Возрастные особенности нарушений сна в моделях доклинической стадии болезни Паркинсона у крыс

Болезнь Паркинсона (БП) — хроническое нейродегенеративное, или конформационное, заболевание, развивающееся чаще всего в пожилом (после 65 лет) возрасте; симптомы болезни были известны с античных времен, но социально значимой она стала в последние 100—150 лет, когда продолжительность жизни в развитых странах возросла в 2 раза. БП в мире страдают более 16 млн человек [1]. Ожидается, что дальнейшее увеличение продолжительности жизни будет сопровождаться увеличением числа пациентов с БП [2].

Одна из главных причин неизлечимости БП — это постановка диагноза через 10—30 лет после начала заболевания, т.е. в более пожилом возрасте. К этому времени гибель дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции и снижение уровня дофамина в стриатуме достигают 50—80% и проявляются моторные дисфункции, без которых клиницисты опасаются ставить диагноз БП. Излечение при таких нарушениях уже невозможно. Для того чтобы начать терапию БП на ранней стадии, необходим надежный комплекс немоторных маркеров [3]. Почти все пациенты с БП имеют различные расстройства сна, однако остаются сомнения в том, какие из них предшествуют появлению моторных феноменов, означающему вступление в клинические стадии [4, 5]. Основные нарушения сна и бодрствования, происходящие при БП, включают парасомнию, инсомнию и гиперсомнию [6, 7]. Они оказывают существенное негативное влияние на качество жизни пациентов с БП.

В качестве раннего маркера БП чаще других рассматривается парасомния «rapid eye movement (REM) sleep behavior disorder (RBD)», или парадоксальный сон без мышечной атонии. Наблюдения большого числа пациентов с RBD, проведенные в Канаде, показали, что риск развития БП с течением времени после диагностирования RBD возрастает, составляя около 18% через 5 лет, 40—41% через 10 лет и 52—53% через 12 лет [8]. Данные, поддерживающие гипотезу об RBD как раннем маркере БП, а также ограничивающие действие этой гипотезы, приведены в ряде обзоров [4, 9, 10]. Синдром инсомнии и другие ночные нарушения сна характерны для 60—98% пациентов с БП. Проявления инсомнии усиливаются на поздних стадиях БП, когда чаще возникают симптомы фрагментации сна и утренние пробуждения [7, 11]. Гиперсомния, или повышенная дневная сонливость (ПДС), — сложный феномен, который может проявляться в виде или длительного и непрерывного состояния дремоты, или внезапных и опасных «сонных атак», напоминающих нарколепсию. Частота синдрома у пациентов с БП колеблется от 15,5 до 54% [12—14]. Ряд авторов полагают, что такие различия могут зависеть от стадии болезни, скорости ее развития, наличия когнитивных и иных отклонений [12, 13]. В других работах влияние подобных факторов отрицается [15, 16].

Наиболее важные вопросы: является ли синдром ПДС предвестником развития БП и зависит ли ПДС от возраста. На основании неврологической оценки большой когорты (3078 пациентов) на протяжении 7 лет у части больных с синдромом ПДС было выявлено развитие БП, позволившее высказать предположение, что синдром ПДС увеличивает риск появления БП в 2—3 раза [17]. К сожалению, в эту группу были включены только пожилые мужчины (старше 70 лет). Показано, что частота дневной сонливости у пациентов с БП возрастает по мере увеличения длительности и тяжести заболевания (возраст пациентов при этом также увеличивается) [18]. Найдено, что ПДС встречается в 1,5 раза чаще у пациентов с БП, чем у здоровых такого же возраста [19]. Сделан вывод, что дневная гиперсомния может служить ранним немоторным маркером БП, который проявляется до возникновения моторных дисфункций [20]. Однако имеется и противоположная точка зрения. Ряд авторов утверждают, что проявления гиперсомнии у пациентов с БП встречаются не чаще, чем у здоровых [5, 16]. Наконец, высказывается мнение, что гиперсомния является самостоятельным синдромом, не связанным с нарушением ночного сна или проводимой терапией против БП [21]. Таким образом, возможность использования дневной гиперсомнии в качестве немоторного маркера ранней диагностики БП сдерживается многими противоречивыми данными.

Ускорить поиск немоторных маркеров и уменьшить расходы на исследования можно путем разработки адекватных моделей БП у животных [3, 9]. Ранее в лаборатории были впервые созданы модели у крыс Вистар среднего и пожилого возраста на основе нарастающего угнетения активности убиквитин-протеасомной системы головного мозга, которая в нормальных условиях обеспечивает своевременную и избирательную деградацию аномальных белков, в том числе токсичных олигомеров белка α-синуклеина [9, 22]. Показано, что локальное подведение специфического ингибитора протеасом лактацистина к компактной части черной субстанции вызывает увеличение парадоксального сна [23], а интраназальное введение лактацистина — снижение представленности глубокого медленного сна и увеличение состояния дремоты [24, 25]. Типичные черты этих моделей — допороговый уровень нейродегенерации (гибель менее трети дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции и менее 60% их аксонов в стриатуме) и отсутствие моторных дисфункций, что характерно для премоторной стадии у пациентов с БП. Возрастные особенности нарушений сна на начальных этапах развития БП у пациентов изучены мало, экспериментальные модели у животных при старении находятся на стадии апробации.

Цель настоящего исследования — выяснить различия в нарушениях характеристик суточного цикла сон—бодрствование как немоторных признаков начального этапа развития БП у взрослых и пожилых животных.

Работа выполнена на 13 самцах крыс популяции Вистар в двух возрастных группах: 6 крысах среднего возраста (7—8 мес, масса тела 350—380 г) и 7 — пожилого возраста (19—20 мес, масса тела 400—450 г). Животных содержали в свето- и звукоизолированной экспериментальной камере при температуре окружающей среды 22±1 °C, фотопериоде 12/12 ч (5:00—17:00 — свет) и свободном доступе к воде и пище. До начала эксперимента крыс адаптировали к условиям камеры в течение 10—14 сут.

Для того чтобы охарактеризовать временны́е и спектральные характеристики состояний бодрствования и сна в контрольных условиях, животным интраназально вводили 10 мкл фосфатного буфера (растворитель лактацистин). Регистрацию полисомнограмм (контроль) осуществляли через 7 сут (1 нед) после введения фосфатного буфера в течение 3 сут (всего 18 суточных контрольных записей у 6 крыс среднего возраста, 21 суточная запись у 7 пожилых крыс). На 11-е сутки после введения контрольного раствора этим же животным интраназально вводили лактацистин с целью моделирования доклинической стадии БП. Для приближения к срокам развития БП у человека была выбрана пролонгированная до 21 сут модель доклинической стадии БП у крыс, основанная на интраназальном введении ингибитора протеасом лактацистина («Enzo Life Sciences», США) [24]. Лактацистин в дозе 125 мкг, растворенный в 10 мкл апирогенного фосфатного буфера (pH 7,4), вводили крысам в каждую ноздрю дважды с интервалом 7 сут. Суммарная доза лактацистина составила 500 мкг для каждого животного.

Экспериментальные записи выполняли через 21 сут (3 нед) после первого введения лактацистина в течение 2 сут (всего 12 суточных экспериментальных записей у 6 крыс среднего возраста, 14 суточных записей у 7 пожилых крыс).

Регистрация и анализ суточного цикла бодрствование—сон. Компьютерная регистрация полисомнограмм осуществлялась с помощью телеметрического оборудования Dataquest A.R.T. System («DSI», США) в условиях свободного поведения животных. Вживление телеметрического модуля 4ET-S1/S2 («DSI») и электродов для регистрации двух каналов электроэнцефалограммы (ЭЭГ), электроокулограммы глазных мышц, электромиограммы мышц шеи животного и температуры тела выполняли под общей анестезией золетилом: тилетамина гидрохлорид+золазепама гидрохлорид (Zoletil 100, «Virbac Sante Animale», Франция). Запись электрофизиологических показателей начинали не ранее чем через 10—14 сут после проведения операции; регистрацию выполняли непрерывно в течение 24 ч, начиная с темной фазы суток (17:00—05:00).

Идентификацию состояний цикла бодрствование—сон и количественный анализ данных осуществляли визуально с использованием программы Sleep_Pro («DSI»). При обработке данных полисомнографии анализировали временные характеристики (общее время, длительность и количество эпизодов) состояний бодрствования, дремоты, медленного и парадоксального сна. Амплитудно-частотные характеристики ЭЭГ вычисляли с помощью быстрого преобразования Фурье. Медленноволновую активность определяли в состоянии медленного сна как отношение спектральной плотности в полосе частот 0,7—4 Гц за каждый час регистрации к среднесуточной спектральной плотности диапазона 0,7—50 Гц. Эпоха анализа всех показателей составляла 10 с; для каждого из состояний рассчитывали среднее значение исследуемых показателей за 12 ч темной (активной) и светлой (неактивной) фаз суток и за 24 ч.

Манипуляции с животными осуществляли в соответствии с протоколом, утвержденным комитетом по охране животных ИЭФБ РАН, находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями.

Статистическая обработка данных. С учетом характера распределения данных, возрастные изменения в характеристиках цикла сон—бодрствование оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Различия в показателях сна и бодрствования между контролем и доклинической стадией БП определяли с помощью парного критерия Вилкоксона для связанных выборок. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

Возрастные изменения сна. Анализ суточных полисомнограмм показал, что наибольшие различия между группами крыс пожилого и среднего возраста наблюдались в темной фазе суток, которая у крыс является активным периодом. В этой фазе общее время бодрствования уменьшалось у пожилых животных на 20% (p<0,05) (рис. 1, а), представленность дремоты возрастала в 2 раза (на 101%, p<0,01) (см. рис. 1, б) и отмечалась тенденция к возрастанию количества медленного и парадоксального сна (см. рис. 1, в, г). Эти изменения указывали на возрастное снижение активности животных в темное время суток.

Рис. 1. Изменения общего времени состояний суточного цикла бодрствование—сон в модели доклинической стадии БП у крыс среднего (7—8 мес) и пожилого (19—20 мес) возраста.

Здесь и на рис. 2, 3: данные представлены как среднее арифметическое±ошибка среднего; * — достоверные различия между группами среднего и пожилого возраста в контрольных условиях при p<0,05 (критерий Манна—Уитни); # — достоверные различия между контрольными данными и значениями после введения лактацистина (ЛЦ) согласно возрасту, при p<0,05 (критерий Вилкоксона для связанных выборок).

В светлой (неактивной) фазе суток сохранялась повышенная представленность дремоты у пожилых крыс: общее время этого состояния превышало показатели крыс среднего возраста на 50% (p<0,05). В результате в среднем за сутки отмечались возрастание дремоты на 69% (p<0,05) и уменьшение бодрствования на 16% (p<0,05). Увеличение общего времени дремоты было обусловлено возрастанием средней длительности эпизодов с 28±3,4 с у крыс среднего возраста до 45±4,1 с у пожилых крыс (p<0,05). Представленность медленного сна и его дельта-волновая активность в неактивную фазу суток имели явную тенденцию к снижению у пожилых животных по сравнению со средним возрастом (рис. 2). Таким образом, данные настоящего исследования свидетельствовали о том, что для пожилых крыс в отличие от особей среднего возраста была характерна ПДС в активную фазу суток, а в неактивную у них отмечалась тенденция к возрастанию представленности поверхностного сна.

Рис. 2. Изменение распределения среднесуточного количества эпизодов медленного сна в зависимости от их длительности в модели доклинической стадии БП у крыс среднего и пожилого возраста.

Здесь и на рис. 3: * — достоверные различия между контрольными данными и значениями после введения лактацистина (ЛЦ) при p<0,05 (критерий Вилкоксона для связанных выборок).

Изменения сна в модели доклинической стадии БП. При моделировании доклинической стадии БП у крыс среднего возраста было выявлено увеличение общего времени дремоты на 25% в активную фазу суток (p<0,05). При этом у пожилых животных отмечалось дополнительное к возрастному нарастание представленности этого состояния; общее время дремоты увеличивалось на 28% (p<0,05) по сравнению с контролем, а общая величина прироста времени дремоты составляла 106% (p<0,01) по сравнению с животными среднего возраста, получившими лактацистин. Эти данные указывают на более выраженное проявление синдрома ПДС в активную фазу суток у крыс в пожилом возрасте по сравнению со средним в модели доклинической стадии БП.

Характерной особенностью изменения состояний сна и бодрствования в неактивную фазу суток у животных среднего возраста в модели доклинической стадии БП являлось возрастание времени дремоты на 19% (p<0,05). В среднем за сутки представленность дремоты в доклинической стадии увеличивалась на 21% (p<0,05) преимущественно за счет прироста продолжительности эпизодов этого состояния. При этом увеличение дремоты было сопряжено с уменьшением представленности медленного сна (см. рис. 1, в) и нарушением его микроструктуры, о чем свидетельствовали увеличение количества эпизодов медленного сна (рис. 3, а) и уменьшение их длительности с 165±7,6 с в контрольных условиях до 141±9,1 с (p<0,05). Эти изменения указывали на фрагментацию сна в неактивную фазу суток. Анализ дельта-волновой активности ЭЭГ во время медленного сна выявил ее снижение на 15% (p<0,05) по сравнению с контролем. Следовательно, проявление синдрома ПДС в активную фазу и доминирование поверхностного фрагментированного сна в неактивную фазу суток являются признаками нарушения сна у крыс среднего возраста в модели доклинической стадии БП.

Рис. 3. Изменение мощности спектра ЭЭГ, зарегистрированной во время медленного сна, в модели доклинической стадии БП у крыс среднего и пожилого возраста.

У пожилых крыс в модели доклинической стадии БП, как и у крыс среднего возраста, в неактивную фазу суток отмечалось возрастание представленности дремоты на 16% (p<0,05). В среднем за сутки общее время дремоты увеличивалось на 21% (p<0,05) преимущественно из-за возрастания длительности эпизодов этого состояния до 54±4,9 с против 45±4,1 с (p<0,05) в контроле. При этом у крыс пожилого возраста, как и у особей среднего возраста, было зарегистрировано снижение мощности спектра ЭЭГ в дельта-диапазоне на 17% (p<0,05) (см. рис. 2) и наблюдалась явная тенденция к уменьшению представленности медленного сна (см. рис. 1, в). Однако у пожилых животных в отличие от группы среднего возраста, не наблюдалось возрастания количества коротких эпизодов медленного сна, указывающих на его фрагментацию при моделировании доклинической стадии БП (см. рис. 3, б). Следовательно, отличительным признаком нарушения сна у крыс пожилого возраста в модели доклинической стадии БП является отсутствие фрагментированного сна. К общим признакам нарушения сна у пожилых животных и крыс среднего возраста в модели доклинической стадии БП относится наличие синдрома ПДС в активную фазу суток, который более выражен в пожилом возрасте, и преобладание поверхностного сна в неактивную фазу суток.

В настоящей работе для поиска признаков нарушений сна, характерных для ранней стадии БП, была использована валидная модель пролонгированной (до 21 сут) доклинической стадии БП у крыс среднего и пожилого возраста, созданная путем ингибирования протеасом головного мозга. При создании этой модели ориентировались на использование интраназального способа доставки в мозг ингибитора протеасом лактацистина, который является экологически адекватным для жизни человека в связи с естественным путем его проникновения в головной мозг через обонятельный нейроэпителий. В основу созданной модели было положено современное представление, что ослабление активности убиквитин-протеасомной системы является одним из ключевых молекулярных механизмов патогенеза БП [9, 22]. Модель воспроизводила основные патоморфологические и нейрохимические признаки доклинической стадии БП: 1) нейродегенеративные изменения в экстранигральных структурах головного мозга (обонятельные луковицы, голубое пятно, вентральная тегментальная область); 2) допороговый уровень нейродегенерации и содержания дофамина в нигростриатной системе по сравнению с уровнем клинической стадии при отсутствии моторных феноменов; 3) наличие нейрональных телец Леви, содержащих агрегаты α-синуклеина, и 4) признаки нейровоспаления в нигростриатной и экстранигральных структурах головного мозга [24, 26—28]. Важно отметить, что новая модель ингибирования протеасом головного мозга, имитирующая доклиническую стадию БП, воспроизводит симптомы нарушений когнитивных функций и эмоционального поведения, предшествующие клинической стадии БП, и возрастные особенности в их проявлении [25, 29—31]. Перечисленные выше патоморфологические, нейрохимические изменения в нигростриатной и экстранигральных структурах головного мозга и премоторные симптомы соответствуют доклинической стадии БП, согласно концепции H. Braak и соавт. [32].

Известно, что с увеличением возраста сон изменяется [33, 34]. Пожилой возраст — фактор риска заболеваемости БП. Анализ данных литературы показывает, что нет ни одного заболевания, при котором отмечалась бы такая же сильная зависимость увеличения риска развития от процессов старения, какая наблюдается в случае с БП [35]. Однако возрастные особенности нарушений сна на начальных этапах развития БП у пациентов еще мало изучены из-за трудностей в определении доклинических симптомов, поэтому было проведено полисомнографическое исследование на модели доклинической стадии БП у животных среднего и пожилого возраста. Задача настоящего исследования состояла в том, чтобы выяснить общие закономерности и возрастные различия в нарушении характеристик сна и бодрствования на ранней стадии развития Паркинсон-подобной патологии с целью определения раннего полисомнографического маркера. Проведенное исследование показало, что у пожилых животных в отличие от особей среднего возраста в контрольных условиях отмечается ПДС в активную фазу суток (дневная сонливость для человека), о чем свидетельствовало увеличение времени переходного дремотоподобного состояния, а в неактивную (ночное время для человека) — явная тенденция к уменьшению общего времени медленного сна, глубокого сна, а также увеличение длительности эпизодов и представленности дремоты, что указывало на возрастание представленности поверхностного сна. Эти данные согласуются с метаанализом, включавшим 65 исследований с участием около 3600 пациентов в возрасте от 5 до 100 лет. Авторы выявлили, что у человека начиная с молодого возраста до 60 лет происходят увеличение длительности стадии поверхностного сна, уменьшение пропорции глубокого медленного сна и увеличение дремоты (в виде ПДС). Было подсчитано, что у человека до 60 лет в течение каждого десятилетия глубокий сон (дельта-сон) сокращается приблизительно на 2% [36].

