Рассеянный склероз (РС) — хроническое воспалительное демиелинизирующее и нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС). Его этиология неизвестна. Считают, что РС — это мультифакторное заболевание, в развитии которого важную роль играет генетическая предрасположенность, а также внешние факторы, среди которых наибольшее внимание привлекают инфекционные агенты, эмоциональный стресс [1—3], недостаточность витамина D и курение [4, 5]. Полагают, что ключевую роль в реализации взаимодействия генетических и внешних факторов играет взаиморегуляция иммунной и нервной систем. Наибольшее внимание привлекают прямые медиаторы этого взаимодействия, в частности катехоламины, включающие в себя дофамин (ДА), адреналин и норадреналин (НА), и имеющие рецепторы на клетках как нервной, так и иммунной систем [6]. Так, показано, что ДА оказывает модулирующее действие на клетки врожденного и адаптивного иммунитета [9—11], участвует в развитии нейропсихологических и когнитивных изменений при РС [12], в то время как НА влияет на выраженность воспалительного ответа при РС [6]. В то же время эффект катехоламинов на Th17-клетки, играющих критическую патогенетическую роль при РС, недостаточно изучен.

Цель настоящего исследования — изучение возможных ассоциаций между клиническими характеристиками РС, концентрацией ДА и НА в сыворотке крови, количественными и качественными характеристиками иммунных Тh17-клеток.

Обследовали 43 больных (25 женщин и 18 мужчин) в возрасте от 23 до 50 лет с достоверно диагностированным ремиттирующим РСпо критериям МакДональда (2005) [14].

Длительность заболевания на момент включения больных в исследование составляла от 1 года до 15 лет. Все больные получали терапию препаратами, изменяющими течение РС (ПИТРС) первой линии. Из них 29 пациентов находились в стадии клинической ремиссии, 14 — в состоянии обострения.

Всем пациентам проводили стандартный неврологический осмотр с оценкой уровня инвалидизации по шкале EDSS [15]. На момент забора крови все исследуемые больные более 3 мес не получали кортикостероидных препаратов (14 пациентам, находящимся в стадии обострения, кортикостероидная терапия была проведена после забора крови).

Контрольную группу составили 20 здоровых, 11 женщин и 9 мужчин.

Основная и контрольная группы были сопоставимы по полу и возрасту. Клинико-демографическая характеристика обследованных представлена в табл. 1.

Все больные подписали информированное согласие на участие в данном исследовании. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова.

Многоцветная проточная цитометрия: процент субпопуляций Т-хелперов определяли методом многоцветной проточной цитофлуорометрии. Образцы цельной крови (объем 100 мкл) окрашивали ECD-меченными моноклональными антителами (МАТ) к CD4 («Beckman Coulter», США) в сочетании с флюоресцеин-изотиоцианат-меченными (FITC) МАТ к CD26 («Beckman Coulter»), PE-Cy7-меченными МАТ к CD161 («eBioscience», США) и фикоэритрин-меченными (РЕ) МАТ к CD196 («eBioscience»). Далее проводили лизирование образцов раствором OptiLyse C («Beckman Coulter»), после чего образцы ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ, pH7,3) и анализировали на 5-канальном проточном цитометре Beckman Coulter FС500 с использованием программы CXP («BeckmanCoulter»). Th17-клетки идентифицировали как CD4CD26CD161CD196-позитивные события [16, 17]. В контрольные пробы добавляли антитела тех же меток и изотипа, но не имеющие антигенных мишеней в клетках человека (изотип-контроль). Для поправки на неспецифическое окрашивание из полученного значения вычитали процент клеток, позитивных при окраске изотип-контролем (как правило, менее 1%).

Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК): для оценки функциональной активности Th17- и Th1-клеток из венозной крови (взятой в утренние часы в пластиковую пробирку с EDTA) выделяли МНКПК путем центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (ПанЭко, Россия), трижды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,3) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI 1640 (ПанЭко) c добавлением 2 mM L-глутамина (ПанЭко) и 10% фетальной телячьей сыворотки (ПанЭко). Затем МНКПК в количестве 8·10⁴ в 200 мкл на лунку вносили в 96-луночный круглодонный планшет и стимулировали магнитными частицами, покрытыми анти-CD3-/анти-CD28-антителами («Life Technologies», Норвегия). Затем образцы инкубировали 72 ч в CO₂-инкубаторе, после чего отбирали супернатант и замораживали при –70 °С.

Иммуноферментный анализ (ИФА): уровни спонтанной и индуцированной продукции интерлейкина-17 (ИЛ-17) и гамма-интерферона (ИФН-γ) в супернатантах клеточной культуры, а также концентрации ДА и НА в сыворотке крови определяли методом ИФА. Для измерения концентрации цитокинов использовали наборы фирмы «eBiosciense» (США), для определения уровня ДА и НА — фирмы IBL (Австрия). Уровни всех аналитов выражали в пг/мл.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Prizm 6. Для оценки различий между двумя независимыми группами использовали U-критерий Манна—Уитни. Статистически значимыми различия считались при р<0,05.

По клиническим и демографическим характеристикам больные РС, находящиеся в стадии обострения и ремиссии, были сопоставимы, хотя уровень тяжести РС по шкале EDSS был выше в группе больных, находящихся в стадии обострения (см. табл. 1).

По данным многоцветной проточной цитометрии, процент CD4⁺ Т-клеток и Th17-клеток в группе больных, находящихся в стадии обострении, оказался достоверно выше, чем у больных в стадии ремиссии или здоровых контролей (табл. 2). Согласно результатам ИФА у больных РС в стадии обострения продукция ИЛ-17 и ИФН-γ стимулированными МНКПК также была достоверно выше (см. рисунок). В то же время содержание ДА в сыворотке крови пациентов в обострении оказалось ниже, чем у больных в ремиссии или группе здоровых доноров (см. табл. 2). Уровень Н.А. в сыворотке крови у больных РС в стадии обострения и ремиссии был сопоставим, но достоверно ниже, чем у здоровых контролей (см. табл. 2).

Исследования последних лет показали, что Th17-клетки, ключевым продуктом которых является ИЛ-17, играют важную роль в патогенезе ряда аутоиммунных заболеваний, включая РС [18]. По некоторым данным, количество Th17-клеток при РС может повышаться в несколько раз [19]. В нашем исследовании установлено, что процент Th17-клеток, как и продукция ИЛ-17, стимулированными МНКПК у больных РС в стадии обострения, практически в 2 раза выше, чем в стадии ремиссии или в группе здоровых контролей (см. табл. 2 и рисунок), что согласуется с данными других авторов и подтверждает патогенетическую роль Th17-клеток при РС [20]. Мы также изучили продукцию ИФН-γ, который является маркером Th1-клеток, но может продуцироваться и Th17-клетками [21]. Согласно полученным данным продукция ИФН-γ была значительно выше в группе больных в обострении по сравнению с ремиссией или группой здоровых (см. рисунок), что также соответствует результатам других исследователей [22].

При исследовании катехоламинов мы обнаружили изменение уровней ДА и НА в сыворотке крови у больных РС по сравнению с группой здоровых (см. табл. 2), что подтверждает выводы других авторов об участии катехоламинов в патогенезе РС [23, 24]. Нами установлено, что уровень НА у больных РС как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии ниже, чем в группе здоровых (см. табл. 2), что также согласуется с данными других исследователей и позволяет предположить противовоспалительный эффект НА при РС [23]. Это предположение может косвенно подтверждаться влиянием НА на течение экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у грызунов, при котором снижение НА сопровождается усилением воспаления в ЦНС и повреждением нейронов [13, 25]. В то же время увеличение уровня НА при использовании селективных ингибиторов обратного захвата НА предотвращает прогрессирование симптомов ЭАЭ у мышей [26]. В пользу противовоспалительного эффекта НА также указывают результаты исследования M. Cosentino и соавт. [27], которыми было установлено влияние ИФН-γ и ИФН-β на продукцию НА invitro. Так, было показано, что фитогемагглютинин-индуцированная продукция НА МНКПК у больных РС снижается при воздействии ИФН-γ и, напротив, усиливается при воздействии ИФН-β.

Было также установлено снижение концентрации ДА в сыворотке крови у больных РС в стадии обострения по сравнению с больными в стадии ремиссии или группой здоровых (см. табл. 2), что может указывать на противовоспалительный эффект ДА при Р.С. Дофамин является наиболее изученным нейротрансмиттером, участвующим в регуляции нейроиммунного взаимодействия при Р.С. Существуют многочисленные данные об иммуномодулирующем влиянии ДА как при ЭАЭ, так и при РС [28—30]. В то же время единого мнения в отношении этих эффектов нет [30]. По данным одних авторов, при РС ДА обладает иммуностимулирующим действием и повышает продукцию провоспалительных цитокинов invitro [31]. Другие авторы сообщают о противовоспалительном эффекте ДА при РС [28]. Полученные нами результаты продемонстрировали связь между снижением уровней катехоламинов в сыворотке крови и повышением продукции ИЛ-17 и ИФН-γ у больных РС, что позволяет предположить ингибирующий эффект ДА и НА на Th17-клетки при РС, однако механизмы этого влияния нуждаются в дальнейшем изучении.

Конфликт интересов отсутствует.