Современная кераторефракционная хирургия включает целый арсенал методик, обеспечивающих высокую эффективность, безопасность, предсказуемость, а также стабильность клинико-функциональных результатов коррекции различных видов аметропий [1—5]. Последовательное совершенствование технологий коррекции от базовых методов PRK (Photorefractive keratectomy), Lasek (Laser-assisted subepithelial keratectomy), epi-Lasik (epipolis Laser in situ keratomileusis), Lasik (Laser-assisted in-situ keratomileusis) до технологий, использующих фемтосекундный лазер (ФСЛ) для формирования роговичного клапана, — FemtoLasik (Femtosecond Laser-Assisted Keratomileusis) или стромальной линзы ReLex SMILE (Small Incision Lenticule Extraction) — позволило снизить риск интраоперационных осложнений и повысить функциональные результаты лечения [6—8]. Однако ряд послеоперационных осложнений, в частности диффузный ламеллярный кератит (ДЛК), являются актуальной проблемой и в настоящее время [9—13]. Использование современных диагностических методов обследования — оптической когерентной томографии, конфокальной микроскопии, иммуногистохимических, иммуноферментных методов — позволяет по-новому оценить этиологические и патогенетические механизмы развития ДЛК, что в дальнейшем должно способствовать профилактике и выработке оптимальной тактики лечения этого осложнения.

Этиология диффузного ламеллярного кератита

Диффузный ламеллярный кератит также имеет названия «неспецифический диффузный ламеллярный кератит», «интерфейс-кератит», «синдром «пески Сахары» (Sands Of Sahara, SOS), так как при биомикроскопии картина ДЛК напоминает ландшафт пустынных дюн. Это осложнение было впервые описано в работах R.J. Smith и R.K. Maloney в 1998 г. как неинфекционно-воспалительная реакция, возникающая в интерфейсе в течение недели после проведения Lasik [14]. Частота случаев, регистрируемых на этапе становления эксимерлазерных технологий, составляла от 0,4 до 7,7% [10, 12, 15, 16], однако по мере накопления опыта и анализа причин осложнений процент возникновения ДЛК удалось снизить с 7,15 в 2007 г. до 1,7 в 2016—2018 гг. [17].

По мнению большинства исследователей, ДЛК — полиэтиологический процесс. Авторами выделены экзогенные и эндогенные причины: микроскопические частицы металла и масла микрокератома, силикон и тальк с хирургических перчаток, бактериальные эндо- и экзотоксины, слущенные эпителиальные клетки (при формировании лоскута микрокератомом), поврежденные лазерной и термической энергией стромальные клетки роговицы, эритроциты [11, 15—20]. К эндогенным факторам риска ДЛК относят наличие синдрома «сухого глаза», дисфункции мейбомиевых желез, хронических воспалительных процессов конъюнктивы и век [12, 13].

Интересна работа группы исследователей, анализирующих этиологические факторы возникновения ДЛК с помощью диаграммы Исикавы [21] — графического способа исследования и определения наиболее существенных причинно-следственных взаимосвязей между факторами и последствиями в исследуемой ситуации или проблеме. Все возможные причины воспалительного процесса объединены авторами в основные группы-факторы: оборудование, материалы, инструменты, лекарственные препараты, растворы, персонал и факторы окружающей среды. Такой структурированный подход позволил получить четкое представление обо всей хирургической логистике, способствовал выявлению «слабых» звеньев процесса, что привело к жесткому контролю за выполнением стерилизации хирургических инструментов и оборудования, соблюдением правил асептики пациентов и персонала, проверке используемых лекарственных препаратов. Ретроспективный анализ включал результаты 3698 операций Lasik (73,4% — с миопическим и 26,6% — с гиперметропическим профилем абляции). В контрольную группу включены пациенты без признаков ДЛК, эксимерлазерная коррекция у которых выполнена с идентичными составляющими: совпадали дата, время операции, методика эксимерлазерной коррекции, состав операционной бригады, материалы и оборудование. Интересен результат исследования: авторами не выявлено четкой взаимосвязи обозначенных этиологических факторов и развития ДЛК. По мнению ученых, перечисленные факторы являются лишь триггерами воспаления.

Патогенез диффузного ламеллярного кератита

Появление современных диагностических методов, позволяющих визуализировать морфологическую структуру роговицы и анализировать процессы, происходящие после эксимерлазерной коррекции, позволили по-иному взглянуть на этиопатогенетические механизмы развития ДЛК.

