Рассеянный склероз (РС) — хроническое воспалительное и нейродегенеративное заболевание, сопровождающееся демиелинизацией нейронов в центральной нервной системе (ЦНС), которое поражает преимущественно молодых людей. Более чем в 85% случаев у больных наблюдается ремиттирующий РС (РРС), при котором периоды обострения, характеризующиеся нарастанием неврологического дефицита продолжительностью не менее 24 ч, сменяются периодами ремиссии со снижением или полным исчезновением неврологической симптоматики [1].
Обострения РРС сопровождаются острым воспалительным процессом в ЦНС и могут быть связаны как с возникновением новых очагов демиелинизации, так и с реактивацией ранее существовавших демиелинизирующих поражений, которые могут быть локализованы в любой области ЦНС [2].
Несмотря на то что точное время начала обострения у больного РРС пока невозможно спрогнозировать, некоторые демографические и внешние факторы, такие как стресс, курение, инфекционные заболевания, уровень витамина D, могут быть факторами риска возникновения обострения [3]. Действие внешних факторов при этом может опосредоваться эпигенетическими механизмами регуляции экспрессии генов, в первую очередь метилированием ДНК [4]. Метилирование ДНК в подавляющем большинстве случаев происходит в положении C5 остатка цитозина в составе CpG-динуклеотидов (CpG-сайтов) и приводит к достаточно устойчивым изменениям экспрессии близлежащих генов. Основными методическими подходами при анализе метилирования ДНК стали анализ дифференциального метилирования отдельных генов-кандидатов и полногеномный анализ метилирования с применением ДНК-микрочипов высокой плотности или высокопроизводительного секвенирования.
К настоящему времени с использованием полногеномных методов анализа удалось выявить паттерны дифференциального метилирования ДНК из различных фракций крови, характеризующие больных различными формами РС при сравнении со здоровыми донорами [5]. Однако анализ метилирования ДНК больных РРС в ремиссии и обострении был проведен только в трех исследованиях, причем во всех случаях изучали отдельные гены-кандидаты. В ДНК из цельной крови больных РРС при обострении и ремиссии не выявлено различий между уровнями метилирования генов RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDNK2A, IGF2, SOCS1, CRABP1, CACNA1G [6]. В то же время в свободно циркулирующей ДНК (circulating-free DNA) сыворотки крови больных РРС при обострении обнаружено гипометилирование гена MOG, кодирующего один из белков миелиновой оболочки [7], а анализ панели из 56 различных генов позволил идентифицировать различия в уровнях их метилирования, достаточные, чтобы отличать больных РРС в обострении от больных в ремиссии с чувствительностью и специфичностью, превышающими 70% [8].
В настоящей работе мы впервые применили полногеномный анализ с использованием ДНК-микрочипов высокой плотности для изучения профилей метилирования ДНК мононуклеарных клеток крови (МНК) больных РРС в стадиях ремиссии и обострения.
Цель исследования — изучение полногеномных профилей метилирования ДНК МНК больных РРС в стадиях ремиссии и обострения с целью оценить вклад этого эпигенетического механизма регуляции экспрессии генов в активность патологического процесса.
Материал и методы
Характеристика больных РС. В исследование включены 14 больных РРС, диагноз которым был поставлен в соответствии с критериями МакДональда 2017 г. [9]. Восемь больных РРС были в стадии ремиссии (возраст 37,9±6,6 года, 6 женщин), 6 — в стадии обострения (возраст 34,7±7,8 года, 3 женщины).
Средний балл пациентов по расширенной шкале инвалидизации (Expanded Disability Status Scale, EDSS) у больных РРС в стадии ремиссии составил 1,75±0,50, в стадии обострения — 3,17±0,67. До начала исследования больные не получали иммуномодулирующей терапии. Образцы периферической крови больных в стадии обострения собирали через 24—36 ч после начала обострения, не связанного с инфекцией, и до первого введения кортикостероидов, а больных в стадии ремиссии — в клинически стабильной фазе, не менее чем через 6 мес после купирования обострения.
Все пациенты были этническими русскими по данным анкетирования и подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено локальным Этическим комитетом ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Выделение ДНК и анализ метилирования. Периферическую кровь больных РРС отбирали в пробирки с EDTA в качестве антикоагулянта; МНК получали центрифугированием на градиенте Фиколл-1077 Диаколл («Диаэм», Россия). Геномную ДНК из МНК выделяли с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen», Германия), а затем подвергали бисульфильтной конверсии, используя набор EZ DNA Methylation-Gold Kit («Zymo Research», США). Анализ уровней метилирования ДНК был проведен с использованием ДНК-микрочипов Infinium HumanMethylation450 BeadChip («Illumina», США). Локализацию индивидуального CpG-сайта в CpG-островках (island) определяли с использованием стандартной аннотации Illumina; соседние с CpG-островками области (shore) локализованы в 2000 пар нуклеотидов от них; более отдаленные области (shelf) — в 2000 пар нуклеотидов от соседних областей (shore); области, не относящиеся к упомянутым трем категориям, обозначены как «opensea».
Анализ данных. Анализ данных метилирования проводили с применением специализированного пакета ChAMP v. 3.14 [10] для среды программирования R. Уровень метилирования конкретного CpG-сайта выражали в виде показателя β, который варьировал в пределах от 0 (неметилированные пробы) до 1 (полностью метилированные пробы). CpG-сайт рассматривали как дифференциально метилированную позицию (ДМП), если для него в сравниваемых группах |Δβ| был >0,1 (т.е. уровень метилирования отличался более чем на 10%), а соответствующая величина p была <0,01.
Для визуализации данных использовали пакеты gplots v. 3.1.1, ggplot2 v. 3.3.5 и стандартные средства среды R.
Результаты
Для анализа вовлечения эпигенетического механизма метилирования ДНК в развитие обострения у больных РРС мы провели профилирование паттернов метилирования более 450 000 CpG-сайтов генома МНК в группах больных в стадии обострения и ремиссии. Первичную фильтрацию и контроль качества прошел 412 481 CpG-сайт.
Сравнение уровней метилирования CpG-сайтов в этих группах позволило выявить 7 ДМП. Несмотря на малое количество ДМП, при иерархической кластеризации образцов ДНК на картах интенсивности сигналов ДМП (см. рисунок) наблюдается четкое разделение больных РРС в стадиях обострения и ремиссии на обособленные кластеры.
Карта интенсивности сигналов ДМП генома МНК у больных РРС в стадиях обострения и ремиссии.
Градиент серого от темного к светлому отражает повышение уровня метилирования ДНК в исследуемых образцах. Дендрограмма сверху показывает иерархическую кластеризацию образцов: серый цвет обозначает больных РРС в стадии обострения, белый — в стадии ремиссии.
Характеристика выявленных ДМП представлена в таблице. При обострении РРС 3 из них гиперметилированы (cg02981003, cg18486102, cg19533582), а 4 — гипометилированы (cg16814680, cg1964802, cg18584440, cg08291996). Пять ДМП расположены в белок-кодирующих генах (GPR123, FAIM2, BTNL2, ZNF8, ASAP2), 1 — в гене микроРНК (MIR548N) и 1— в межгенной области. Для всех выявленных ДМП наблюдали изменение уровня метилирования ДНК более чем на 20% (диапазон 20,2—57,5%).
Характеристика ДМП
| Идентификационный номер ДМП | Хромосомные координаты ДМП | Ген | p | Δβ | Локализация ДМП по отношению к структурным элементам генов | Локализация ДМП по отношению к CpG-островкам |
| cg02981003 | chr10:134917911 | ADGRA1 | 5,69E-05 | 0,36 | Gene body | shore |
| cg16814680 | chr8:91681699 | — | 6,48E-05 | –0,55 | IGR | opensea |
| cg19648023 | chr2:179275173 | MIR548N | 0,0010 | –0,29 | Gene body | shelf |
| cg18486102 | chr12:50297777 | FAIM2 | 0,0014 | 0,27 | TSS200 | CpG-island |
| cg18584440 | chr6:32370815 | BTNL2 | 0,0019 | –0,26 | Gene body | opensea |
| cg08291996 | chr19:58791159 | ZNF8 | 0,0033 | –0,20 | Gene body | shore |
| cg19533582 | chr2:9463422 | ASAP2 | 0,0067 | 0,58 | Gene body | shelf |
Примечание. Δβ — различие в средних уровнях метилирования в исследуемых группах. IGR — intergenic region (межгенная область); Gene body — тело гена; TSS200 (transcription start site 200) — промоторная область гена в диапазоне от 0 до 200 оснований от места транскрипции первого нуклеотида ДНК в РНК.
Все ДМП, за исключением cg16814680, локализованы в области генов: или в теле генов, или в их промоторных областях в пределах 200 нуклеотидов от точки начала транскрипции. Пять из этих 6 ДМП расположены в CpG-островках (island) или в близлежащих областях (shore и shelf), в пределах 4000 пар нуклеотидов от них. В совокупности эти данные указывают на функциональное значение выявленного профиля метилирования для большинства ДМП. Как продемонстрировано в таблице, ДМП cg16814680 не только локализован в межгенной области, но и расположен вдали от CpG-островков, в области opensea.
Обсуждение
Исследования последнего десятилетия показали, что метилирование ДНК как эпигенетический механизм регуляции экспрессии генов участвует в развитии РС [5], профили метилирования ДНК в клетках крови отличаются при двух основных формах РС: РРС и первично-прогрессирующем РС [11, 12].
