Влияние флуоксетина на нейроиммунное взаимодействие при рассеянном склерозе

Рассеянный склероз (РС) — аутоиммунно-воспалительное и нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), поражающее преимущественно лиц молодого возраста [1].

В основе патогенеза РС лежит связанное с нейровоспалением демиелинизирующее и нейродегенеративное поражение ЦНС, которое при отсутствии терапии часто приводит к инвалидизации больных РС [2]. Согласно современным представлениям, нейровоспаление при РС является многофакторным и связано как с миграцией иммунных клеток с периферии в ЦНС через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), так и с активацией резидентных иммунных клеток ЦНС — микроглии [2, 3]. Наряду с установленной ролью в патогенезе РС клеток адаптивного иммунного ответа (T- и B-лимфоцитов), также показано важное значение клеток врожденного иммунного ответа, в частности мононуклеарных фагоцитов, включающих моноциты, дендритные клетки, макрофаги (МФ), а также клетки микроглии [3]. При экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (экспериментальная модель РС — ЭАЭ) и РС моноциты мигрируют в ЦНС, где дифференцируются в макрофаги, способные продуцировать цитокины, презентировать антигены и направлять развитие иммунного ответа по провоспалительному Th17- и Th1-зависимому пути. Важно, что эти функции также выполняются и микроглиальными клетками в ЦНС [3, 4].

Установлено, что при ЭАЭ и РС макрофаги обнаруживаются в хронических и острых очагах демиелинизации в значительно большем количестве, чем T- и B-лимфоциты вместе взятые. При этом обнаруживаемые макрофаги в очагах демиелинизации представлены как «периферическими» макрофагами, так и клетками микроглии, соотношение которых может меняться в зависимости от стадии заболевания [5]. Так, при ЭАЭ было показано, что клетки микроглии могут иметь ключевое значение в индукции аутоиммунного воспаления, тогда как моноциты/МФ, мигрирующие с периферии в ЦНС, опосредуют эффекторную фазу заболевания [3]. Таким образом, МФ имеют важное значение в патогенезе РС, тогда как модуляция их функций, особенно в ЦНС, является приоритетной задачей для препаратов патогенетического лечения РС [3].

В то же время важно отметить, что большинство препаратов, изменяющих течение РС (ПИТРС), реализует свой эффект, главным образом, на периферии, не оказывая непосредственного влияния на воспаление в ЦНС [6]. В связи с этим поиск дополнительных механизмов иммуномодуляции в ЦНС является актуальным.

Флуоксетин — селективный ингибитор обратного захвата серотонина (СИОЗС), который является одним из наиболее часто назначаемых препаратов симптоматической терапии депрессии при РС и способен проникать в ЦНС [7]. Недавние исследования показали, что флуоксетин также обладает иммуномодулирующим эффектом и может оказывать влияние на течение ЭАЭ и РС путем модуляции функций клеток как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа, позволяя предположить его эффективность в качестве патогенетической терапии РС [8]. В то же время влияние флуоксетина на функции МФ, а именно на их способность модулировать функции Th17- и Th1-клеток, практически не изучено. В коротком сообщении представлены результаты исследования влияния флуоксетина на функции Th17- и Th1-клеток, а также на индуцированный МФ Th17- и Th1-иммунный ответ при РС.

Цель исследования — изучить влияние флуоксетина на патогенетически значимый при РС Th17- и Th1-иммунный ответ.

Пациенты. Проведено комплексное клиническое и иммунологическое обследование 10 больных (6 женщин и 4 мужчины) в возрасте от 20 до 30 лет с диагнозом «ремиттирующий РС» по критериям МакДональда в модификации 2017 г. [9]. Длительность заболевания на момент включения в исследование составляла от 2 до 10 лет. Все больные получали терапию препаратом глатирамера ацетат более 9 мес. Все пациенты находились в стадии клинической ремиссии (более 6 мес). Всем пациентам проводился стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале Expanded Disability Status Scale (EDSS) [10]. На момент забора крови все исследуемые больные более 6 мес не получали лечения кортикостероидами или антидепрессантами. Контрольную группу составили 10 условно здоровых доноров (6 женщин и 4 мужчины). Группы были сопоставимы по полу и возрасту. Клинико-демографическая характеристика больных РС и группы здоровых доноров представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-демографическая характеристика групп

Примечание. Здесь и в табл. 2—4: не выявлено достоверного отличия между группами (Манна—Уитни U-тест); представлено значение медианы (25-й; 75-й процентили).

