Биобанкирование в клинических исследованиях с участием пациентов с рассеянным склерозом

Биобанкирование — процесс сбора биологического материала для получения, обработки, хранения и предоставления биологических образцов с ассоциированными данными для использования в текущих исследованиях и в будущем [1]. Впервые термин «биобанк» был предложен S. Loft и соавт. (1996) при описании роли окислительного повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) как фактора риска развития онкологических заболеваний [2, 3].

В России, Великобритании, Франции, Китае, Америке организованы специализированные биобанки, накапливающие образцы опухолей ЦНС, которые можно считать наиболее крупными нозологическими биобанками в области неврологии [4—12]. В изучении рассеянного склероза (РС) биобанкирование также занимает важное место. С привлечением ресурсов Датского биобанка РС в 2016 г. (n=2000) были получены сведения, что сменная работа в молодом возрасте связана с повышенным риском заболевания РС [13]. В биобанке РС Норвегии собираются образцы крови, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и мозговой ткани пациентов с РС и проводятся крупные исследования в области генетики [14—16]. Так как РС является заболеванием с мультифакториальной этиологией, большое значение приобретает изучение разных типов биообразцов как отражения системности протекающих патологических реакций.

Анализ ЦСЖ — основной диагностический метод оценки состояния ЦНС [17]. Забор ЦСЖ должен проводиться в одно и то же время суток. Циркадные ритмы регулируют функцию гемато-энцефалического барьера, секрецию ЦСЖ, а также клиренс бета-амилоидных пептидов и ксенобиотиков [18]. Например, максимальный подъем уровня интерлейкина-6 (IL-6) в СМЖ наблюдается примерно в 19 ч, дофамина — в 10 ч, а его метаболита гомованилиновой кислоты — в 14 ч [19].

Тип и объем пробирок влияют на концентрации биомаркеров ЦСЖ. Лабораторный пластик способен адсорбировать белки ЦСЖ, поэтому рекомендуется использовать полипропиленовые пробирки с низким потенциалом связывания с белками [17]. Использование детергентов (например, полисорбата-20) во всех случаях сбора ЦСЖ нецелесообразно, однако может применяться для специфических маркеров [20]. Была обнаружена корреляция между степенью адсорбции и отношением площади контактной поверхности к объему пробирки [21]. Показано, что малые объемы биоматериала приводили к более высокой скорости адсорбции, что объясняется относительно большей площадью поверхности стенки пробирки, контактирующей с ЦСЖ [21]. Для минимизации адсорбции рекомендуется заполнять пробирки на 75% [17].

Разница в механизмах транспорта и клиренса метаболитов ЦСЖ создает рострокаудальный градиент, который влияет на концентрацию веществ на разных уровнях ликворной системы [22]. Объем ЦСЖ, собранный во время люмбальной пункции, может влиять на концентрацию, так как малые объемы (2 мл) могут представлять состав поясничного дурального мешка, а большие объемы (10 мл), вероятно, отражают свойства ЦСЖ цистерн субарахноидального пространства и желудочков головного мозга [23].

Контаминация ЦСЖ кровью наблюдается в 14—20% случаев и приводит к ложноположительным результатам при поиске ряда маркеров [23]. Так, например, в связи с повышенным гемолизом линейно возрастает уровень нейрон-специфической енолазы (NSE) — биомаркера нейродегенерации, который кроме цитоплазмы нейронов встречается в тромбоцитах и клетках нейроэндокринного происхождения [24]. Чтобы свести к минимуму контаминацию пробы ЦСЖ кровью, рекомендуется удалить первые 2 мл [23]. Таким образом, рекомендуемый объем не менее 10 мл, оптимальный — 12 мл [23].

При анализе ЦСЖ важно учитывать внешние факторы, например, курение. Окислительный стресс в ЦНС, вызванный курением, ведет к повышению уровня F2-изопростанов, которые образуются при перекисном окислении жирных кислот свободными радикалами [25]. Кроме того, показано увеличение объема ЦСЖ после каждого введения этанола у крыс [26].

Образцы ЦСЖ могут храниться при комнатной температуре в течение периода предварительной обработки [27], однако рекомендуемый интервал после сбора для подготовки образцов составляет не более 1—2 ч [28]. Условия центрифугирования зависят от того, требует ли образец сохранения хрупких клеток для выделения генетического материала [27]. При необходимости выделения рибонуклеиновой кислоты (РНК) центрифугирование проводят при относительном центробежном ускорении (ОЦУ) 400 g в течение 10 мин, в других случаях рекомендуется ОЦУ 2000 g в течение 10 мин [27]. Если возможно, то следует для каждого образца проводить подсчет эритроцитов, и образцы с количеством эритроцитов более 500/мкл исключать из последующего аналитического этапа [27]. Для длительного хранения аликвотированные образцы должны быть помещены в морозильную камеру с температурой -80°C [27]. Возможно хранение образцов в жидком азоте в качестве резервного фонда биоресурсной коллекции [27].

Кровь является универсальным биоматериалом для исследований, в том числе у пациентов с РС. I.C. Hasselbalch и соавт. с привлечением ресурсов Danish Multiple Sclerosis Biobank выявили, что нейтрофило-лейкоцитарное соотношение (NLR) является более специфическим биомаркером системного воспаления, чем абсолютное количество клеточных элементов крови по отдельности [29].

Забор крови происходит в вакутейнеры со специальной обработкой в зависимости от задач аналитических этапов [29, 30]. Для транспортировки крови образцы помещаются в термоконтейнеры с хладагентами [27]. В стандартных вакутейнерах при температуре от 2 до 10 °C образцы крови могут хранится не более 24 ч. Для длительного хранения крови и ее компонентов поддерживают температуру от –20 до –150 °C и используют полипропиленовые криопробирки для предовтращения высыхания образцов [30, 31]. При исследовании метаболома крови чрезвычайно важно сохранение высокого качества образцов. В исследовании Tianrong Yeo и соавт. [32] были использованы материалы от 31 пациента с ремиттирующим РС (РРС) и 50 пациентов с вторично-прогрессирующим РС (ВПРС), хранившиеся в биобанке от 1 года до 10 лет, при температуре –80 °C. Было показано, что материалы, хранившиеся в течение ≤5 лет позволяли оценить метаболомный профиль с более высокой точностью, чем образцы, хранившиеся >5 лет [29].

Моча представляет собой богатую метаболитами биожидкость, которая отражает химический и осмотический гомеостаз организма. Время сбора мочи зависит от целей исследования. Например, для анализа гормонов материал собирают в утренние часы, сразу после пробуждения пациента; для цитологического анализа допускается произвольное время сбора [30]. Контейнеры для сбора должны быть стерильными и сухими, иметь широкую горловину с герметично закрывающейся крышкой, объем составляет от 50 мл до 3 л. В ряде случаев контейнеры содержат консерванты: ЭДТА, борную или соляную кислоту, пиросульфит натрия [30].

После этапа сбора образцы мочи должны быть обработаны как можно быстрее. Перед обработкой рекомендуется их охлаждение при 4 °C в течение не более 8 ч. Центрифугирование должно проводиться в охлаждаемой центрифуге при –4 °C при 1500 g в течение 10 мин [33]. Затем надосадочную жидкость аликвотируют и помещают на длительное хранение в морозильную камеру при –80 °C [33]. В работе V. Singh и соавт. оценивались изменения белка в моче у пациенток с РС (n=31) на третьем триместре беременности и в послеродовым периоде. Пробы мочи собирали с 10:00—12:00, после сбора мочу центрифугировали (3000 g), а супернатант хранили при –80°C для последующего протеомного анализа [34].

Образцы кала представляют большой интерес для микробиотического анализа. Сбор может проводиться в емкости со стабилизаторами, что является предпочтительным, так как предотвращает рост бактерий и изменения микробиома, происходящие при комнатной температуре 4 °C. В зависимости от целей исследования материал может подвергаться лиофилизации, при которой образец становится нейтральным по запаху, уменьшается в размере. Для длительного хранения при температуре –80 °C образцы кала подвергаются обработке стабилизаторами (этанол, ЭДТА и коммерческие продукты RNAlater, OMNIgene·GUT и FTA card) [33, 35]. Z. Ling и соавт. изучали изменения фекальной микробиоты у пациентов с РС (n=22) в Китае. В рамках проекта в стерильный пластиковый контейнер собирали 2 г материала, затем в течение 15 мин после сбора образцы транспортировали. Для соблюдения температурного режима на этапе транспортировки использовали пакеты с охлаждающим гелем. Образцы помещали на хранение при –80°C до этапа выделения ДНК, а после экстракции хранили при –20 °C [36].

