Рассеянный склероз в Республике Башкортостан: популяционно-специфические генетические предикторы и результаты 20-летнего клинического наблюдения

Рассеянный склероз (РС) представляет собой сложное заболевание, которое возникает у генетически предрасположенных лиц, подверженных влиянию факторов окружающей среды, провоцирующих развитие заболевания. Глобальная распространенность РС в 2020 г. увеличилась до 2,8 млн (35,9 на 100 000 человек) [1]. Распространенность заболевания и клинические особенности значительно различаются в разных популяциях. Наиболее высокая распространенность отмечается в западных странах (>300 на 100 000 населения в Германии и Сан-Марино, >200 в США, Дании, Канаде, Финляндии, Швеции, Исландии, Италии). Самая низкая распространенность наблюдалась (исключая страны с низкими показателями достоверности источников) на Африканском континенте (<1 на 100 000 в Нигере, Замбии, Судане, Кении), в Центральной и Южной Америке (1 в Никарагуа, 4 в Эквадоре) и в Азии (2 в Таиланде, 3 в Китае и Малайзии, 4 в Японии) [1].

Существование этногеографических паттернов предрасположенности к РС подтверждается данными генетических исследований, о чем свидетельствуют популяционно-специфические генетические маркеры, обнаруженные в полногеномных ассоциативных исследованиях (GWAS) [2—5]. Истинную генетическую структуру РС в разных популяциях мира трудно оценить из-за того, что подавляющее большинство GWAS проводится в европейских популяциях, и к настоящему моменту не получено подтверждения выявленных ассоциаций в популяциях неевропейского происхождения. Кроме того, комплексный характер заболевания предполагает, что на предрасположенность к РС влияет взаимодействие множества аллельных вариантов, совокупный эффект которых может отличаться от действия каждого из них в отдельности [6]. Взаимодействия между большим количеством локусов предрасположенности к РС, обнаруженных в результате проведения GWAS, и паттерны неравновесия по сцеплению, специфичные для каждой популяции, еще больше усложняют интерпретацию результатов GWAS.

Популяции Волго-Уральского региона России являются перспективным объектом для генетических исследований из-за уникального сочетания европейских и азиатских влияний. Население Республики Башкортостан характеризуется мультиэтническим составом вследствие расположения на перекрестке миграционных потоков между Европой и Азией в Волго-Уральском регионе. Население Республики в большинстве представлено русскими (37%), башкирами (30,3%), проживающими преимущественно в южном и восточном районах, и татарами (24,6%), проживающими в основном в западном, северном и центральном районах. Башкиры и татары относятся к тюркской языковой семье, русские — к славянской группе индоевропейской языковой семьи. Распространенность РС в России составляет 40—60 на 100 000, в Республике Башкортостан — 47,9 на 100 000 [7, 8]. Распространенность РС среди татар почти в 1,7 раза выше, чем среди русских (p<0,05), и в 3 раза выше, чем среди башкир, что подтверждает этногеографические закономерности восприимчивости к заболеванию [9].

Цель исследования — выявление комплексных генетических предикторов РС с использованием ранее установленных GWAS-маркеров заболевания в популяции больных РС и здоровых лиц Республики Башкортостан (Российская Федерация) при помощи полигенного подхода.

Группа исследования. Группу больных РС составили лица, состоящие на учете в Республиканском центре рассеянного склероза (РЦРС), содержащем данные о 1145 пациентах с РС. В исследование был включен 641 человек (97 башкир, 282 русских, 262 татарина; 427 женщин, средний возраст 40,04±9,6 года; 214 мужчин, средний возраст 41,28±10,69 года). Из них 247 пациентов с РС (26 башкир, 123 русских, 98 татар) были включены в 20-летнее клиническое наблюдение. Диагноз РС устанавливался в соответствии с критериями McDonald (2010). Контрольную группу составили 1407 здоровых лиц (228 башкир, 490 русских, 689 татар; 708 женщин, средний возраст 38,08±11,06 года; 699 мужчин, средний возраст 37,48±10,71 года) без нейродегенеративных и других хронических заболеваний.

