Введение

Экспериментально установлено, что питьевая сульфатная минеральная вода (МВ), широко распространенная в Европейской части России и, в частности, в Московском регионе [1] в условиях первичной профилактики усиливает процессы адаптации и ограничивает развитие пострадиационных нарушений в организме [2—3]. Эти эффекты выявлены в разных функциональных системах, в том числе в центральных органах нейрогормональной и иммунной регуляции — гипоталамусе, эпифизе, тимусе [4—5]. Для более углубленного изучения механизмов действия питьевой сульфатной МВ, а также с учетом функциональной взаимосвязи этих органов представляется целесообразным провести комплексное их исследование с применением сравнительного анализа данных по развитию процессов адаптации. Такой подход дает возможность определить особенности адаптационной перестройки в каждом из этих органов, выявить различия в устойчивости клеток к радиации, а также позволит в определенной мере судить об изменениях процессов интегральной (нейроиммуногормональной) регуляции. Именно поэтому в гипоталамусе исследовали паравентрикулярные ядра, представляющие собой центры интеграции и координации вегетативных функций организма [6—7]. Паравентрикулярные ядра состоят из нейронных популяций — субядер, различающихся в структурно-функциональном отношении: в крупноклеточных нейронах в основном вырабатываются вазопрессин и окситоцин, в мелкоклеточных — преимущественно кортикотропин: рилизинг-фактор (CRF) и аргинин-вазопрессин. Эти гормоны активируют систему «гипофиз—надпочечники», а также другие потенциальные механизмы адаптации. Эпифиз, по современным представлениям, посредством секреции плейотропного гормона мелатонина модулирует многочисленные физиологические функции, в частности, повышает активность гипоталамо-гипофизарного-надпочечникового комплекса [8—10], усиливает антиоксидантные реакции, поддерживает межклеточные контакты и иммунный гомеостаз [11—13]. Вместе с тем следует отметить, что изменение процессов адаптогенеза в этом органе на действие физиологических и патогенных факторов остается еще мало исследованными. Важным показателем в адаптационной перестройке механизмов интегральной регуляции является функциональное состояние тимуса, который, несмотря на повышенную чувствительность к действию радиации, способен усиливать свои защитные функции. Естественно, что при действии даже относительно низких интенсивностей радиации (0,5—1,0 Гр) в указанных органах происходит нарушение этих тонко сбалансированных механизмов регуляции с развитием процессов дезинтеграции, что, в свою очередь, приводит к дискоординации (дисфункции) различных органов-эффекторов и функциональных систем.

Цель исследования — провести сравнительный анализ и обобщение результатов экспериментальных исследований при профилактическом действии питьевой сульфатной МВ на развитие адаптационных внутриклеточных реакций в нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса, пинеалоцитах эпифиза и тимоцитах тимуса при радиационном облучении крыс.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 28 нелинейных крысах-самцах массой 220—250 г. Крысы были получены из питомника «Столбовая» НЦБМТ ФМБА России. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде и 12-часовом световом режиме. Исследования выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 №755) и требований Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986). Все животные с учетом принципов рандомизации были разделены на 3 группы. В опытную группу (группа МВ) включили 10 животных, которые получали питьевую сульфатную магниево-кальциевую МВ (концентрация сульфата 2,6 г/л, минерализация 4,0 г/л); в контрольную группу (контроль) — 10 животных, которые вместо сульфатной МВ получали водопроводную воду; в группу сравнения (интакт) вошли 8 интактных животных, которые никаким воздействиям не подвергались. МВ и водопроводную воду вводили крысам внутрижелудочно через иглу с оливой на конце, 1 раз в сутки по 3 мл в течение 21 сут. После курса поения животных опытной и контрольной групп однократно облучали на установке «ГУБЕ» (Институт общей генетики РАН) гамма-лучами ⁶⁰Со в дозе 2 Гр (мощность дозы 0,66 Гр/мин, время экспозиции 3 мин 02 с). Животных выводили из эксперимента через 1 мес после радиационного облучения путем декапитации под эфирным наркозом в 11—12 часов дня. Для электронно-микроскопических исследований гипоталамус и эпифиз фиксировали в 4% параформальдегиде. Из области гипоталамуса, соответствующей локализации паравентрикулярных ядер, изготавливали макросрезы, которые, как и эпифиз, постфиксировали в 1% OSO₄, обезвоживали и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы гипоталамуса и эпифиза просматривали в электронном микроскопе JEM-100CX (Jeol, Япония). Проводили морфометрический анализ секреторных гранул и везикул, митохондрий, гранулярной и агранулярной эндоплазматической сети (ГЭС и АЭС), комплекса Гольджи (КГ), лизосом, аутофагосом, вакуолей. Функциональную активность тимуса оценивали по его массе, ее отношению к массе крысы, числу ядер тимоцитов на единицу массы тимуса и активности генома тимоцитов. Структурно-функциональное состояние хроматина выявляли с помощью красителя акридинового оранжевого (АО) фотометрически при 492 нм. Количественную оценку полученных данных проводили с помощью методов вариационной статистики. Для оценки достоверности различий сравниваемых величин использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Радиационное облучение вызывало комплекс различных структурно-функциональных нарушений во всех исследованных органах. В клетках и межклеточных контактах паравентрикулярного ядра гипоталамуса и эпифиза выявлялись характерные ультраструктурные изменения, которые имели свои особенности. Прежде всего обращало на себя внимание, что межклеточные пространства были в разной степени расширены, а некоторые из них достигали крупных размеров, причем чаще они встречались в клетках эпифиза. Эти изменения свидетельствовали о нарушениях барьерной функции плазмалеммы, ее проницаемости и регуляторной взаимосвязи между клетками. Дистрофические и дегенеративные нарушения со стороны цитоплазматических органелл происходили в виде образования псевдомиелиновых фигур, просветления матрикса митохондрий и лизиса их крист, расширения и вакуолизации эндоплазматической сети. Наблюдались единичные случаи гибели астроцитов. На этом фоне в крупноклеточных нейронах гипоталамуса обнаруживалось значительное снижение численности электронно-плотных секреторных гранул (в 1,9 раза; p<0,01), а в мелкоклеточных нейронах — везикул в 2,8 раза (p<0,01). Такое выраженное снижение числа секреторных гранул и везикул, содержащих различные гормоны, в том числе CRF, было связано, видимо, с активным их выведением (выбросом) за пределы клеток под влиянием стрессогенного воздействия радиации. В клетках эпифиза — пинеалоцитах — секреторные гранулы у интактных животных встречались редко и в единичном числе, а после радиации они практически отсутствовали. Вместе с тем эндоплазматическая сеть этих клеток, принимающая непосредственное участие в процессах секреции, существенно увеличивала свою объемную долю (p<0,05), при этом возрастала и вакуолизация ее профилей. Повышалась также численность лизосом, фагосом и аутофагосом. В тимусе под влиянием радиации проявлялась тенденция к повышению его относительной массы, уменьшалась численность ядер тимоцитов, ослаблялась интенсивность связывания АО, что приводило к снижению удельной активности генома тимоцитов на 23,8%. Все эти нарушения показывают, что под влиянием радиации в каждом из исследованных органов развивались характерные дезадаптационные расстройства, которые лежат в основе процессов дезинтеграции в работе этих регуляторных органов.

Профилактическое применение питьевой сульфатной МВ вызывало снижение уровня пострадиационных внутриклеточных нарушений в клетках гипоталамуса, эпифиза и тимуса. В большинстве исследованных нейронов паравентрикулярного ядра уменьшались ультраструктурные признаки дистрофии и усиливались процессы адаптивного характера. При этом практически отсутствовали нарушения в виде расширения межклеточных контактов, что было характерно для контроля, отмечалось также ослабление процессов вакуолизации цистерн эндоплазматической сети и снижение содержания псевдомиелиновых структур, улучшалось состояние митохондрий. В целом повышалась структурированность цитоплазмы нейронов. В этих условиях секреторная их функция по своей интенсивности достоверно превышала уровень контроля, но была ниже уровня интакта. Так, в мелкоклеточных нейронах происходило увеличение числа светлых везикул на 43,8% (МВ 6,67±0,92, контроль 4,64±0,59 (p<0,01), интакт 12,85±1,71), в крупноклеточных нейронах численность секреторных гранул возрастала еще больше — на 53,9% (МВ 7,07±0,28, контроль 5,93±0,27 (p<0,01), интакт 11,0±0,77) (рис. 1). Однако особенность этого процесса заключалась не только в увеличении числа секреторных гранул, но и в увеличении их средней площади (на 31,5%; p<0,01), т.е. гранулы становились более крупными. Следовательно, профилактическое применение питьевой сульфатной МВ в условиях радиации в большей мере, чем в контроле сохраняло синтез гормонов, который сочетался с замедленным выведением гранул, их укрупнением и накоплением в телах нейронов. Это стало возможным за счет предварительного развития адаптации и повышения устойчивости ультраструктур, обеспечивающих нейросекреторный процесс.