В настоящем исследовании мы впервые обнаружили различия в профилях метилирования ДНК в МНК больных РРС в стадиях ремиссии и обострения, причем уровни метилирования всех выявленных ДМП изменяются более чем на 20%. Хотя количество выявленных ДМП невелико, различия в метилировании отдельных позиций позволяют уверенно дискриминировать эти две группы (см. рисунок). Один из обнаруженных ДМП, cg16814680, локализован вдали от CpG-островков, в области opensea, за пределами известных генов, и причина наблюдаемых изменений его метилирования при обострении и ремиссии РРС неясна. Остальные 6 ДМП расположены в генах ADGRA1, FAIM2, BTNL2, ZNF8, ASAP2 и MIR548N. Эти гены не относятся к числу хорошо изученных, данных об их непосредственном участии в развитии РС мы в литературе не обнаружили. Ниже приведена имеющаяся информация о функциях этих генов в норме и при патологии, которая может представлять определенный интерес для интерпретации полученных нами результатов.
Ген ADGRA1 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor A1) кодирует один из членов семейства адгезионных рецепторов, сопряженных с G-белками [13]. Исследования последних лет на мышиных моделях показали, что белок Adgra1 преимущественно присутствует в ЦНС, что указывает на его роль в передаче нервных сигналов [14, 15]. В то же время в полногеномном исследовании наблюдали ассоциацию ADGRA1 с изменением статуса преддиабета [16], что может указывать на его участие в регуляции аутоиммунных процессов.
Ген FAIM2 (Fas Apoptotic Inhibitory Molecule 2) кодирует антиапоптотический белок FAIM2, который защищает клетки от Fas-индуцированного апоптоза за счет прямого взаимодействия с рецептором Fas, препятствуя активации каспазы-8, а также за счет модуляции высвобождения кальция из эндоплазматического ретикулума; кроме того, он участвует в некоторых других независимых от апоптоза процессах, таких как рост аксонов, дифференцировка нейронов и нейропластичность [17]. Несколько исследований указывают на роль FAIM2 при заболеваниях нервной системы, таких как ишемия, бактериальный менингит и нейробластома [17—19], и при аутоиммунных заболеваниях [20].
Ген BTNL2 (Butyrophilin Like 2) расположен в области главного локуса гистосовместимости и кодирует трансмембранный белок, принадлежащий к семейству B7 бутирофилиноподобных иммунорегуляторов. Показано, что он участвует в иммунном надзоре, выступая в качестве отрицательного регулятора T-клеток, уменьшая пролиферацию T-клеток и высвобождение цитокинов [21].
Кодируемый геном ZNF8 (Zinc Finger Protein 8) транскрипционный репрессор негативно регулирует сигнальный путь TGF-бета/BMP in vivo посредством взаимодействия с белками SMAD [22]. Ранее описано участие в патогенезе РС цитокинов TGF-бета/BMP, важных для функционирования иммунных клеток [23], поэтому можно предположить, что опосредованная ZNF8 регуляция этих цитокинов играет роль в клиническом течении РС.
Кодируемый геном ASAP2 (ArfGAP With SH3 Domain, Ankyrin Repeat And PH Domain 2) белок функционирует как активатор ГТФазы ARF и контролирует ARF-опосредованное отпочкование везикул при везикулярном транспорте [24]. Этот белок участвует в регуляции поведения актинового цитоскелета клетки, контролируя такие клеточные процессы, как адгезия и миграция клеток [25]. Среди связанных с ним путей — путь рецептора витамина D [26], важного внешнего фактора развития РС.
Интерес представляет ген MIR548N, кодирующий микроРНК miR-548n. По данным базы MirTarBase, использование полногеномных методов позволило описать для miR-548n около 250 генов-мишеней. Многие из них являются транскрипционными факторами, которые регулируют самые разнообразные биологические процессы в клетке, поэтому пока невозможно даже предположить, в чем состоит конкретная роль этой микроРНК в развитии обострения РС.
Установленный нами факт дифференциального метилирования каждого из описанных выше генов в сочетании с данными литературы об их участии в функционировании нервной и иммунной систем и/или регуляции транскрипции позволяет предполагать, что их продукты могут быть вовлечены в развитие нейровоспаления и нейродегенерации. Однако конкретная роль каждого из этих ДМП-содержащих генов в развитии обострения/ремиссии РРС остается неясной.
В целом мы впервые показали, что при развитии обострения РРС происходят изменения в метилировании ДНК, позволяющие дифференцировать стадии активности патологического процесса при РРС, что может свидетельствовать об участии этого эпигенетического механизма в клиническом течении РРС. Однако анализ проводили в МНК — гетерогенной популяции клеток крови, и для более точного понимания роли метилирования ДНК при РРС необходимы дальнейшие исследования отдельных клеточных субпопуляций.
Исследование выполнено в рамках Государственного задания ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России №121040600400-8.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.