Патоморфологические изменения роговицы после эксимерлазерной коррекции методом Lasik

Работа N. Guo и соавторов, выполненная с помощью конфокальной микроскопии, — одно из первых клинических исследований, позволивших визуализировать морфологические изменения роговицы при ДЛК после эксимерлазерной коррекции с формированием роговичного лоскута с помощью механического микрокератома. Авторами выявлена активная воспалительная клеточная инфильтрация с признаками иммунного воспаления — мононуклеарные клетки в строме роговицы над и под зоной формирования роговичного лоскута [22].

Клиническим исследованиям предшествовали экспериментальные работы ученых [23, 24]. Так, N. Asano-Kato и соавторами представлены результаты иммуногистохимических исследований, свидетельствующие о повышенной экспрессии интерлейкина-8 (ИЛ-8) стромальными кератоцитами и инфильтрирующими нейтрофилами, что, по мнению авторов, и является предиктором ДЛК [23]. В работе M.V. de Rojas Silva и соавторов выполнение электронной и конфокальной микроскопии позволило выявить активную клеточную стромальную инфильтрацию, включающую нейтрофилы, эозинофилы и лимфоциты [24]. Таким образом, авторами высказано предположение об иммуноопосредованном характере воспаления при ДЛК. Дальнейшие исследования позволили детализировать морфологические изменения в строме роговицы после эксимерлазерной коррекции и углубиться в понимании процесса.

Сравнительная оценка патоморфологических, патофизиологических изменений роговицы после лазерной коррекции методами Lasik и FemtoLasik

Последующее совершенствование технологий лазерной коррекции, появление ФСЛ позволило исключить ряд осложнений, характерных для механических микрокератомов, что существенно повысило предсказуемость и безопасность лазерной коррекции аметропий. Однако на повестку дня встал вопрос о повреждающем воздействии энергии ФСЛ. Исследования показали, что высокие уровни лазерной энергии и последующее повреждение тканей, вызванное фотодеструкцией, накоплением пузырьков газа, могут привести к усилению воспалительной реакции и ДЛК [25—27]. Большинство исследователей указывали на большую частоту возникновения ДЛК после FemtoLasik (10,6—12,4%) [25—27]. Этот факт, безусловно, не мог подвергнуть сомнениям преимущества фемтосекундных технологий, но заставлял искать пути оптимизации процесса.

В экспериментальной работе M.V. Netto и соавторов проведен сравнительный анализ результатов формирования роговичного лоскута микрокератомом, ФСЛ с частотой 15, 30 и 60 кГц, а также была сформирована группа контроля с интактными роговицами животных [25]. Исследователями последовательно во всех группах выполнен TUNEL-анализ, используемый для идентификации и количественного определения апоптотических клеток. С целью уточнения морфологических изменений стромы роговицы после различных технологий лазерной коррекции выполнена электронная микроскопия, а также иммуногистохимические исследования, включающие определение пролиферативной активности по экспрессии Ki-67 и количественное определение моноцитов, экспрессирующих CD11b.

TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) анализ основан на использовании терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) — фермента, который катализирует прикрепление дезоксинуклеотидов, меченных биотином, флуоресцеином или другим маркером, к 3’-гидроксильным концам двухцепочечных разрывов ДНК. TUNEL-анализ с момента своего появления в 1992 г. претерпел несколько модификаций и в настоящее время является основной рабочей методикой определения апоптоза, так как направлен на верификацию основного феномена — распада ДНК [28]. Авторами выявлено статистически значимо большее количество TUNEL-положительных клеток по обеим сторонам интерфейса после формирования лоскута ФСЛ с рабочей частотой 15 кГц. В группах сравнения с формированием лоскута микрокератомом и ФСЛ с частотами 30 и 60 кГц не выявлено значимой разницы значений анализируемого параметра. Согласно данным литературы, ряд авторов указывают на относительную неспецифичность TUNEL-анализа, отмечая, что в ряде случаев метод выявляет клетки, ДНК которых повреждена не только в ходе апоптоза [29]. С целью верификации морфологических изменений в строме роговицы после различных методов формирования роговичного лоскута авторами была выполнена электронная микроскопия. Исследователями впервые установлено, что формирование лоскута с помощью микрокератома приводит к апоптозу стромальных кератоцитов, а воздействие ФСЛ вызывает преимущественно некроз кератоцитов, что является следствием повреждающего энергетического воздействия лазера. Авторами впервые выявлена и доказана прямая корреляционная взаимосвязь степени повреждающего воздействия и рабочей частоты ФСЛ.

Некроз кератоцитов потенцирует выработку большого количества провоспалительных цитокинов, что приводит к активной воспалительной клеточной инфильтрации стромы роговицы по обеим сторонам интерфейса. В качестве маркера воспалительной инфильтрации авторы использовали качественное и количественное определение моноцитов, экспрессирующих CD11b. Выполнение иммуногистохимического анализа позволило исследователям обнаружить CD11b-положительные моноциты вдоль всей границы роговичного лоскута независимо от способа его формирования. Статистический анализ выявил значимое увеличение количественных значений анализируемого параметра у пациентов после формирования роговичного лоскута ФСЛ, а также высокую отрицательную корреляцию количества моноцитов, экспрессирующих CD11b, и рабочей частоты ФСЛ.

Резюмируя результаты своей работы, авторы делают вывод, что использование высокочастотных лазеров позволяет уменьшить воспалительную клеточную инфильтрацию, представляющую собой клеточный иммунный ответ, и тем самым снизить вероятность развития DLK, что позволит сохранить очевидность преимуществ использования фемтосекундных технологий.

В работе других исследователей представлены результаты гистологических исследований и конфокальной микроскопии, также подтверждающие как характер повреждения кератоцитов (клеточный некроз), так и взаимосвязь низкочастотного фемтолазерного излучения с большей воспалительной клеточной инфильтрацией стромы вокруг интерфейса [30]. Подводя итоги, авторы делают вывод о том, что морфологические изменения в строме роговицы в результате формирования роговичного лоскута современными высокочастотными ФСЛ сопоставимы с изменениями, вызываемыми механическими микрокератомами.

Аналогичные результаты получены другой группой ученых: авторами представлен сравнительный анализ гистоморфологии роговиц (in vivo) после формирования поверхностного клапана с помощью механического микрокератома и ФСЛ [31]. В исследование включено 60 пациентов с миопическим профилем абляции, которые были разделены на подгруппы по способу формирования роговичного клапана. В 1-й подгруппе формирование клапана проведено с помощью микрокератома, во 2-й и 3-й — с помощью ФСЛ с частотой следования импульсов 60 кГц и 1 МГц соответственно. При выполнении конфокальной микроскопии авторы выявили отек экстрацеллюлярного матрикса, «активную» клеточную инфильтрацию по обеим сторонам интерфейса, независимо от способа формирования роговичного лоскута. После выполнения лазерной коррекции в интерфейсном пространстве визуализировано большое количество гиперрефлекторных микровключений разной оптической плотности: осколков режущей кромки лезвия микрокератома, слущенных эпителиальных клеток, продуктов клеточного распада, эритроцитов, содержимого бокаловидных клеток конъюнктивы и боуменовых желез. Однако итоги сравнительного анализа позволяют подтвердить наличие корреляционной связи рабочей частоты ФСЛ и степени воспалительной клеточной инфильтрации стромы роговицы. Таким образом, улучшение технических характеристик ФСЛ, а именно появление высокочастотных лазеров, позволяет не только формировать роговичные клапаны с гладкими, конгруэнтными интерфейсными плоскостями, но и уменьшать реактивный отек стромы роговицы и воспалительную клеточную инфильтрацию стромы по обеим сторонам интерфейса.

F. Paula и соавторы представляют результаты клинического ретроспективного исследования, включающего 419 пациентов (801 операция FemtoLasik с миопическим профилем абляции) [27]. Авторами не выявлена корреляция частоты возникновения ДЛК с параметрами лазерной коррекции: толщиной роговичного лоскута, глубиной абляции, величиной резидуальной стромы роговицы, что согласуется с результатами других исследователей [25]. В работе подтверждена прямая корреляционная связь возникновения ДЛК с энергетическим воздействием ФСЛ, а также с одним из параметров лазерной коррекции — диаметром роговичного лоскута, что также согласуется с результатами других авторов [21, 25, 26].

Интересна работа К.Б. Бурилова и соавторов, в которой исследователи представили сравнительный анализ концентрации провоспалительных цитокинов — ИЛ-1 и ИЛ-8 — в слезе у пациентов после миопической коррекции методами Lasik (1-я группа) и FemtoLasik (2-я группа) [32]. В контрольную группу вошли пациенты с миопической рефракцией без оперативного вмешательства. Известно, что ответом на любое повреждающее воздействие является активация синтеза биологически активных веществ (цитокинов, фактора некроза опухоли α, интерферонов, хемокинов), повышение уровня которых может отражать выраженность деструктивно-воспалительного процесса. Немногочисленность публикаций по данному вопросу обусловила актуальность работы исследователей. Авторами выявлено значимое повышение концентраций провоспалительных цитокинов у пациентов 1-й и 2-й групп, однако при сравнении концентрации анализируемых параметров не выявлено достоверной разницы в их значениях у пациентов после Lasik и FemtoLasik. Авторами не представлены технические характеристики используемой фемтолазерной установки, что, несмотря на актуальность работы, делает выводы общими и мешает объективной сравнительной оценке результатов исследования.

Сравнительная оценка патоморфологических, патофизиологических изменений роговицы после лазерной коррекции методами FemtoLasik и SMILE

Принципиально новым этапом совершенствования ФСЛ в кераторефракционной хирургии явилась разработка метода микроинвазивной фемтолазерной экстракции роговичной лентикулы через малый разрез (по технологии ReLEx SMILE — Small Incision Lenticule Extraction). Накопленный к настоящему времени клинический опыт в целом свидетельствует о достаточной клинической эффективности данной технологии, в том числе и с учетом отдаленных результатов [33—35]. Частота ДЛК составляет от 0,45 до 1,6%, что сопоставимо с результатами лазерной коррекции по технологии FemtoLasik за последние 5—7 лет [36, 37]. Однако исследования, представляющие сравнительный анализ морфологической структуры роговицы после FemtoLasik и SMILE, единичны. Согласно результатам экспериментальной работы Z. Dong и соавторов, выявлено статистически значимо меньшее количество TUNEL-положительных стромальных клеток роговицы после SMILE по сравнению с FemtoLasik, но результаты количественного анализа не были подтверждены результатами электронной микроскопии, позволяющей дифференцировать апоптоз и некроз стромальных кератоцитов [38]. Иммуногистохимические исследования включали определение пролиферативной активности по экспрессии Ki-67, а также количественное определение моноцитов, экспрессирующих CD11b. Авторами выявлено статистически значимо меньшее количество Ki67-положительных клеток и CD11b-положительных моноцитов в различные сроки после лазерной коррекции по технологии SMILE.

В работе другой группы ученых получен противоположный результат. В исследовании N. Luft и соавторов процессы регенерации после SMILE и FemtoLasik были изучены на модели донорского глаза. Авторы пришли к выводу об идентичности морфологических изменений после анализируемых методик лазерной коррекции [39].

Однако, учитывая небольшое число публикаций, требуется продолжение исследований в этой области.

Резюмирующими работами по этиопатогенезу ДЛК явились исследования S.E. Wilson и соавт. [25, 40—42]. Ранние работы S.E. Wilson посвящены патогенетическим аспектам процесса заживления после различных методик кераторефракционной хирургии. Автором представлен каскад иммуновоспалительных реакций, характеризующий процессы альтерации и регенерации роговицы после различных методик эксимерлазерной коррекции аметропий [25, 30, 41]. Итогом 20-летних исследований стала работа по патогенезу и методам лечения ДЛК [40, 42]. Автором определено, что ДЛК может возникать в разные сроки после всех ламеллярных операций на роговице, включая лазерный кератомилез in situ, микроинвазивную фемтолазерную экстракцию роговичной лентикулы через малый разрез, после передней, задней ламеллярной кератопластики. Пусковым моментом является повреждение эпителия во время или в различные сроки после ламеллярной хирургии (в результате травмы), что приводит к высвобождению различных провоспалительных цитокинов и факторов роста: ИЛ-1α, ИЛ-1β и фактора некроза опухоли α, эпидермального фактора и фактора роста тромбоцитов — из эпителия в слезу и строму роговицы, где они могут связываться с рецепторами кератоцитов. Эти цитокины непосредственно индуцируют апоптоз кератоцитов, тем самым инициируя сложный каскад иммуновоспалительных реакций. Кроме того, хемокины, высвобождаемые из поврежденных клеток эпителия и кератоцитов, обеспечивают миграцию моноцитов, гранулоцитов и лимфоцитов из лимбальной сосудистой сети в область поражения (в строму роговицы по обеим сторонам интерфейса) для фагоцитирования апоптотических и некротических клеточных фрагментов.

Вторым значимым фактором, инициирующим воспалительную клеточную инфильтрацию стромы вокруг ламеллярного интерфейса, является прямое повреждающее энергетическое воздействие ФСЛ, что наглядно продемонстрировано в ранних работах ученого. Однако в настоящее время используются лишь высокочастотные ФСЛ, и иммунологический ответ, оцениваемый реакциями пролиферации стромальных клеток, воспалительной инфильтрации зоны ламеллярного интерфейса, сопоставим с результатами лазерной коррекции с использованием микрокератома.

Заключение

Использование современных диагностических методов обследования — оптической когерентной томографии, конфокальной микроскопии, иммуногистохимических, иммуноферментных методов — позволяет оценить патофизиологические и патоморфологические изменения, происходящие в процессе альтерации и регенерации после кераторефракционных операций, определить ключевые звенья этиопатогенеза ДЛК, что будет способствовать как снижению процента осложнений хирургического лечения, так и оптимизации технологий эксимерлазерной коррекции.

Кроме того, в плане дальнейших исследований перспективной является высказанная отдельными авторами идея фармакологического контроля процессов раннего апоптоза стромальных кератоцитов с целью возможной регуляции процессов регенерации и улучшения клинических результатов лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.