЛ-6 и ИЛ-1β макрофагами больных РС и здоровых доноров, Me [Q₂₅; Q₇₅]

Рис. 2. Влияние антагонистов D₁DR или D₂DR на продукцию цитокинов макрофагами больных РС и здоровых доноров in vitro.

Макрофаги (МФ) (в количестве 4·10⁴ в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС или здоровых доноров были преинкубированы с/без антагонистов D₁DR или D₂DR (SCH 23390 и сульпирид, соответственно) в конечной концентрации 10^–5 М, после чего были активированы ИФН-γ/ЛПС. После 24-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-6 (а, б) и ИЛ-1β (в, г) методом ИФА. Данные представлены в виде Me [Q₂₅; Q₇₅], символы обозначают значения, полученные от каждого больного РС или здорового донора. * — p<0,05; ** — p<0,01.

Обсуждение

Несмотря на достигнутые за последние десятилетия успехи в области терапии РС, лечение таких больных остается актуальной задачей. Одним из наиболее значимых ограничений применения высокоэффективных ПИТРС 2-й линии связано с их выраженным иммуносупрессивным эффектом и, как следствие, развитием серьезных нежелательных явлений. Также следует отметить, что в связи с неспособностью проникать в ЦНС через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), целый ряд таких препаратов (в частности, моноклональные антитела) реализуют свой эффект на периферии, не оказывая прямого влияния на нейровоспаление in situ [14].

Учитывая важную роль клеток врожденного иммунного ответа в патогенезе ЭАЭ и РС, исследование дополнительных методов модуляции их функций, в том числе путем воздействия на рецепторы дофамина — прямого медиатора нейроиммунного взаимодействия — является актуальным [15, 16]. О противовоспалительном эффекте антагонистов D₁DR ранее уже сообщалось. В частности, было показано, что блокада D₁DR с применением SCH 23390 оказывает ингибирующий эффект на способность дендритных клеток индуцировать Th17-иммунный ответ in vitro. Схожие данные авторы получили при использовании других селективных антагонистов D₁DR (SKF 83566 или LE 300). Кроме того, было обнаружено противовоспалительное влияние блокады D₁DR in vivo при ЭАЭ: SCH 23390 оказывал как лечебный, так и профилактический эффект на ЭАЭ у мышей [17]. В последующих исследованиях C. Prado и соавт. установили, что выключение D₅-рецепторов дофамина, которые также относятся к группе D₁DR, препятствует развитию тяжелого ЭАЭ. При этом перенос дендритных клеток таких мышей также оказывал положительный эффект на течение ЭАЭ у диких мышей, что подтверждает результаты Nakano и соавт. [18, 19]. Также был установлен и прямой ингибирующий эффект блокады D₁DR на функции провоспалительных Th17- и Th1-клеток больных ремиттирующим РС [7].

В то же время о противовоспалительном влиянии антагониста D₁DR на моноциты и макрофаги больных РС ранее не сообщалось. Подавление продукции цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1β CD14⁺ моноцитами и макрофагами может иметь важное значение в модуляции нейровоспаления. Участие этих цитокинов в аутоиммунном воспалении в ЦНС может опосредоваться их множественными эффектами. В частности, ИЛ-6 и ИЛ-1β играют важную роль в развитии Th17-клеток. Установлено, что ИЛ-6 является ключевым ранним фактором дифференцирования Th17-клеток, тогда как ИЛ-1β регулирует более поздние стадии развития Th17-клеток [20]. Кроме того, ИЛ-6 и ИЛ-1β способны дестабилизировать ГЭБ, повышать его проницаемость и привлекать в очаг воспаления различные популяции иммунных клеток, способствуя усилению и хронизации воспаления [21, 22]. В настоящее время ИЛ-6 и ИЛ-1β рассматриваются как важные мишени для иммуномодулирующей терапии демиелинизирующих заболеваний ЦНС [21, 22].

Однако наряду с ингибирующим эффектом блокады D₁DR на продукцию цитокинов CD14⁺ моноцитами также был обнаружен стимулирующий эффект блокады D₂DR, что может быть объяснено противоположным влиянием D₁DR и D₂DR на аденилатциклазу и цАМФ [23]. Эти данные также подтверждаются провоспалительным эффектом антагонистов D₂DR на течение ЭАЭ, указывая на необходимость селективного воздействия на D₁DR и D₂DR [17].

Следует отметить, что представленные предварительные результаты имеют ряд ограничений. В частности, в уточнении нуждаются молекулярные механизмы действия антагонистов D₁DR и D₂DR на функции CD14⁺ моноцитов и макрофагов. Кроме того, используемые в настоящем исследовании антагонисты SCH 23390 и сульпирид являются селективными только в отношении групп D₁DR и D₂DR, тогда как значение каждого рецептора (D₁, D₂, D₃, D₄, D₅) также нуждается в дальнейшем изучении.

Заключение

Таким образом, полученные ранее данные, а также предварительные результаты настоящего исследования позволяют предположить противовоспалительный эффект антагонистов D₁DR при РС, который может быть связан с влиянием как на адаптивный, так и на врожденный иммунный ответ. Важно отметить, что такой эффект ex vivo/in vitro подтверждается и in vivo на экспериментальных моделях РС. Можно предположить, что результаты дальнейших исследований позволят рассматривать D₁DR и D₂DR как потенциальные дополнительные терапевтические мишени при аутоиммунном нейровоспалении.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках научного проекта №22-75-10119.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов