Паштаев Н.П.

Чебоксарский филиал ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Поздеева Н.А.

Чебоксарский филиал ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Гаглоев Б.В.

АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития Чувашской Республики, Красная пл., 3, Чебоксары, Российская Федерация, 428003

Школьник Г.С.

ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Чебоксарский филиал, пр-кт Тракторостроителей, 10, Чебоксары, 428028, Чувашская Республика, Российская Федерация

Крестов Д.С.

ГАУ ЧР ДПО «Институт усовершенствования врачей» Минздрава Чувашии, ул. М. Сеспеля, 27, Чебоксары, 428018, Российская Федерация

Аль ДарраджиИ.

ГАУ ДПО «Институт усовершенствования врачей» Минздрава Чувашии, Чебоксары, Россия

Влияние краткосрочной инсулинотерапии на концентрацию сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-A) во внутриглазной жидкости в эксперименте

Журнал: Вестник офтальмологии. 2020;136(3): 59-63

Просмотров : 30

Загрузок : 7

Как цитировать

Паштаев Н. П., Поздеева Н. А., Гаглоев Б. В., Школьник Г. С., Крестов Д. С., Аль Дарраджи И. О.Х. Влияние краткосрочной инсулинотерапии на концентрацию сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-A) во внутриглазной жидкости в эксперименте. Вестник офтальмологии. 2020;136(3):59-63. https://doi.org/10.17116/oftalma202013603159

Авторы:

Паштаев Н.П.

Чебоксарский филиал ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Все авторы (6)

Заболеваемость сахарным диабетом (СД) в настоящее время приобрела характер глобальной эпидемии с высокой смертностью. которая поражает население не только высокоразвитых стран, таких как США, Великобритания, Германия, но и развивающихся стран, включая Китай, Индию, страны Южной Америки и Африки [1—5]. По расчетам, к 2040 г. из 600 млн пациентов с СД 400—500 млн будет приходиться на страны с низким и средним уровнем дохода [6].

Диабетическая ретинопатия (ДР) является наиболее частым микрососудистым осложнением СД. Она развивается при длительной продолжительности СД и связана с недостаточным контролем уровня гликемии, артериального давления и липидного статуса [7]. В ряде исследований доказано, что строгий контроль уровня гликемии снижает частоту и прогрессирование ДР [8]. Длительная инсулинотерапия способствует стабилизации ДР и заметному снижению риска ее прогрессирования [9, 10].

Тем не менее клинические исследования показывают, что заместительная инсулинотерапия вызывает транзиторное усугубление ДР у пациентов с СД 1-го и 2-го типа [9, 11—13]. Механизмы, лежащие в основе транзиторного усугубления ДР на фоне инсулинотерапии, остаются поводом для дискуссии.

Цель настоящего исследования — изучение влияния инсулинотерапии в течение 1 мес от ее начала на концентрацию сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-A) во внутриглазной жидкости (ВГЖ) крыс с аллоксановой моделью СД.

Материал и методы

Эксперимент выполнен с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества и Хельсинкской декларации, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для моделирования СД были использованы 80 беспородных крыс со средней массой тела 256,07±24,12 г (180—335 г). Всех животных содержали в виварии в индивидуальных клетках на стандартном рационе питания со свободным доступом к воде. У 65 крыс моделировали аллоксановую модель СД однократным внутрибрюшинным введением аллоксана гидрата (La Chema, Чехия) в дозе 100 мг/кг в 0,4 мл раствора цитратного буфера. Оставшиеся 15 здоровых крыс составили контрольную группу.

Поскольку диабетогенное действие аллоксана более активно проявляется у животных, находящихся на предварительной диете, все животные в течение 24 ч до начала эксперимента не получали пищу, но имели свободный доступ к воде.

При планировании дизайна эксперимента мы учитывали трехфазную реакцию организма на введение подопытным животным аллоксана моногидрата, заключающуюся в первоначальном повышении уровня сахара крови, достигающем максимума через 2—4 ч после введения препарата, которая сменяется фазой гипогликемии продолжительностью 15—20 ч. Если лабораторное животное в эту фазу не погибает, то возникает вторичная гипергликемия, свидетельствующая о развитии СД. Поэтому установление диабетического статуса и старт инсулинотерапии проводили через 7 дней после внутрибрюшинного введения аллоксана моногидрата.

За первые 7 дней после введения аллоксана моногидрата погибло 20 крыс. В исследовании осталось 45 экспериментальных животных с СД и 15 здоровых крыс. Для установления диабетического статуса осуществляли контроль концентрации глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены.

Экспериментальных животных изучали в трех группах. Основную группу (1-я группа; n=21) составили животные с аллоксановой моделью СД, которым было начато ежедневное однократное внутрибрюшинное введение инсулина продленного действия в терапевтической дозе 0,9 Ед/кг массы тела. В группу сравнения (2-я группа; n=24) вошли животные с аллоксановой моделью СД, которые не получали специфическую терапию. Контрольная группа (3-я группа; n=15) состояла из здоровых животных, которые не получали специфическую терапию. Вместо инсулина животным группы сравнения и контрольной группы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.

Экспериментальные животные были выведены из исследования через 31 день после старта инсулинотерапии. К концу эксперимента контрольная группа по-прежнему насчитывала 15 крыс, основная группа — 17, группа сравнения — 20.

Из обоих глаз каждого животного был произведен забор ВГЖ в количестве 80—90 мкл, которые были помещены в индивидуальные пробирки Эппендорфа для последующего анализа. Концентрация VEGF-A определялась в лаборатории Чебоксарского филиала ФГАУ НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы ELISA Kit for Vascular Endothelial Growth Factor A (Cloud-Clone Corp., США).

Так как полученные цифровые данные не подчинялись нормальному распределению, статистическую обработку и выявление статистической значимости проводили непараметрическим методом при помощи критериев Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни с поправкой Бонферрони в программе IBM SPSS Statistics 20. Данные представлены в виде медианы (Me) [25-го; 75-го перцентилей].

Результаты

В основной группе (n=17) концентрация VEGF-A во внутриглазной жидкости составила 140 [136; 210] пг/мл, что в 1,94 раза выше, чем в группе сравнения (n=20; 72 [58; 86] пг/мл), и в 1,84 раза выше, чем в контрольной группе (n=15; 76 [62,5; 88] пг/мл; см. рисунок).

Концентрация VEGF-A во ВГЖ крыс в исследуемых группах через 31 день от старта инсулинотерапии, Me [25-й; 75-й перцентили]


При помощи критерия Краскела—Уоллиса были установлены статистически значимые различия исследуемых групп по концентрации VEGF-A во ВГЖ (pk<0,001).

Парные сравнения с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони показали, что значения концентрации VEGF-A во ВГЖ в основной группе были статистически значимо выше, чем в группе сравнения (pm—u<0,0004) и в контрольной группе (pm—u=0,0045). Группа сравнения не имела статистически значимых различий при сопоставлении показателей контрольной группы (pm—u=0,9979).

Обсуждение

Аллоксановая модель СД — одна из самых распространенных и изученных, она активно применяется исследователями по всему миру.

Аллоксан является структурным аналогом глюкозы, за счет чего он накапливается в B-клетках поджелудочной железы и приводит к их гибели с последующим развитием диабета. Поражению B-клеток сопутствуют дегенеративные изменения в почках и печени, что обусловливает высокую смертность лабораторных животных в 1-е сутки после введения аллоксана [14]. Более того, индивидуальная чувствительность к аллоксану животных одного и того же вида варьирует в очень широких пределах. Причины различной чувствительности в ответ на введение диабетогенных доз аллоксана определяются большим количеством факторов, в том числе возрастом, полом, состоянием нервной и эндокринной систем, характером обмена веществ, состоянием внутренних органов. В качестве примера можно привести работу Н.А. Пальчиковой и соавт. [15], в которой были исследованы гормонально-биохимические особенности аллоксановой и стрептозоциновой моделей СД у крыс. Авторы выявили высокую индивидуальную гетерогенность животных по реакции на введение аллоксана уже в 1-е сутки после введения препарата. За первые 5 сут исследования на фоне постепенного отказа от потребления воды и экскреции мочи погибли 31% подопытных животных.

Высокая смертность лабораторных животных является одним из недостатков данной модели СД, с которым мы столкнулись во время проведения эксперимента. Так, через 7 дней после внутрибрюшинного введения аллоксана моногидрата смертность лабораторных животных составила 30,8% (20 крыс), через 10 дней смертность составила 41,5% (27 крыс).

В патогенезе ДР лежит множество патологических процессов, из которых ключевыми считают оксидативный стресс, структурные изменения микроциркуляторного русла, гипоксию и экспрессию VEGF-A.

Y. Chen и соавторы in vitro на культуре эндотелиальных клеток крупного рогатого скота впервые показали, что оксидативный стресс и гипоксия через Wnt-сигнальный путь приводят к увеличению концентрации β-катенина в ядрах клеток. Высокие ядерные концентрации β-катенина через индуцированный гипоксией фактор 1a (HIF-1a) способствуют экспрессии VEGF-A [16].

VEGF-A — наиболее важный и хорошо изученный сигнальный белок. Наряду с другими белками он является частью системы, отвечающей за восстановление подачи кислорода к тканям при недостаточной циркуляции крови путем стимулирования ангиогенеза. VEGF-A играет одну из основных ролей в прогрессировании ДР, способствуя нарушению гематоретинального барьера и появлению новообразованных сосудов [17, 18]. Более того, в ряде экспериментальных работ на животных показано, что специфическое ингибирование VEGF предотвращает разрушение гематоретинального барьера и развитие неоваскуляризации [18—23].

V. Poulaki и соавторы доказали, что семидневная инсулинотерапия приводит к повышению уровня VEGF и HIF-1a у крыс со стрептозоциновой моделью СД, что приводит к клинически значимому нарушению гематоретинального барьера. Более того, было продемонстрировано, что инсулин-индуцированная экспрессия VEGF является HIF-1a-зависимой и осуществляется посредством p38 MAPK и фосфоинозитид-3-киназы (PI3Ks), тогда как экспрессия VEGF, индуцированная гипергликемией, является HIF-1a-независимой и осуществляется посредством протеинкиназы С и p42/p44 MAPK [19].

По всей видимости, инсулинотерапия увеличивает концентрацию VEGF-A, что может приводить к транзиторному усугублению ДР вплоть до проявлений нарушения гематоретинального барьера. Механизмы данного явления и его роль в клинической практике еще предстоит изучить более полно.

В данном исследовании мы продемонстрировали, что инсулинотерапия в течение 31 дня приводит к статически значимому повышению концентрации VEGF-A во ВГЖ in vivo у крыс с аллоксановой моделью СД. Более того, мы определили, что в вышеуказанные сроки развитие аллоксановой модели СД не приводит к статически значимому повышению концентрации VEGF-A во ВГЖ по сравнению со здоровыми животными.

Заключение

Инсулинотерапия в течение 1 мес вызывает увеличение концентрации VEGF-A во ВГЖ крыс с аллоксановой моделью СД.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ № 18-315-00029/18.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Г.Ш., Б.Г.

Сбор и обработка материала: Б.Г., Д.К., И.О.Х.

Статистическая обработка данных: Б.Г.

Написание текста: Б.Г.

Редактирование: Н.А.П., Н.П.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail