Оценка выраженности экспресии VEGF-A, SP-D и MUC-1 при отравлении баклофеном и его сочетании с этанолом

Баклофен (доступен также под торговыми названиями Баклосан, Лиорезал, Габлофен) — синтетическое бета-р-хлорфенильное производное гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), по химической структуре сходное с таким препаратами, как аминалон и фенибут [1, 2].

Баклофен — селективный агонист ГАМК-Б-рецепторов [3], стимуляция которых приводит к снижению выделения аминокислот, играющих ключевую роль в развитии спазма, — глутамата и аспартата. Этот процесс приводит к уменьшению силы сокращения скелетных мышц, снижению болевой чувствительности и появлению седативного эффекта.

Баклофен доступен в виде таблеток, предназначенных для приема внутрь, а также в виде раствора для внутриполостного введения через так называемую интратекальную помпу [1—3].

Показана эффективность баклофена при спастичности, развивающейся в результате повреждения спинного мозга и после инсультов. Препарат эффективен также у пациентов с детским церебральным параличом [1, 2].

Помимо седативного, анксиолитического и антидепрессивного действия для баклофена характерно развитие выраженного обезболивающего эффекта, который хорошо известен и описан в ряде работ [6, 7].

После перорального приема баклофен активно всасывается из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Его биодоступность составляет 70—80%, а время достижения максимальной концентрации в сывороке крови — 3 ч. В печени баклофен подвергается окислению и дезаминированию. Его основной метаболит — γ-[p-хлорфенил])-γ-гидроксимасляная кислота [4].

При терапевтическом применении баклофена возможно развития ряда побочных эффектов со стороны центральной нервной системы (сильные головные боли, появление галлюцинаций, снижение порога судорожной готовности), сердечно-сосудистой системы (снижение артериального давления, увеличение частоты сердечных сокращений), ЖКТ (сухость во рту, тошнота, рвота), дыхательной системы (развитие тахипноэ, одышки), выделительной системы (частое мочеиспускание, недержание мочи) [1, 2].

Действуя на дофаминовые рецепторы, баклофен вызывает выраженный психоактивный эффект, включающий развитие эйфории, деперсонализации, дереализации [8]. Обычно наркотическое опьянение наблюдается уже через 30 мин после применения препарата. Наркозависимые лица часто сочетают баклофен со слабоалкогольными напитками. При использовании препарата на постоянной основе уже через несколько недель может возникнуть психическая и физическая зависимость [9, 10].

С целью оказания эффективной медицинской помощи лицам, пострадавшим от отравления баклофеном, необходимо всестороннее изучение процессов, происходящих в организме. В случае отравлений с летальным исходом необходимо проведение дифференциальной диагностики от отравлений другими веществами и выявление непосредственной причины смерти.

Известно, что при отравлениях баклофеном одним из органов-мишеней являются легкие, поэтому изучение процессов, происходящих в этом органе, крайне важно для разработки комплекса лечебных мероприятий в нефатальных случаях, а в случае отравлений с летальным исходом полезно при установлении причины смерти.

Для изучения процессов, происходящих в легких, необходимо иммуногистохимическое (ИХГ) исследование с оценкой экспрессии сурфактантного белка D (Surfactant protein D, SP-D), муцина (Mucin, MUC) 1, фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor, VEGF) A.

MUC — это гликопротеины с молекулярной массой от 200 до 500 кДа, экспрессирующиеся на апикальной поверхности эпителиальных клеток ЖКТ, дыхательных и мочеполовых путей. Около 80% их массы составляют полисахариды, оставшиеся 20% приходятся на белковую часть, аминокислотная последовательность которой содержит значительное количество пролина, серина и треонина. Полисахариды, содержащиеся в MUC, играют важную роль в создании на поверхности эпителия муцинозного геля, который защищает клетки от негативных воздействий, таких как высыхание, изменение pH, воздействие загрязняющих веществ и проникновение микроорганизмов [13, 14].

В зависимости от своей структуры и выполняемых физиологических функций, выделяют секреторные и связанные с мембранами MUC. У человека известно более 20 MUC, среди которых наиболее подробно изучены MUC-1—4, MUC-5B, MUC-5AC, MUC-6 и MUC-7, в то время как MUC-8 и MUC-9 — хуже.