Все больные подписали информированное согласие на участие в данном исследовании. Проведение исследования было одобрено Этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова (протокол №209).

Выделение и культивирование CD4⁺T-клеток. Для определения функциональной активности Th17- и Th1-клеток из венозной крови (взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с гепарином) выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (МНКПК) путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина («ПанЭко», Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH7,3) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 («ПанЭко») с добавлением 2 mM L-глутамина (ПанЭко) и 2% донорской AB сыворотки («PAA», Австрия). Затем из части образцов МНКПК методом иммуномагнитной сепарации (негативная селекция, «Miltenyi Biotec», Германия) выделяли CD4⁺ T-клетки. Согласно данным многоцветной проточной цитометрии, чистота выделения CD4⁺ T-клеток составляла >95%. Затем образцы CD4⁺ T-клеток в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку вносили в 96-луночный круглодонный планшет («SPL», Республика Корея) и стимулировали микрочастицами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28-антителами («Life Technologies», Норвегия). Далее CD4⁺ T-клетки культивировали 72 ч в CO₂-инкубаторе, после чего отбирали супернатант и замораживали при –70 °C [11]. Для оценки влияния флуоксетина на продукцию цитокинов образцы CD4⁺ T-клеток преинкубировали в присутствии флуоксетина («Tocris», Швейцария) в конечных концентрациях 10^–5 и 10^–6 М [12].

Получение и культивирование МФ. Для получения МФ из МНКПК путем магнитной сортировки клеток выделяли CD14⁺-моноциты (негативная селекция, «Miltenyi Biotec»). Согласно данным многоцветной проточной цитометрии, чистота выделения CD14⁺-моноцитов составляла >95%. Далее моноциты культивировали с рекомбинантным человеческим гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (40 нг/мл, «Miltenyi Biotec») в течение 6 сут, получая МФ [13].

Для анализа продукции цитокинов МФ высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты по 40 000 клеток на 200 мкл среды на лунку (SPL Life Sciences). Затем в течение 2 ч клетки преинкубировали с 1000 МЕ/мл интерферона-γ (ИФН-γ) («Becton Dickinson», США) при +37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего вносили липополисахарид (ЛПС) в конечной концентрации 100 нг/мл [14]. В отрицательный контроль вместо ИФН-γ и ЛПС вносили эквивалентный объем культуральной среды. Далее планшеты инкубировали при +37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 ч. С целью активации NLRP3-инфламмасомы и индукции выработки интерлейкина (ИЛ)-1β за 30 мин до окончания инкубации в МФ вносили аденозинтрифосфат в конечной концентрации 5 mM («Sigma», A9187, США) [15]. По окончании инкубации от культуры клеток отбирали супернатант и замораживали при –70 °C. Для оценки влияния флуоксетина на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-1β образцы МФ стимулировали по вышеописанной схеме, но с предварительной инкубацией в присутствии флуоксетина (Tocris) в конечных концентрациях 10^–5 и 10^–6 М в течение 1 ч перед внесением ИФН-γ [16].

Ко-культивирование МФ и CD4⁺Т-клеток. Для оценки способности МФ индуцировать продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками, проводилось совместное культивирование в 96-луночном круглодонном планшете (SPL Life Sciences) МФ и аутологичных CD4⁺ T-клеток. Для этого макрофаги (в количестве 4·10⁴ на лунку) вносили в круглодонный 96-луночный планшет и инкубировали 2 ч с ИФН-γ (1000 МЕ/мл). Далее МФ отмывали и стимулировали ЛПС в течение 4 ч, после чего в культуру МФ вносили аутологичные CD4⁺ T-клетки (в количестве 8·10⁴ на лунку) и стафилококковый энтеротоксин B (SEB) (100 пг/мл, «Sigma») и инкубировали 72 ч, после чего отбирали супернатант и замораживали при –70 °C. В качестве положительного контроля CD4⁺ T-клетки стимулировали микрочастицами, покрытыми анти-CD3/анти-CD28-антителами (без МФ). В качестве отрицательного контроля в CD4⁺ T-клетки вместо макрофагов и SEB вносили эквивалентный объем культуральной среды. Для оценки влияния флуоксетина на способность макрофагов индуцировать продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками образцы макрофагов преинкубировали в присутствии флуоксетина в конечной концентрации 10^–5 и 10^–6 М, после чего стимулировали и проводили ко-культивирование с CD4⁺ T-клетками по вышеописанной схеме.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Уровни спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-1β, -6, -17 и ИФН-γ в супернатантах клеточной культуры определяли методом ИФА. Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы фирмы «Invitrogen» (США). Уровни аналитов выражали в пг/мл или процентах по отношению к стимулированной продукции цитокинов в отсутствие флуоксетина.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы GraphPad Prizm 6. Для оценки различий двух групп использовали непараметрический U-критерий Манна—Уитни или знаковый ранговый критерий Уилкоксона. Статистически значимыми различия считали при p<0,05.

Согласно данным ИФА, продукция ИЛ-17 и ИФН-γ как нестимулированными, так и анти-CD3/CD28-стимулированными CD4⁺ T-клетками была сопоставима между группами (табл. 2). Внесение флуоксетина оказывало достоверный ингибирующий и дозозависимый эффект на продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ стимулированными CD4⁺ T-клетками в обеих группах. При этом в конечной концентрации 10^–5 М флуоксетин существенно снижал клеточную пролиферацию согласно данным реакции бластной трансформации лимфоцитов, а также жизнеспособность клеток (МТТ-тест) в обеих группах (данные не представлены). В конечной концентрации 10^–6 М флуоксетин также подавлял продукцию цитокинов CD4⁺ T-клеток в обеих группах (рис. 1), не оказывая при этом влияния на клеточную пролиферацию или жизнеспособность (данные не представлены).

Таблица 2. Продукция ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками в группах

Рис. 1. Влияние флуоксетина на продукцию цитокинов CD4⁺ T-клетками больных РС и здоровых доноров invitro.

CD4⁺ T-клетки (в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку), полученные от больных РС или здоровых доноров, были активированы магнитными микрочастицами, покрытыми анти-CD3 и анти-CD28 антителами, в присутствии/отсутствии флуоксетина (10^–6 М). После 72-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-17 (а) и ИФН-γ (б) методом ИФА. Данные представлены в виде медианы, 25-го и 75-процентилей, символы обозначают значения, полученные от каждого больного РС или здорового донора.

Продукция ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками, стимулированными ЛПС-активированными МФ, была сопоставима между группами (табл. 3). Преинкубация МФ с флуоксетином в конечной концентрации 10^–5 М оказывала ингибирующий эффект на способность МФ индуцировать выработку ИЛ-17 и ИФН-γ аутологичными CD4⁺ T-клетками в обеих группах (рис. 2), не оказывая влияния на жизнеспособность МФ. В конечной концентрации 10^–6 М флуоксетин не влиял на способность макрофагов индуцировать выработку цитокинов CD4⁺ T-клетками (данные не представлены).

Таблица 3. Продукция ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками, стимулированными МФ больных РС и здоровых доноров

Рис. 2. Влияние флуоксетина на индуцируемый МФ больных РС и здоровых доноров Th17- и Th1-иммунный ответ.

МФ (в количестве 4·10⁴ в 150 мкл на лунку) больных РС или здоровых доноров были преинкубированы в присутствии/отсутствии флуоксетина (10^–5 М) и активированы ЛПС в течение 4 ч, после чего вносили аутологичные CD4⁺ T-клетки (в количестве 1·10⁵ в 50 мкл на лунку) и добавляли стафилококковый энтеротоксин B (SEB) в качестве антигена. После 72-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-17 (а и б) и ИФН-γ (в и г) методом ИФА.

Продукция цитокинов, необходимых для дифференцирования Th17-клеток ИЛ-6 и ИЛ-1β ЛПС-стимулированными МФ, также не различалась между группами (табл. 4). Флуоксетин подавлял продукцию ИЛ-6 и ИЛ-1β в конечной концентрации 10^–5 М (рис. 3), тогда как в концентрации 10^—6 М не оказывал какого-либо влияния на продукцию цитокинов МФ (данные не представлены).

Таблица 4. Продукция ИЛ-6 и ИЛ-1β макрофагами больных РС и здоровых доноров

Рис. 3. Влияние флуоксетина на продукцию цитокинов МФ больных РС и здоровых доноров.

МФ (в количестве 4·10⁴ в 200 мкл на лунку), полученные из моноцитов больных РС или здоровых доноров, были активированы ЛПС в присутствии/отсутствии флуоксетина (10^–5 М). После 24-часовой инкубации в CO₂-инкубаторе в супернатантах клеточной культуры определяли уровни спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-6 (а) и ИЛ-1β (б) методом ИФА.

Исследование психонейроиммунного взаимодействия является одним из наиболее развивающихся направлений в изучении патогенеза РС. Широко известно, что распространенность психоэмоциональных нарушений (в частности, депрессии) при РС существенно выше, чем в популяции в целом [17]. При этом возможно не только влияние РС на развитие депрессии, но и влияние депрессии на течение РС, что может объясняться общими патогенетическими механизмами этих заболеваний [17, 18]. В связи с этим вполне возможно предположить, что лечение депрессии может оказывать положительный эффект и на течение РС [8]. В настоящем исследовании было установлено, что СИОЗС флуоксетин оказывает ингибирующий эффект на Th17- и Th1-клетки, которые играют значимую роль в развитии нейровоспаления как при РС, так и при депрессии [18]. Важно, что ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ CD4⁺ T-клетками не сопровождался влиянием на клеточную пролиферацию. Также стоит отметить, что используемая концентрация флуоксетина (10^–6 М) может достигаться in vivo. Было показано, что уровень флуоксетина в плазме крови у пациентов, получающих флуоксетин в дозе 20—80 мг/сут, эквивалентен концентрации от 0,2 до 3 µМ [19]. Ингибирующий эффект флуоксетина (10^–5 и 10^–6 М) на продукцию ИФН-γ ранее уже был описан [20, 21]. В то же время о влиянии флуоксетина на Th17-иммунный ответ практически нет данных.

Также было обнаружено влияние флуоксетина на способность МФ индуцировать Th17- и Th1-иммунный ответ. В частности, был установлен ингибирующий эффект флуоксетина на продукцию МФ цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1β, которые необходимы для дифференцирования Th17-клеток и также играют важную роль в патогенезе нейровоспаления при РС [22—24]. Кроме того, флуоксетин снижал способность ЛПС-стимулированных МФ индуцировать продукцию ИЛ-17 и ИФН-γ аутологичными CD4⁺ T-клетками. Таким образом, было установлено, что флуоксетин способен оказывать прямое влияние как на Th17- и Th1-клетки, так и на индуцируемый МФ Th17- и Th1-иммунный ответ, что показано впервые.

Противовоспалительный эффект флуоксетина in vitro согласуется с данным in vivo. Было показано, что флуоксетин может оказывать как профилактический, так и лечебный эффект при ЭАЭ. Схожий клинический эффект при ЭАЭ описан и для другого препарата группы СИОЗС — сертралина [25]. Также несколько исследований продемонстрировали положительное влияние терапии флуоксетином на течение РС, указывая на его возможный потенциал в качестве добавочной терапии к препаратам патогенетического лечения РС первой линии [25, 26].

В целом полученные предварительные результаты указывают на то, что флуоксетин обладает противовоспалительным эффектом при РС, который может быть опосредован ингибирующим влиянием на аутоагрессивный Th17- и Th1-иммунный ответ. Уточнение рецепторов, а также молекулярных механизмов, опосредующих влияние флуоксетина на функции иммунных клеток, позволит определить направления дальнейшей работы по возможному практическому применению флуоксетина и/или других СИОЗС в качестве патогенетического лечения РС.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта №21-315-70014.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare there is no conflict of interest.