Рис. 1. Морфометрические показатели секреторной активности нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса при профилактическом применении питьевой сульфатной МВ с последующим радиационным облучением.

Светлые столбики — контроль; темные — группа МВ. Крупноклеточные нейроны: 1 — число гранул; 2 — средняя площадь гранул; мелкоклеточные нейроны: 3 — число везикул. * — p<0,01 — по сравнению с интактом; ** — p<0.01 по сравнению с контролем.

В пинеалоцитах, так же как и в нейронах гипоталамуса, под влиянием сульфатной МВ значительно реже обнаруживались расширения межклеточных пространств и почти полностью отсутствовали внутриклеточные псевдомиелиновые образования. Эти изменения развивались в результате различных адаптационных перестроек в клетках и свидетельствовали о более высокой устойчивости плазмолеммы, а также внутриклеточных мембран к действию радиации по сравнению с контролем. В этом отношении указанные сдвиги по своей выраженности были весьма сходными с адаптивными изменениями в нейронах гипоталамуса. Вместе с тем при этом в пинеалоцитах происходило увеличение доли АЭС на 14,8%, повышение числа вакуолей и уменьшение доли ГЭС на 55,4%. Кроме того, наблюдалось появление молодых форм митохондрий, однако общее содержание митохондрий на условную единицу площади клетки оказалось сниженным на 11,9% (рис. 2). В части клеток обнаруживалось увеличение числа лизосом и фагосом, иногда выявлялся секреторный КГ с умеренно расширенными цистернами. Все эти данные указывали на то, что под влиянием сульфатной МВ в пинеалоцитах на фоне снижения уровня дистрофических и дегенеративных процессов и улучшения в целом структуры клеточных мембран наблюдалось также и адаптивное ослабление биоэнергетических и синтетических процессов. По-видимому, в той или иной мере это может быть связано с фазностью развития адаптационных реакций в эпифизе, для которого характерны различия во внутриклеточной структуре пинеалоцитов в дневное и ночное время [14], что соответствовало периодам ослабления и активации процессов пролиферации ультраструктур. В целом процессы адаптации в эпифизе, связанные с процессами внутриклеточной регенерации, проявлялись явно слабее, чем в паравентрикулярном ядре гипоталамуса.

Рис. 2. Морфометрическая характеристика ультраструктур пинеалоцитов при профилактическом применении питьевой сульфатной МВ с последующим радиационным облучением.

Светлые столбики — контроль; темные — группа МВ. 1 — АЭС; 2 — КГ; 3 — ГЭС; 4 — митохондрии; 5 — лизосомы, аутофагосомы. * — p<0,01 — по сравнению с интактом; ** — p<0,01 по сравнению с контролем.

В тимусе профилактическое действие питьевой сульфатной МВ вызывало тенденцию к снижению относительной массы этого органа на 15,2%, но при этом происходило повышение численности ядер тимоцитов на 13,0%, что может указывать на тенденцию к усилению процессов анаболизма (рис. 3). При этом также возрастала и интенсивность связывания АО ядрами тимоцитов (на 62,5%), которая представляет собой процессы активации структур ядерного аппарата. По совокупности всех этих показателей отмечалось повышение удельной активности генома тимоцитов на 11,4% по сравнению с контролем, что является проявлением адаптационной перестройки и свидетельствует об усилении функциональной активности этих клеток, а, следовательно, и о повышении их устойчивости к действию радиации.

Рис. 3. Функциональная активность тимуса при профилактическом применении питьевой сульфатной МВ с последующим радиационным облучением.

Серые столбики — контроль; темные — группа МВ. 1 — относительная масса тимуса; 2 — число ядер тимоцитов; 3 — связывание акридинового оранжевого в ядре тимоцита; 4 — удельная активность генома тимоцитов.