Для аналитических исследований у пациентов с РС может производиться забор тканей центральной и периферической нервной системы, эпителия желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей и т.д. Наибольший интерес представляют образцы ЦНС. Образцы тканей, подлежащие биобанкированию, можно забирать во время хирургического, эндоскопического вмешательства или патологоанатомического вскрытия. Биоматериал собирается в течение 15—20 мин после резекции, немедленно замораживается во избежание проявления артефактов [37]. Существует протокол обработки аутопсийного материала, который позволяет получать от 66 до 150 аликвот из одной гемисферы головного мозга [38]. В биобанке РС Норвегии собраны аутопсийные образцы тканей ГМ от более, чем 80 пациентов с РС [39]. В Великобритании организован биобанк общества по изучению РС, содержащий более 100 образцов аутопсийных тканей головного и спинного мозга (ГМ и СМ) пациентов с клинически подтвержденным РС [40].

Альтернативой тканевым биобанкам могут выступить виртуальные биобанки с коллекциями изображений, полученных методами визуализации: МРТ, КТ, позитронно-эмиссионная томография и т.д. Высокопольные МРТ (напряженность магнитного поля 7 Тл) позволяют получить детальные графические сведения о поражении нервной ткани, а их сопоставление с клиническими данными позволяет проверять новые научные гипотезы [41].

На преаналитическом этапе работы с аутоптатами ЦНС авторы ряда работ используют идентичные методики [42—44]. B.D. Trapp и соавт. (2019) сравнивали образцы ГМ и СМ у пациентов с типичным течением РС и миелокортикальным (демиелинизация спинного мозга и коры ГМ, но не белого вещества) РС. Процесс сбора материала был проведен согласно протоколу клиники Кливленда. ГМ после вскрытия разделялся исследователями на 2 гемисферы. Одна из гемисфер была нарезана на кусочки толщиной 1 см, которые были быстро зафиксированы в 4% растворе формальдегида на 2—4 дня. Другая гемисфера фиксировалась на более длительный срок (2—4 мес) в 4% растворе формальдегида, затем подвергалась повторному анализу МРТ, и потом нарезалась на кусочки толщиной 1 см. Имеются сведения о фиксации в 4% [44] и в 10% [45] растворе формальдегида длительностью от 2 сут. В дальнейшем образцы обрабатывались парафином, формировались блоки (фиксированные в формалине парафинированные образцы, Formalin-Fixed Paraffin-Embedded), которые нарезались и подвергались гистологическому анализу [46, 47]. S.L. Hauser и соавт. (1986) было проведено исследование аутопсийных материалов головного мозга пациентов с РС (n=16), которое позволило составить карту локализации и типа очагов поражения [48].

Для исследования биомаркеров РС используют и другие типы биологических материалов. Слюна представляет собой жидкость, которую удобно собирать и просто хранить по сравнению с другими типами образцов. H. Mohammad и соавт. [49] исследовали количество основного белка миелина (ОБМ) слюны у пациентов с РРС (n=32) и здоровых женщин (n=29) [49]. Забор производился на голодный желудок, пациентов просили не пить, не курить и не чистить зубы в течение 1 ч перед сбором слюны. Для сбора проб слюны без стимуляции пациенты полоскали рот водой и через 2 мин проглатывали ротовую жидкость, а после выплевывали от 2 до 3 мл оставшейся цельной слюны в градуированную пластиковую пробирку. Сбор слюны продолжался в течение 5 мин, если не было собрано от 2 до 3 мл слюны одномоментно. При сборе со стимуляцией пациентов просили 2 мин пожевать кусочек натуральной нейтральной жевательной резинки. Далее образцы центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин; супернатанты слюны хранили при –80°C.

Большим потенциалом для анализа у пациентов с РС обладает слезная жидкость, рассматриваемая как промежуточный субстрат между ЦСЖ и сывороткой крови. I. Cicalini и соавт. [50] проводили метаболомный и липидомный анализ слезы пациентов с РС (n=12) и здоровых лиц (n=21). Образцы слезной жидкости собирали градуированными полосками Ширмера. После специальной обработки полоску помещали в пробирку Эппендорфа объемом 2,0 мл и хранили при –80°C.

Сбор образцов половых выделений позволяет оценить нарушение функции тазовых органов. При работе с когортой пациентов мужского пола сперма собирается в теплый (20—40 °C), чистый, сухой контейнер с широкой горловиной [30]. В работе M. Safarinejad [51] у пациентов мужского пола с РС (n=68) и здоровых фертильных мужчин (n=48) старше 18 лет оценивали эндокринный профиль, состояние оси гипоталамус-гипофиз-яички и качество спермы. Пациенты предоставляли образцы спермы после периода полового воздержания продолжительностью не менее 2, но не более 5 дней. Общее количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов и процент нормальной морфологии сперматозоидов были ниже у пациентов с РС по сравнению с контрольной группой.

