Диабетическая ретинопатия (ДР) — специфическое позднее нейромикрососудистое осложнение сахарного диабета, развивающееся, как правило, последовательно от изменений, связанных с повышенной проницаемостью и окклюзией ретинальных сосудов, до появления новообразованных сосудов и фиброглиальной ткани. Эта патология является одним из проявлений генерализованной микроангиопатии [1].

Лечение пролиферативной диабетической ретинопатии (ПДР) на сегодняшний день представляет собой одну из наиболее актуальных проблем витреоретинальной хирургии. Витрэктомия является методом лечения с доказанной эффективностью при тракционных осложнениях ПДР, таких как гемофтальм, тракционная или тракционно-регматогенная отслойка сетчатки, тракционный диабетический макулярный отек (ДМО) [2, 3].

Объективным отражением происходящих в тканях патологических процессов служит изменение концентрации ряда специфических соединений — биологических маркеров, действие которых лежит в основе патогенетических реакций. Определение биомаркеров получило широкое распространение в медицине. Например, в онкологии повышение содержания некоторых биологически активных факторов может свидетельствовать о повышенном риске развития злокачественных новообразований [4]. Существуют различные методики выявления таких биомолекул.

К настоящему времени получил распространение мультиплексный анализ (multiplex assay), предоставляющий возможность одновременно обнаруживать несколько различных растворимых цитокинов в одном образце небольшого объема, что рассматривается как современная альтернатива иммуноферментному анализу (ИФА). Указанный метод базируется на использовании технологий проточной флуориметрии, микросфер из полистирола, маркированных красными и инфракрасными флуорофорами, лазерной детекции и цифровой обработки сигнала. Мультиплексный анализ представляет собой один из перспективных методов индивидуализации подходов к лечению различных патологий позволяя повысить чувствительность и специфичность диагностики [5].

Патогенез диабетической микроангиопатии исследован не до конца, и в этом отношении ДР — не исключение. Основным цитокином, ответственным за развитие неоваскуляризации, является сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) [6]. Однако, несмотря на внедрение в офтальмологическую практику препаратов — ингибиторов ангиогенеза и методики панретинальной лазеркоагуляции сетчатки (ПЛКС), не во всех случаях удается достичь ремиссии заболевания [7], что диктует необходимость дальнейшего изучения его многочисленных патогенетических звеньев.

В последние годы наблюдается повышение исследовательского интереса к ДР-ассоциированным молекулярным биомаркерам, обнаруживаемым в стекловидном теле и влаге передней камеры, что позволяет лучше понять патогенез и оптимизировать лечебные подходы при этой патологии [8, 9].

Цель исследования — выявить изменения содержания молекулярных биомаркеров витреальной полости у пациентов с ПДР в раннем послеоперационном периоде после 25Ga витрэктомии.

Материал и методы

В исследование вошло 24 пациента (24 глаза), из них 13 женщин и 11 мужчин. Средний возраст участников — 49,5±15,5 года; стаж сахарного диабета 18,8±6,5 года, содержание гликированного гемоглобина 6,9±2,4%. Всем больным верифицирован диагноз сахарного диабета 2-го типа, осложненного ПДР, требующей хирургического лечения по поводу тракционной отслойки сетчатки, субтотального или тотального гемофтальма, тракционного ДМО.

Критериями исключения были: проведенная ПЛКС или антиангиогенная терапия в анамнезе; авитрия; факоэмульсификация катаракты в срок менее 6 мес до момента включения в исследование; рубеоз радужки и вторичная глаукома; сопутствующие заболевания глаза, ассоциированные с неоваскуляризацией (например, экссудативная форма возрастной макулярной дегенерации, ретинальные венозные окклюзии). От всех пациентов получено письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Исследовательский протокол включал стандартные офтальмологические методы обследования: визометрию, пневмотонометрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, а также спектральную оптическую когерентную томографию (ОКТ) сетчатки до операции и через 1 мес после нее (томограф Spectralis, Heidelberg Engineering, Германия). Микроинвазивную (25Ga) субтотальную витрэктомию с интраоперационной ПЛКС в объеме 900 коагулятов на крайней и средней периферии сетчатки выполняли при помощи системы для витрэктомии Constellation Vision System (Alcon Laboratories Inc., США) со встроенным модулем для эндолазеркоагуляции PUREPOINT (длина волны 532 нм). Операцию заканчивали заполнением витреальной полости стерильным воздухом или физиологическим (0,9% NaCl) раствором. В качестве исследуемого материала использовали стекловидное тело (СТ), забор которого осуществляли на начальных этапах витрэктомии до активации инфузионной линии. Через 1 мес после операции проводили повторный забор биологического материала с одномоментным интравитреальным введением 0,05 мл препарата — ингибитора ангиогенеза с целью контроля пролиферации. Полученный биоматериал помещали в пробирки, центрифугировали, замораживали при −80 °C и в дальнейшем использовали для лабораторной диагностики.

На базе ФГБУ «НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» МЗ РФ в полученных образцах определяли концентрацию 48 биомаркеров: FGF basic, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-1ra, IL-1α, IL-2Rα, IL-3, IL-12 (p40), IL-16, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, GRO-α, HGF, IFN-α2, LIF, MCP-3, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IP-10, MCP-1, MIG, β-NGF, SCF, SCGF-β, SDF-1α, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNF-α, VEGF, CTACK, MIF, TRAIL, IL-18, M-CSF, TNF-β мультиплексным методом, применяя иммуноанализатор Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США) с использованием стандартной 48-плексной тест-системы Bio-Plex Pro^TM Human Cytokine Screening, 48-Plex (Bio-Rad). Полученные результаты обрабатывали в приложении Bio-Plex Manager v6.0 Properties (Bio-Rad).

Статистический анализ и оценку значимости различий выполняли в программном обеспечении SPSS v.26.0 (IBM Corporation). Характер распределения определяли при помощи критерия Колмогорова‒Смирнова. Данные представляли в формате Me (Q25%; Q75%), где Me — медиана, (Q0,25%; Q0,75 %) — межквартильный интервал (25-й — 75-й процентиль). При сравнении показателей выборок применяли непараметрические методы: U-критерий Манна‒Уитни (для независимых выборок), W-критерий Уилкоксона (для связанных выборок). Во всех случаях различия считали достоверными при достижении уровня значимости p<0,05. Величину корреляции рассчитывали с помощью теста непараметрической корреляции Спирмена, поскольку исследуемые показатели подчинялись закону распределения, отличающемуся от нормального. Полученные результаты расценивали как статистически значимые также при p<0,05.

Результаты

Общая характеристика пациентов по клиническим, лабораторным и инструментальным критериям представлена в табл. 1.

Таблица 1. Общая характеристика пациентов

Примечание. СД — сахарный диабет, ОКТ — оптическая когерентная томография, ETDRS — исследовательская группа по изучению раннего лечения диабетической ретинопатии (Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study), Me — медиана, n — число пациентов.

Через 1 мес после операции статистически достоверно увеличилась острота зрения (по шкале ETDRS) с 50,0 (25,0; 67,5) до 60,5 (45,7; 70,0) букв между связанными выборками по W-критерию Уилкоксона. Не выявлено значимых различий в показателе центральной толщины сетчатки (p=0,053), однако статистически достоверно уменьшился объем сетчатки в области фовеа с 10,7 (9,0; 12,7) до 9,4 (8,8; 11,7) мм³. В одном случае отмечено развитие рубеоза радужки в послеоперационном периоде.

При анализе содержания биомаркеров в витреальной полости до операции и через 1 мес после нее установлено достоверное снижение концентрации следующих факторов: bFGF, CTACK, Eotaxin, HGF, IL-1β, -1α, -4, -12 (p40), -16, -18, -2Rα, IP-10, MIG, SCF, SCGF-β, SDF-1α, MIF и M-CSF. Уровень VEGF также снизился с 132,3 (90,9; 161,7) до 96,8 (53,0; 133,6) пг/мл, однако различия не были статистически значимыми (p=0,307). Полученные данные суммированы в табл.2.

Таблица 2. Статистические значимые изменения уровней молекулярных биомаркеров витреальной полости

Обсуждение

В патогенезе ДР важную роль играет воспалительный процесс, что подтверждается повышением содержания провоспалительных цитокинов в витреальной полости у пациентов с ПДР [10]. Происходит активация иммунных клеток, индуцируется провоспалительный фенотип в клетках сетчатки и увеличивается выработка биомолекул с провоспалительной активностью мюллеровскими клетками. Одним из основных компонентов воспаления принято считать адгезию лейкоцитов к эндотелию микрососудов сетчатки (лейкостаз). На поверхности клеток эндотелия повышается экспрессия молекул адгезии и интегринов. В результате лейкостаза происходит гибель эндотелиальных клеток, появляются неперфузируемые капилляры, разрушается гематоретинальный барьер с просачиванием жидкости через стенку сосудов сетчатки, формируются участки ишемии [11].

В свою очередь, в ответ на ишемию нарастает концентрация проангиогенных факторов, что в конечном итоге обусловливает активацию неоваскуляризации и прогрессирование ДР до пролиферативной стадии, осложнения которой могут привести к необратимой потере зрения [12, 13]. У пациентов с осложненной ПДР уровень ведущего проангиогенного цитокина — VEGF (в частности, VEGF-A) [6] в СТ, по данным литературы, превышает аналогичный сывороточный показатель, что свидетельствует о локальной продукции этого фактора тканями глаза (перицитами, эндотелиальными, мюллеровыми и ганглиозными клетками) [14—16].

Данные относительно изменения содержания VEGF у пациентов с ПДР после витрэктомии противоречивы. Например, H. Itakura и соавт. [17] не обнаружили статистически значимого снижения уровня этого фактора в послеоперационном периоде в сроки от 5 до 36 сут, отмечая важность проведения ПЛКС на основании того, что VEGF продуцируется тканью сетчатки в условиях ишемии. Подобные результаты согласуются с полученными данными об отсутствии достоверного уменьшения уровня VEGF после операции. Однако авторы проведенного исследования выполняли ПЛКС перед операцией, что могло повлиять на результаты исследования. В то же время не указываются сроки и объем проведения данной процедуры. Кроме того, в этой работе отмечена высокая частота рубеоза радужки (6 из 17 глаз) и неоваскулярной глаукомы (3 из 17 глаз) в послеоперационном периоде, что существенно выше показателей в проведенном нами исследовании (рубеоз радужки в 1 из 24 случаев). Также во всех 17 случаях развился послеоперационный гемофтальм, потребовавший повторного вмешательства.

В противоположность описанному выше исследованию H.J. Chen и соавт. [18] отметили прогрессирующее снижение концентрации VEGF в витреальной полости после витрэктомии по поводу ПДР. При этом ПЛКС выполнялась авторами интраоперационно, а в послеоперационном периоде наблюдалось меньшее количество осложнений. Подобные расхождения можно объяснить неодинаковой тяжестью исходного состояния пациентов, а также различиями в дизайне исследования, в особенности касающимися сроков и объемов ПЛКС.

В настоящем исследовании ПЛКС проводилась интраоперационно в объеме 900 коагулятов; при этом не зафиксировано статистически значимого снижения уровня VEGF, однако медианные показатели в послеоперационном периоде были ниже исходных. Обобщая изложенное, нельзя с уверенностью высказаться о степени влияния витрэктомии на содержание VEGF в витреальной полости, но можно сделать предположение о том, что ПЛКС в большей степени влияет на содержание данного биомаркера.

Следует отметить, что в витреальной полости обнаруживаются и другие цитокины, влияющие на неоангиогенез. Данные метаанализа, посвященного молекулярным биомаркерам, выявляемым в витреальной полости у пациентов с ДР, показали наличие 11 различных факторов помимо VEGF, которые в перспективе могут служить новыми мишенями для лечения ПДР. В частности, при этой нозологии имеется возможность воздействия на фактор пигментного эпителия (pigment epithelium-derived factor, PEDF), тромбоцитарный фактор роста BB (platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB), рецепторы эритропоэтина -α и -β [19].

В настоящем исследовании выявлено достоверное снижение уровня основного фактора роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF), также являющегося проангиогенным соединением [20—22]. M.S. Pepper и соавт. (1992) продемонстрировали более мощную проангиогенную активность этого маркера in vitro в сравнении с VEGF. Более того, комбинация обеих молекул показала ангиогенный эффект, превышавший по выраженности аддитивный, что свидетельствует о стимулирующем взаимовлиянии обоих цитокинов [22]. Однако роль bFGF при ДР до настоящего времени изучена недостаточно.