Таким образом, результаты исследования показали, что общее однократное радиационное облучение в дозе 2 Гр вызывало в нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса и пинеалоцитах эпифиза ультраструктурные изменения, которые проявлялись в повышении проницаемости плазматических мембран, в расширении межклеточных контактов, процессах дистрофии и дегенерации органелл в виде псевдомиелиновых образований, причем на этом фоне в клетках тимуса происходило снижение активности генома. Одной из главных причин развития пострадиационных нарушений могло быть усиление перекисного окисления липидов, вызывающее дестабилизацию и разрушение мембранных структур, а также генетическую нестабильность клеток. Эти изменения нарушали взаимодействие между органами и клетками, в том числе ионную и механическую связь, что приводило к дезинтеграции в работе регуляторных механизмов и нарушению их функции. Профилактическое применение питьевой сульфатной МВ оказывало цитопротективное действие, которое проявлялось в снижении уровня пострадиационных нарушений и в более выраженном развитии изменений, характерных для адаптации. При этом повышалась стабильность и устойчивость плазматических и внутриклеточных мембран к действию радиации, что отражалось на их лучшей сохранности, о чем свидетельствовало отсутствие или значительное ослабление нарушений со стороны межклеточных контактов, увеличение количества относительно неизмененных («интактных») органелл, появление признаков внутриклеточной регенерации. В соответствии с этими сдвигами, можно полагать, происходила и перестройка внутриклеточных регуляторных механизмов, направленных на восстановление и развитие процессов интеграции. В конечном итоге эти адаптационные эффекты МВ наиболее наглядно проявлялись в достоверно более высоком уровне показателей синтеза и секреции гормонов в нейронах паравентрикулярных ядер по сравнению с контролем, в связи с чем можно сделать вывод о том, что гипоталамус проявлял наиболее высокую устойчивость к действию радиации, что, в свою очередь, отражалось и на функции интеграции этих клеток. Следует также выделить и усиление устойчивости клеток тимуса, учитывая при этом его повышенную чувствительность к радиации. Что касается эпифиза, органа с малой массой и многочисленными функциями, то в нем наблюдалось как усиление адаптации, так и ее ослабление, которое, видимо, в определенной мере связано с периодичностью его функций, что требует дальнейшего изучения. Развитие адаптации в исследованных органах регуляции было обусловлено антиоксидантным, мембраностабилизирующим и иммуномодулирующим действиями МВ на разные общие и местные регуляторные и функциональные системы организма, а также непосредственно на мембранные структуры клеток, что укрепляло их гомеостаз и предотвращало развитие процессов дезинтеграции. При этом в организме происходила и мобилизация дополнительных защитных резервов в разных клетках, тканях и органах, участвующих (заинтересованных) в противодействии патогенному фактору. В этом плане следует выделить важное значение печени, роль которой особенно возрастала при действии МВ в межорганных взаимодействиях, в процессах детоксикации и ускоренном выведении вредных метаболитов из организма, что создает благоприятные условия для развития адаптационных реакций (снижение уровня перекисного окисления липидов и активация антиоксидантной активности [2]) и может быть одним из проявлений перестройки процессов интегральной регуляции. Нужно также отметить, что ионный состав МВ, повышая резистентность клеток, оказался способным оказывать адаптационно-защитное влияние и на состояние генетического аппарата клеток, о чем свидетельствовали полученные данные о повышении удельной активности генома тимоцитов. Результаты проведенного сравнительного анализа позволяют считать, что адаптационные перестройки, развивающиеся в клетках гипоталамуса, эпифиза и тимуса при профилактическом действии питьевой сульфатной МВ приводят в той или иной степени к повышению устойчивости и механизмов интегральной (нейроиммунногормональной) регуляции к действию радиации, усилению их взаимодействия, что способствует более адекватной и координированной деятельности исследуемых центральных органов нейрогормональной и иммунной систем и повышению адаптивных возможностей организма.

Заключение

Анализ и обобщение результатов проведенных исследований показали, что питьевая сульфатная МВ обладает широким спектром возможностей в профилактике радиационных нарушений не только в органах-эффекторах, но и в центральных органах регуляции гомеостаза. Более высокий уровень профилактической адаптации и устойчивости к действию радиации проявлялся в нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса, слабее — в пинеалоцитах эпифиза и в клетках тимуса. Для повышения эффективности действия питьевой сульфатной МВ ее следует сочетать с другими адаптогенными факторами с использованием мягкого стимулирующего их действия. Полученные данные могут быть использованы для разработок новых современных методик с целью профилактики пострадиационных нарушений, а также принципов регуляции (управления) процессами адаптации с помощью лечебных физических факторов.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Королев Ю.Н.; сбор и обработка материала, статистическая обработка данных — Никулина Л.А., Михайлик Л.В.; написание текста и редактирование — Королев Ю.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.