Анализ волос широко используют для оценки уровня токсических веществ, гормонов и в качестве источника ДНК. Анализ уровня кортизола волос является ретроспективной оценкой системного уровня кортизола за несколько месяцев [52]. G.M Pereira и соавт. [53] провели исследование влияния дисфункции оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники на течение РС (n=40). После специальной обработки (табл. 1) образцы волос хранились при температуре 18—25 °C в течение месяца [54].

Таблица 1. Примеры исследований с применением технологий биобанкирования с участием пациентов с РС

На базе областного центра РС и банка биологических материалов ФГБОУ ВО «СибГМУ» (далее — биобанк СибГМУ) начат сбор коллекции биологического материала от пациентов с РРС и ВПРС (18g 65 лет) и условно здоровых добровольцев (18—65 лет). В настоящий момент формируется пул образцов цельной крови и ее компонентов.

Сбор биоматериала от пациентов с РС и добровольцев группы контроля проводится на базе неврологической клиники и центра РС ФГБОУ ВО «СибГМУ» Минздрава России. Участники подписывают информированное согласие на участие в клиническом исследовании, которое предполагает биобанкирование образцов биологического материала. О каждом добровольце, включенном в исследование, собирается подробная клиническая и демографическая информация, данные анамнеза заболевания и ПИТРС.

У добровольцев забирается не более 30 мл цельной венозной крови из локтевой вены утром натощак в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К2ЭДТА (3 пробирки по 4 мл) и активатором свертывания (2 пробирки по 9 мл) [65]. После забора биоматериал доставляется в течение 3 ч в биобанк СибГМУ. При необходимости биоматериал помещается в холодильник для временного хранения при температуре 2—8 °C. Транспортировка образцов биоматериала осуществляется в термоконтейнере с хладоэлементами при температуре не выше 4 °C.

На базе биобанка СибГМУ выполняется процессинг биоматериала. Из цельной крови методом центрифугирования производится получение сыворотки (10 мин при 2000 g) и плазмы крови, эритроцитарной массы (15 мин при 2000 g). Полученные биообразцы аликвотируют в криопробирки (по 1,0 мл). Аликвоты маркируют линейными штрих-кодами, в которых зашифрованы номер исследования, код пациента, номер визита, код биоматериала. Сведения о биообразцах и ассоциированной с ними информации также заносят в электронную базу данных Samples. Подготовленные криопробирки с аликвотами помещаются в криобоксы, которые маркирируются с указанием номера исследования, номера криобокса. Криобоксы помещаются на длительное хранение в ультранизкотемпературные морозильники и хранятся при температуре не выше –80 °C. Характеристика и описание собираемых биообразцов производится согласно международным Рекомендациям BRISQ [66].

Создание нозологических биобанков дает исследователям возможность сосредоточиться на микроструктурных проявлениях заболеваний, изучить новые патологические звенья. Применение биобанкирования в области исследования маркеров РС показывает, что несмотря на то, что биобанкирование в современном представлении существует и развивается уже более 20 лет, освещение сотрудничества с биобанками в исследованиях ограничено [2]. Существует большое количество работ, в которых используются такие биоматериалы как кровь и ее компоненты, моча, ЦСЖ. В меньшей степени востребованы, но также находят свое применение образцы слюны, фекалий, волос, слезной жидкости.

Количество биобанков в России увеличивается с каждым годом, чему способствовало создание Национальной ассоциации биобанков и специалистов по биобанкированию (НАСБИО), единого глоссария биобанков, разработка государственных программ поддержки [1]. Существует ряд исследований, опирающихся именно на российские биобанки [67—69]. В России проводятся крупные научные проекты по изучению РС, в клинической практике применяются современные методы диагностики и лечения [70—73]. На базе национальных центров (Московского и Петербургского центров РС) аннотированные и структурированные коллекции биологического материала от пациентов с РС используются для проведения генетических исследований (микроРНК, ДНК и митохондриальная ДНК), оценки иммунологической активности клеток, функционирования гематоэнцефалического барьера, микробиотического состава биологических жидкостей [59—61,74—77]. Для дальнейшего развития данной отрасли клинической и фундаментальной медицины перспективным направлением развития может стать интеграция национальных биобанков с нозологическими реестрами, в том числе с реестром РС [78].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.