Критерии включения пациентов с РС: достоверный диагноз РС по критериям McDonald (2010); продолжительность заболевания не менее 1 года.

Критерии включения в группу контроля: отсутствие нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний (в том числе у родственников по данным семейного анамнеза); возраст от 18 до 65 лет.

Критерии исключения: отказ от участия в исследовании.

Этническое происхождение устанавливали при помощи опросника, содержащего вопросы об этнической принадлежности и месте рождения предков в трех поколениях. Все лица, включенные в исследование (общая группа: n=2048 человек), постоянно проживали в Республике Башкортостан и принадлежали к башкирской (n=325), русской (n=772) или татарской (n=951) национальностям. Лица смешанного происхождения не включались в генетический анализ.

Для оценки тяжести рассеянного склероза использовали расширенную шкалу оценки инвалидизации — EDSS (Expanded Disability Status Scale). Скорость прогрессирования заболевания рассчитывали путем деления балла EDSS на продолжительность РС в годах. Клиническая характеристика группы пациентов с РС (n=641) представлена в табл. 1. Представители контрольной группы были отобраны в Республиканском центре переливания крови (Уфа, Республика Башкортостан, Российская Федерация).

Таблица 1. Клиническая характеристика группы пациентов с РС

Примечание. M — среднее значение; SD — стандартное отклонение.

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией (2018 г.). От всех участников было получено письменное добровольное информированное согласие. Протокол исследования одобрен Локальным комитетом по биомедицинской этике Института биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра РАН (№1/28.10.2007).

Генотипирование. ДНК выделяли из цельной венозной крови при помощи фенольно-хлороформного метода. Качество полученной ДНК оценивали при помощи электрофореза в 0,8% агарозном геле и количественно определяли при помощи спектрофотометрического анализа поглощения ультрафиолетового излучения. Праймеры для генотипирования подбирались с использованием программного обеспечения PrimerSelect 5.05 («DNAStar Inc.», Мэдисон, Висконсин, США). Выбор локусов ДНК для анализа основывался на следующих критериях: 1) наличие ранее выявленной в GWAS ассоциации с РС или другими аутоиммунными признаками; 2) известная или предполагаемая функциональная значимость; 3) частота редкого аллеля >0,05 в европейских популяциях согласно базе данных Ensembl. Генотипирование проводилось в соответствии с условиями, описанными ранее [10, 11].

Статистический анализ. Данные исследования анализировали с помощью IBM SPSS Statistics V22.0 (Чикаго, Иллинойс, США). Проводился анализ соответствия наблюдаемых частот исследуемых локусов в контрольной группе теоретически ожидаемым согласно закону Харди—Вайнберга (табл. 2). Для оценки нормальности распределения применяли критерий Шапиро—Уилка, для установления равенства дисперсий использовали критерий Левена, для оценки равенства средних — t-критерий. При отклонении от нормального распределения для попарного сравнения групп использовали непараметрический критерий Манна—Уитни.

Таблица 2. Исследуемые ДНК-локусы, частоты редких аллелей и результаты анализа соответствия равновесию Харди—Вайнберга в трех этнических группах

Примечание. Chr — хромосома; SNP — однонуклеотидный полиморфизм; MA — редкий аллель; MAF — частота редкого аллеля в контрольной группе; P — уровень значимости для теста Харди—Вайнберга в контрольной группе.

Ассоциации между изучаемыми локусами и РС анализировали отдельно в каждой группе с помощью логистического регрессионного анализа в рамках аддитивной генетической модели с поправкой на пол, реализованной в программе PLINK. (https://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/) [12]. Аддитивная модель предполагает наличие линейного градиента риска между гомозиготами по аллелю с отсутствием эффекта, гетерозиготами и гомозиготами по аллелю риска. Метаанализ результатов исследования проводился с использованием модели фиксированного эффекта и модели со случайными эффектами. Значения P<0,05 считались статистически значимыми. Поправку на множественные сравнения проводили с использованием метода FDR (false discovery rate) [13].