В модели доклинической стадии БП у животных среднего и пожилого возраста изменяются в основном те же параметры сна и дремотоподобного состояния, что у здоровых (контрольных) пожилых крыс, но в более выраженной форме. При анализе данных полисомнографии как у пожилых животных, так и у особей среднего возраста в модели доклинической стадии БП были выявлены: а) ПДС в активную фазу суток, которая более выражена в пожилом возрасте, и б) преобладание поверхностного медленного сна в неактивную фазу суток. К отличительным признакам нарушения сна у крыс пожилого возраста в модели доклинической стадии БП следует отнести отсутствие значимого снижения общего времени медленного сна и увеличения количества более коротких его эпизодов, что свидетельствовало бы об усилении фрагментации сна. Результаты настоящего исследования указывают на связь между ПДС и преобладанием поверхностного неглубокого сна в неактивную фазу суток в модели БП у крыс разных возрастных групп. При этом связи между ПДС и наличием одного из признаков инсомнии в виде частых пробуждений обнаружено не было, что может свидетельствовать о том, что ПДС является самостоятельным синдромом в модели БП. Сходное проявление синдрома ПДС и его корреляция с ночным сном отмечались и у пациентов с БП в клинической стадии БП [37]. Мы полагаем, что выявленный в настоящем исследовании синдром ПДС в модели доклинической стадии БП у крыс разных возрастных групп может рассматриваться как немоторный признак начавшейся нейродегенерации, который может соответствовать ПДС на ранней (доклинической) стадии БП. Это согласуется и с недавно полученными данными объективной оценки дремоты с помощью актиографии большой когорты (2920 пациентов) пожилых мужчин (средний возраст 76 лет), наблюдавшихся в течение 11 лет [38]. В этом исследовании было показано, что при появлении признаков поведенческого ПДС (без полисомнографии) у пожилых риск развития БП увеличивается в 3 раза и ПДС может проявляться на несколько лет раньше первых двигательных нарушений у пациентов с БП, т.е. быть одним из первых симптомов этого заболевания.

Полученные в настоящем исследовании данные позволяют сделать вывод, что ПДС и нарушения структуры и качества сна, формирующиеся в динамике пролонгированной доклинической стадии БП в модели у крыс, являются следствием патофизиологических изменений и могут выявляться уже на ранних стадиях развития паркинсон-подобной патологии. Судя по полученным данным, патоморфологической основой появления ранних симптомов ПДС и других признаков нарушения сна в модели доклинической стадии БП у животных может являться дофамин- и норадреналиновая недостаточность, постепенно развивающаяся в ходе нейродегенеративного процесса в структурах, которые обеспечивают регуляцию бодрствования и сна (голубое пятно, вентральная тегментальная область); это приводит к снижению общего уровня восходящей активирующей системы бодрствования [24, 26, 30]. Причем воспалительно-деструктивные изменения и развитие α-синуклеиновой патологии в голубом пятне и вентральной тегментальной области головного мозга наиболее значительные в пожилом возрасте по сравнению со средним в модели доклинической стадии БП у животных, что может быть причиной большей выраженности ПДС при старении [26, 27]. Кроме того, выявленное в настоящем исследовании снижение дельта-волновой активности медленного сна в модели доклинической стадии БП у животных само по себе может провоцировать развитие основных патогенетических механизмов БП, в частности способствовать снижению активности восстановительных процессов в нервных клетках и ослаблению молекулярных механизмов противодействия нейродегенерации [25]. С глубоким медленным сном связывается реализация ключевой биологической функции — повышения скорости синтеза белков и усиления работы глимфатической системы, очищающей мозг от метаболитов и токсичных аберрантных белков [39, 40]. Наряду с этим выявленные нами ранее признаки когнитивного дефицита, тревожноподобного поведения и депрессии в этих моделях доклинической стадии БП у животных разных возрастных групп [25, 29—31] могут являться также следствием дефицита глубокого сна и ПДС.

Резюмируя представленные экспериментальные данные, можно отметить, что обнаруженные признаки ПДС и нарушения сна в модели доклинической стадии БП в среднем и пожилом возрасте у животных могут быть рекомендованы для апробации в клинических исследованиях при поиске потенциальных биомаркеров ранней стадии БП.

Работа выполнена в рамках государственного задания при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.