В активации процесса неоваскуляризации имеет значение не только повышение концентрации проангиогенных факторов, но и одновременное снижение содержания антиангиогенных цитокинов, таких как фактор пигментного эпителия (PEDF) [23]. Ретинальная ишемия преимущественно развивается на периферии [24], а экспрессия генов PEDF клетками сетчатки в отличие от генов VEGF неоднородна и определяется в основном на периферии глазного дна [25], что также может способствовать нарастанию дисбаланса про- и антиангиогенных молекул, провоцируя неоангиогенез.

Помимо снижения концентрации провоспалительных (интерлейкины IL-1β, IL-1α, IL-12 (p40), IL-18) и некоторых проангиогенных факторов (bFGF; фактор роста гепатоцитов — hepatocyte growth factor, HGF) нами обнаружено уменьшение содержания антиангиогенных факторов. К ним можно отнести такие маркеры, как интерферон гамма-индуцируемый белок 10 (interferon gamma-induced protein 10, IP-10) — провоспалительный цитокин, продукция которого регулируется интерфероном-γ. Многочисленные исследования показали, что в патогенезе неоангиогенеза при ДР принимают участие некоторые провоспалительные факторы [26—29], например IL-1α, индуцирующий продукцию VEGF [30]. Нами продемонстрировано достоверное снижение концентрации IL-1α в послеоперационном периоде.

Роль СТ в патогенезе ДР также значительна. В аспекте хронического воспаления оно служит «буферной» зоной, в которой могут накапливаться гуморальные факторы, влияющие на процесс неоваскуляризации и проницаемость сосудов сетчатки [31, 32]. Это подтверждается данными нашего исследования, в ходе которого удалось выявить достоверное снижение концентрации провоспалительных соединений в витреальной полости в послеоперационном периоде.

Вызывает интерес выявленное снижение содержания гемопоэтических факторов: макрофагальный колониестимулирующий фактор — macrophage colony-stimulating factor, M-CSF; фактор стволовых клеток — stem cell factor, SCF; фактор роста стволовых клеток β — stem cell growth factor-β, SCGF-β; стромальный клеточный фактор 1α — stromal cell-derived factor-1α, SDF-1α. Их роль в патогенезе ДР изучена мало. Обнаружение этих соединений в витреальной полости может быть связано с наличием интравитреальных кровоизлияний, выявленных в данной работе в 41% случаев.

С клинической точки зрения возможно использование показателей молекулярных маркеров СТ в качестве прогностического признака исхода лечения. Так, у пациентов с высоким содержанием VEGF-А в СТ и сыворотке крови выше риск интраоперационных геморрагических осложнений [14]. По мнению J. Wang и соавторов, показатель концентрации VEGF-А в СТ может быть использован для прогнозирования результата витрэктомии у больных с тяжелыми формами ПДР [33], что подтверждается данными других исследований, выявивших сильные корреляционные взаимосвязи между уровнем VEGF-А, балансом про- и антиангиогенных факторов в витреальной полости больных с ПДР и исходами интравитреальных вмешательств [11—13]. Однако в проведенном исследовании мы не выявили достоверной связи между содержанием VEGF в витреальной полости до операции и морфометрическими показателями макулярной области и остротой зрения в послеоперационном периоде.

Заключение

СТ в патогенезе ДР служит не только матрицей для роста сосудов и стимулятором пролиферативных процессов за счет тракционного воздействия, но также и буфером для накопления различных биомаркеров, которые способствуют поддержанию хронического воспаления и пролиферации. В данном случае витрэктомия преимущественно влияет на снижение концентрации провоспалительных цитокинов. Необходимы дальнейшие исследования с целью уточнения роли биомолекул (помимо известного VEGF) в патогенезе ДР, в частности характера и степени их влияния на процесс неоваскуляризации и потенциальные терапевтические мишени.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Юсеф Ю., Петрачков Д.В.

Сбор и обработка материала: Петрачков Д.В., Барышев К.В.

Статистическая обработка: Барышев К.В., Матющенко А.Г.

Написание текста: Барышев К.В., Матющенко А.Г.

Редактирование: Юсеф Ю., Петрачков Д.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.