Мультилокусный анализ проводили с помощью программы APSampler 3.7.0 (программа и ее описание доступны на https://apsampler.sourceforge.net/). APSampler (Allelic Pattern Sampler): использует метод Монте-Карло марковскими цепями, основанный на байесовских подходах, для поиска комбинаций аллельных вариантов нескольких локусов, связанных с рассматриваемым признаком [14]. Поскольку APSampler не позволяет принимать во внимание при анализе потенциальные искажающие факторы, включая пол, и учитывая наличие выраженного полового диморфизма в распространенности РС, мультилокусный анализ проводился отдельно для мужчин и женщин.

Результаты 20-летнего проспективного исследования. Подгруппа больных, включенных в исследование 2000 г., состояла из 247 человек (123 русских, 98 татар, 26 башкир). На момент включения в исследование средний возраст больных составил 38,4±9,9 года (39,3±6,6 — в группе башкир, 39,2±10,2 — в группе русских, 37,2±10,2 — в группе татар), средняя длительность заболевания — 10,5±8,3 года, а средняя скорость прогрессирования — 0,78±0,87 балла/год. Соотношение женщин и мужчин было 2:1 (166:81). Первично-прогрессирующий РС выявлен у 25 (10,1%) больных, вторично-прогрессирующий — у 127 (51,4%), ремиттирующий — у 95 (38,5%).

Средний балл по шкале EDSS в 2000 г. составил 4,08±1,4; 211 (85,5%) пациентов могли ходить без посторонней помощи (1—5,5 EDSS), 29 (11,7%) — с поддержкой (6—6,5 EDSS), 7 (2,8%) человек были прикованы к инвалидной коляске (7—8 EDSS) и обследованы на дому. По результатам 20-летнего наблюдения выживаемость составила 61,54% (152 участника). Средний балл по шкале EDSS в 2020 г. составил 5,4±2,24; 81 (53%) пациент мог ходить без посторонней помощи, 21 (14%) — с поддержкой, 44 (29%) были прикованы к инвалидной коляске, 6 (4%) — к постели (8,5—9,5 EDSS). Показатели EDSS и скорость прогрессирования не различались у мужчин и женщин на момент включения в исследование, но через 10 лет неврологическая инвалидность и прогрессирование были более выражены у мужчин (p=0,04). Через 20 лет умерли 96 (38,87%) человек исходной выборки. Группы больных с прогрессированием и умерших характеризовались поздним началом заболевания и ранним проявлением двигательных и координационных нарушений.

Полисимптомное начало с преобладанием двигательных нарушений чаще встречалось в группе башкир. При поступлении темп прогрессирования у башкир составил 0,57 (95% ДИ 0,39—1,2) балла/год, что достоверно выше, чем у русских (0,42, 95% ДИ 0,27—0,79, P=0,04) и у татар, но различия с последними не достигли статистической значимости (0,45, 95% ДИ 0,25—1, P=0,39).

У части пациентов (46 человек: 6 башкир, 20 русских, 20 татар) не выявлено нарастания инвалидности в течение 20-летнего периода наблюдения. В этой подгруппе у 32 пациентов диагностирован ремиттирующий РС, у 14 — вторично-прогрессирующий РС. Средний возраст при включении в исследование составил 33,3±8,2 года, средний возраст манифестации заболевания — 26,6±7 лет, среднее время от первого симптома до установления диагноза — 6,9±5,3 года, что меньше, чем в общей группе (10,3±8 лет, p=0,08). Неврологический дефицит по шкале EDSS составил 3,5±0,83 балла, через 5 лет — 3,6±0,88 балла. В этой группе РС чаще всего дебютировал двигательными расстройствами (15 (32,6%) больных), расстройствами чувствительности (12 (26,1%)), ретробульбарным невритом (7 (15,2%)), координационными нарушениями (6 (13%)), глазодвигательными нарушениями (4 (8,7%)), а у 2 (4,4%) пациентов было полисимптомное начало. Скорость прогрессирования значительно снизилась в этой группе в течение периода наблюдения (P<0,001), что указывает на низкий уровень неврологического повреждения.