Белки VEGF — часть системы, направленной на восстановление подачи кислорода при недостаточной циркуляции крови. VEGF-A — это гликопептид с молекулярной массой 45 кДа. Он стимулирует рост новых сосудов, улучшает кровоснабжение тканей. У человека известно несколько различных изоформ VEGF-А, например VEGF-121, 145, 162, 165, 165b, 183, 189, 206, которые отличаются друг от друга по своему аминокислотному составу, способности к проникновению через биологические мембраны и способности связываться с гепарином [16]. Согласно данным литературы, уровень белка VEGF-A в крови повышается при бронхиальной астме, но снижается при сахарном диабете. В исследованиях in vitro показано, что VEGF способствует пролиферации эндотелия, выделенного из сосудов разных типов: вен, артерий, а также лимфатические сосудов [17]. В экспериментах in vivo показано, что VEGF усиливает ангиогенез [18].

Гидрофильный белок сурфактанта SP-D (группа III лектинов С-типа) отвечает за активацию механизмов врожденного иммунитета и участвует в первичной защите дыхательной системы от инфекций. Молекула SP-D имеет молекулярную массу 43 кДа и состоит из 4 коллагеновых тримеров, соединенных дисульфидными мостиками. Известно, что даже небольшое снижение уровня SP-D в бронхоальвеолярной жидкости ассоциировано с высоким риском респираторных инфекций, а повышение — с риском аллергических заболеваний [19].

Цель исследования — выявление экспрессии MUC-1, VEGF-A, SP-D в легких крыс в разные сроки после введения баклофена и его комбинации с этанолом.

В исследование было включено 35 половозрелых крыс-самцов линии Wistar в возрасте 20 нед с массой от 290 до 350 г. Животных разделили на 7 групп (по 5 особей в каждой). Эксперименты проводили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [20].

Эксперименты на животных проводили на базе ФГАОУ ВО «Российский Университет дружбы народов им. П. Лумумбы». Протокол исследования был рассмотрен и одобрен локальным этическим комитетом Медицинского института ФГАОУ ВО РУДН (протокол № 27 от 18.04.2024).

Животные 1, 3, 5-й групп получали баклофен в дозе 85 мг/кг. Животные 2, 4, 6-й групп получали баклофен в той же дозе и этанол в дозе 7 мл/кг (40% по об.). Животные группы контроля не получали ни баклофен, ни этанол. Животных из 1-й и 2-й групп выводили из эксперимента через 3 ч после его начала, когда концентрация баклофена в сыворотке крови была максимальна (С_мах). Животных из 3-й и 4-й групп выводили из эксперимента через 4,5 ч, когда в сыворотке крови была максимальной концентрация основного метаболита баклофена — β-[p-хлорфенил])-γ-гидроксимасляной кислоты. Животных из 5-й, 6-й и контрольной групп выводили из эксперимента через 24 ч. Эвтаназию проводили под общим наркозом хлоралгидратом (300 мг/кг внутримышечно) путем смещения шейных позвонков. Затем выполняли вскрытие грудной полости, извлекали легкие, фиксировали их в формалине и готовили парафиновые блоки согласно общепринятой методике. Далее подготавливали гистологические срезы толщиной 5 мкм и проводили ИГХ-окрашивание согласно прописанным стандартным протоколам.

При ИГХ-окрашивании использовали PAB039Ra01 поликлональное антитело к SP-D (крыса) (Cloud-Clone Corp., США) в разведении 1:150, PAA143Ra01 поликлональное антитело к VEGF-A (крыса) (Cloud-Clone) в разведении 1:200, PAA413Ra02 поликлональное антитело к MUC-1 (крыса) (Cloud-Clone) в разведении 1:200 и IS086-13 набор вспомогательных реагентов для ИГХ (со стрептавидин-пероксидазой, коза-анти-кролик) (Cloud-Clone).

Оценивали выраженность экспрессии MUC-1, VEGF-A и SP-D качественно («−» — экспрессия отсутствует, «+» — экспрессия слабо выражена, «++» — экспрессия умеренно выражена», «+++» — экспрессия сильно выражена).

Полученные препараты изучали при увеличении ×100, ×200 и ×400. Использовали микроскоп Nikon E-400 с видеосистемой на основе камеры Watec 221S.

В контрольной группе экспрессия MUC-1, VEGF-A и SP-D отсутствовала (рис. 1 на цв. вклейке). Во всех экспериментальных группах, кроме 6-й группы (баклофен и этанол, 24 ч), отмечали умеренную экспрессию («++») MUC-1 (эпителий бронхов, части альвеолярных ходов) (рис. 2 на цв. вклейке), SP-D (альвеолярный эпителий, бронхиальный эпителий) (рис. 3 на цв. вклейке) и VEGF-A (лейкоциты, эпителий бронхов и мелких бронхиол) (рис. 4 на цв. вклейке). В 6-й группе выявили сильную экспрессию («+++») MUC-1 (эпителий бронхов, части альвеолярных ходов) и VEGF-A (лейкоциты, эпителий бронхов и мелких бронхиол) (рис. 5 на цв. вклейке) и умеренную SP-D (альвеолярный эпителий, бронхиальный эпителий).

Рис. 1. Легкое крысы группы контроля.

Экспрессия MUC-1 отсутствует («−»), ув. ×200.

Рис. 2. Легкое крысы 1-й группы (баклофен, 3 ч), MUC-1.

Умеренная экспрессия в бронхиальном эпителии («++»), ув. ×200.

Рис. 3. Легкое крысы 3-й группы (баклофен, 4 ч), SP-D.

Умеренная экспрессия в бронхиальном и альвеолярном эпителии («++»), ув. ×200.

Рис. 4. Легкое крысы 5-й группы (баклофен, 24 ч), VEGF-A.

Умеренная («++») экспрессия в бронхиальном эпителии, эпителии альвеолярных ходов, лейкоцитах, ув. ×200.

Рис. 5. Легкое крысы 6-й группы (баклофен и этанол, 24 ч), VEGF-A.

Сильная («+++») экспрессия в бронхиальном эпителии, эпителии альвеолярных ходов, лейкоцитах, ув. ×200.

Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице.

Результаты ИГХ-исследования легких крыс после введения баклофена и его комбинации с этанолом

MUC-1 — гликозилированный трансмембранный белок, участвующий в формировании на поверхности эпителиальных клеток муциноподобного геля, обеспечивающего защиту последних от повреждений. Известно, что эпителиальные клетки дыхательных путей контролируют воспаление за счет гиперпродукции MUC-1 в ответ на продукцию интерлейкина (interleukin, IL). В норме MUC-1 оказывает регулирующее воздействие на работу ряда транскрипционных факторов и модулирует обмен веществ и устойчивость к внешним воздействиям. Усиление экспрессии MUC-1 приводит к угнетению передачи сигналов Toll-like-рецепторами и угнетению экспрессии IL-8, что обусловливает остановку митотического цикла и апоптоз [24]. В отличие от контрольной группы, усиление экспрессии MUC-1 отмечали во всех экспериментальных группах: как у получавших баклофен, так и его комбинацию с этанолом (умеренная экспрессия «++» в 1—5-й экспериментальных группах и сильная экспрессия «+++» в 6-й экспериментальной группе).

Известно, что при гипоксии MUC-1 индуцирует экспрессию проангиогенных факторов (в том числе и VEGF-A). VEGF-A действует на эндотелиальные клетки и вызывает целый ряд разнообразных биологических эффектов, например повышение проницаемости сосудов, индуцирование ангиогенеза, васкулогенеза и усиление митогенеза эндотелиальных клеток, стимулирование миграции клеток, ингибирование апоптоза [25]. Усиление экспрессии VEGF-A отмечали во всех экспериментальных группах, получавших баклофен и его комбинацию с этанолом (умеренная экспрессия «++» в 1—5-й экспериментальных группах, сильная экспрессия «+++» в 6-й экспериментальной группе). В то же время в группе контроля экспрессия VEGF-A отсутствовала («−»).

Сурфактантный белок SP-D является маркером поражения и индикатором контроля воспалительных процессов в легких. SP-D является одним из ключевых регуляторов функций альвеолярных макрофагов — основных клеток системы иммунитета в легких [26]. Усиление экспрессии SP-D отмечали во всех экспериментальных группах (умеренная экспрессия «++»), но не отмечали в группе контроля («−»).

В ответ на введение баклофена и его комбинации с этанолом отмечали повышенную экспрессию MUC-1, что является своего рода компенсаторной реакцией на повреждение легкого. В условиях гипоксии MUC-1 вызывает усиление экспрессии VEGF-A, что также наблюдали во всех экспериментальных группах. Экспрессия SP-D во всех экспериментальных группах также была повышена, что свидетельствует о повреждении легкого. Понимание процессов, происходящих в легких при введении баклофена и его сочетания с этанолом, необходимо для разработки эффективных лечебных мероприятий в случаях нефатальных отравлений этим веществом, а в случае отравлений с летальным исходом будет полезно при установлении непосредственной причины смерти.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.