Анализ ассоциаций с РС индивидуальных локусов. Мы провели анализ ассоциаций между РС и 31 генетическим вариантом, для которого ранее выявлены ассоциации с РС или другим аутоиммунным заболеванием по результатам GWAS, в группе исследования, состоявшей из 641 пациента с РС и 1407 представителей контрольной группы. Наблюдаемое распределение частот генотипов всех анализируемых локусов в контрольной группе соответствовало равновесию Харди—Вайнберга. Наиболее значимая ассоциация выявлена между аллелем C6orf10 rs3129934*T и РС в группах русских (ОШ=2,00, Р=5,85·10^–5) и татар (ОШ=2,38, P=8,61·10^–7) (табл. 3). В группе русских два других аллеля связаны с повышенным риском заболевания: EOMES rs11129295*T (ОШ=1,56, p=0,007) и IL7R rs1494558*I (ОШ=1,61, P=0,003) (см. табл. 3). Ассоциации между изучаемыми локусами и РС в группе башкир выявлено не было.

Таблица 3. Результаты анализа ассоциации изучаемых локусов с РС

Примечание. SNP — однонуклеотидный полиморфизм; ОШ — показатель отношения шансов; P_FDR — уровень значимости с поправкой Бенджамини—Хохберга на множественные сравнения; * — статистически значимые различия; ^# — обозначена смена аллеля риска (для rs228614: в группах русских и татар аллель риска G, в группе башкир — A); NA — недоступно.

Метаанализ в трех этнических группах. Проведен метаанализ результатов исследования ассоциаций во всех трех группах (325 башкир, 772 русских, 951 татарин) по 30 генетическим вариантам (полиморфизм MANBA rs228614 исключен из метаанализа в связи с различием аллеля риска в разных этнических группах: в группах русских и татар аллель риска G, в группе башкир — A). Полученные результаты подтвердили ассоциации вариантов C6orf10 rs3129934*T, EOMES rs11129295*T и IL7R rs1494558*I с РС (см. табл. 3). Кроме того, в результате метаанализа были выявлены ассоциации аллелей INAVA rs7522462*G, IL7R rs10624573*I, CD6 rs17824933*G, GPC5 rs9523762*A и GPR65 rs2119704*C с заболеванием (см. табл. 3).

Полигенный анализ. При помощи APSampler был проведен поиск паттернов, значимо ассоциированных с РС, в общей группе исследования и отдельно в этнических группах (поскольку APSampler не допускает введения поправок, дополнительно выполнен анализ в группах мужчин и женщин). Наиболее значимые полигенные предикторы представлены в табл. 4 (ассоциации комплексных маркеров с РС у башкир и у мужчин-татар не достигли статистической значимости, вероятно, из-за ограниченного размера выборки). Среди предикторов РС наиболее часто представлены локусы C6orf10 rs3129934 (во всех исследуемых подгруппах, кроме русских мужчин и женщин-татарок), EOMES rs11129295 (у русских мужчин и женщин и у женщин-татарок), GPC5 rs9523762 (общая группа, русские мужчины, общая группа русских) и CD58 rs2300747 (все подгруппы женщин).

Таблица 4. Основные полигенные предикторы РС

Примечание. P — уровень значимости; P_FDR — уровень значимости с поправкой Бенджамини—Хохберга на множественные сравнения; ОШ — показатель отношения шансов; 95% ДИ_ОШ — доверительный интервал для показателя отношения шансов.

Нами проведены 20-летнее проспективное клиническое исследование и поиск комплексных генетических предикторов РС в трех этнических группах Республики Башкортостан. Установлено, что полисимптомное начало с преобладанием двигательных нарушений, являющееся неблагоприятным прогностическим критерием, чаще наблюдалось в группе башкир. На момент включения в исследование скорость прогрессирования у башкир была достоверно выше, чем в группе русских (при сравнении с группой татар различия не достигали уровня статистической значимости). За 20-летний период наблюдения скорость прогрессирования уменьшилась во всех группах. Выявлена подгруппа пациентов (n=46), у которых не отмечено нарастания инвалидности в течение периода наблюдения, возможно, благодаря началу применения в 2008 г. препаратов, изменяющих течение РС (ПИТРС).

Проведен анализ 31 генетического варианта, ранее ассоциированного с РС по результатам GWAS РС и иных аутоиммунных заболеваний, и воспроизведены ассоциации восьми локусов с РС (см. табл. 3). Проведение мультилокусного анализа позволило выявить полигенные предикторы РС (см. табл. 4). Наиболее значимо ассоциированным с заболеванием как индивидуально, так и в сочетании с другими генетическими вариантами был rs3129934, расположенный в C6orf10 в области HLA-DRB/DQA. Ранее сообщалось об ассоциации этого полиморфизма с РС во многих популяциях европейского происхождения [3, 15].

Также выявлены ассоциации с РС локусов INAVA rs7522462, IL7R rs10624573, EOMES rs11129295, GPR65 rs2119704, GPC5 rs9523762, CD6 rs17824933 и CD58 rs2300747. Полиморфизм rs7522462 SNP относится к локусу активатора врожденного иммунитета (INAVA) на хромосоме 1 в области, в которой обнаружены другие полиморфные варианты РС [16, 17]. Было высказано предположение, что этот полиморфизм может оказывать влияние на РС путем подавления экспрессии гена INAVA и снижение продукции цитокинов в макрофагах [18, 19]. IL7R Полиморфизм rs10624573 также может быть вовлечен в патогенез РС, влияя на уровни в крови альфа-цепи IL7R [10, 20].

Полиморфизм расположен в области гена эомезодермина, кодирующего транскрипционный фактор, активирующий продукцию интерлейкина-10 и влияющий на иммунологическую память [21, 22]. Показано, что у пациентов с РС, не получающих лечения, снижена экспрессия гена EOMES; rs11129295 является eQTL для EOMES в периферической крови [23]. Аллель rs11129295*T был связан с повышенным риском ремиттирующего РС у населения Китая [24]. SNP rs2119704 представляет собой eQTL для GPR65, кодирующего гликосфинголипидный рецептор, измененная экспрессия которого может влиять на целостность миелина, способствуя прогрессированию РС.

Ассоциация rs9523762 с РС была подтверждена в нескольких исследованиях [25—27]. Этот полиморфизм относят к гену GPC5, кодирующему глипикан 5, который присутствует в активных бляшках РС и участвует в регуляции клеточной передачи сигналов [25]. Ранее обнаружено, что аллель CD58 rs2300747*G обладает защитным действием против РС и увеличивает экспрессию гена CD58 дозозависимым образом, предположительно благодаря miR-548ac, расположенной в интроне 1 гена CD58 [28]. CD6 rs17824933 связан с восприимчивостью к РС [28, 29] и снижением экспрессии полноразмерного CD6, приводящим к изменению пролиферации CD4(+) Т-клеток, что предполагает его участие в регуляции иммунологического ответа при РС [30].

Результаты исследования свидетельствуют о том, что факторами, повышающими риск прогрессирования РС, являются мужской пол, позднее начало заболевания, двигательные нарушения как ранний симптом заболевания. Нам удалось воспроизвести ассоциации между РС и восемью генетическими вариантами (C6orf10 rs3129934, INAVA rs7522462, IL7R rs10624573, EOMES rs11129295, GPR65 rs2119704, GPC5 rs9523762, CD6 rs17824933 и CD58 rs2300747), ранее выявленными в крупномасштабных исследованиях, выполненных с участием европейских популяций. Наиболее значимая ассоциация была установлена для варианта rs3129934, расположенного в области главного комплекса гистосовместимости. Мультилокусный подход позволил выявить полигенные предикторы РС, которые могут отражать индивидуальную предрасположенность к заболеванию. Будущие направления исследований включают полногеномное или экзомное секвенирование, что может помочь раскрыть механизмы, лежащие в основе патогенеза рассеянного склероза в популяциях Волго-Уральского региона России.

Исследование выполнено при поддержке мегагранта Правительства РФ [075-15-2021-595] и НИР №АААА-А16-116020350031-4; биологический материал (ДНК) для исследования взят из коллекции биологических материалов человека ИБГ УНЦ РАН, поддержанной программой биоресурсных коллекций ФАНО России; работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Биомика» и УНУ «КОДИНК» (ИБГ УФИЦ РАН).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.