5-АСК — 5-аминосалициловая кислота

БК — болезнь Крона

ВЗК — воспалительные заболевания кишечника

ГКС — глюкокортикостероиды

ИНФ — инфликсимаб

МСК — мезенхимальные стромальные клетки

ЯК — язвенный колит

Патогенез хронических воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), обусловлен сложными взаимодействиями генетических, экологических, микробных и иммунных факторов. Возможность найти новые методы терапии может дать комплексный подход в изучении патогенеза данной патологии с позиций молекулярной микробиологии, иммунологии, иммунофизиологии, нейроиммунологии и генетики. Наиболее перспективным направлением в исследовании патогенеза ВЗК и в создании новой тактики их лечения считается изучение цитокинов, которые являются новыми мишенями для современной биологической терапии. Цитокины индуцируют и регулируют при заболеваниях органов пищеварения как местные, локальные (по аутокринному, паракринному типу), так и общие, системные реакции. К цитокинам системного действия относятся α-фактор некроза опухоли (α-ФНО), γ-интерферон (ИФН-γ), интерлейкины (ИЛ), -1β, -4, -6, -12. Секреция этих цитокинов приводит к запуску системной ответной защитной реакции организма, направленной на инактивацию, нейтрализацию повреждающих агентов, их разрушение и элиминацию.

При обострениях язвенного колита (ЯК) и болезни Крона (БК) повышается продукция ИЛ-1β, -6, -8, -15 и уменьшается синтез ИЛ-2. Обнаружено различие в реакции мононуклеарных клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишки на экспрессию этого цитокина.

У больных БК она резко повышена, в то время как у больных ЯК — резко снижена [1]. Одним из наиболее активных цитокинов с провоспалительным действием является α-ФНО. Его считают ключевым в процессе воспаления при БК. Этот цитокин существует в трансмембранной форме и форме растворимого тримера. Особо мощными индукторами α-ФНО являются бактериальные липополисахариды, которые при ВЗК в избытке содержатся в просвете толстой кишки. Очень важной функцией α-ФНО как провоспалительного медиатора является его участие вместе с ИНФ-γ и ИЛ-1 в формировании гранулематозного воспаления при БК [2].

У больных ЯК и БК наблюдается увеличение концентрации в крови компонентов комплемента СЗ, С4 и продуктов их расщепления (СЗс, C3d и C4d), что подтверждает роль системной активации комплемента в патогенезе этих заболеваний [3].

До настоящего времени концепция лечения ВЗК и других аутоиммунных заболеваний основывалась на раннем подавлении иммунного воспаления с помощью системных глюкокортикостероидов (ГКС). Однако у многих больных формируется стероидорезистентность и(или) стероидозависимость, развиваются вторичная надпочечниковая и гипоталамо-гипофизарная недостаточность, остеопороз и другие осложнения, вынуждающие искать иные способы лечения. Одним из них стало применение инфликсимаба (ИНФ) — химерных моноклональных мышиных антител к α-ФНО, соединенных с иммуноглобулином G1 человека (IgG1k).

ИНФ специфически связывает α-ФНО человека, причем не только обладает очень высоким сродством к растворимому тримеру ФНО, но блокирует и связанный с мембранами α-ФНО. Накопленный опыт свидетельствует, что ИНФ и другие ингибиторы провоспалительных цитокинов способны быстро купировать рецидив, обеспечивать длительную клиническую и эндоскопическую ремиссию, уменьшить потребность в ГКС у многих больных с гормонорезистентной и гормонозависимой формами БК и ЯК [4]. Однако длительная антицитокиновая терапия чревата развитием осложнений, связанных с мощным подавлением иммунной системы (обострение оппортунистических инфекций, развитие опухолей и т.д.).

Открытие в 70-е годы ХХ века А. Фриденштейном мезенхимальных стромальных клеток (МСК) положило начало новому направлению в терапии ВЗК. Эти клетки продуцируют определенные цитокины и факторы роста. К ним относятся ИЛ-6, -7, -8, -11, -12, -14, гранулоцитарный, макрофагальный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующие факторы [5]. Введенные в кровь экзогенные МСК также способны циркулировать в ней и оседать в различных тканях организма, избирательно накапливаясь в поврежденных участках и способствуя их репарации [6, 7]. МСК костного мозга человека являются гипоиммуногенными и могут рассматриваться как кандидаты для аллогенной клеточной терапии, что может быть более предпочтительно именно при аутоиммунных заболеваниях, так как МСК собственного организма не всегда способны купировать иммунопатологический процесс. Клетки, мигрируя в область воспаления по хемотаксическому градиенту, выделяют вещества, ингибирующие продукцию провоспалительных цитокинов, подавляют пролиферацию Т-клеток [8], что приводит к восстановлению иммунного равновесия [9]. МСК индуцируют супрессивное местное микроокружение путем продукции простагландинов и ИЛ-10, которые и создают иммуносупрессивную среду в ткани, подвергшейся иммунной агрессии. МСК могут также ингибировать некоторые функции В-клеток [10], естественных киллеров (NK-клеток) [11] и дендритных клеток [12].

Целью нашего исследования являлась оценка эффективности и безопасности лечения больных ВЗК с помощью трансплантации аллогенных МСК костного мозга, полученных от доноров, основанная на анализе уровня провоспалительных цитокинов в образцах крови.

Обследовали 44 больных с хроническим непрерывным и хроническим рецидивирующим течением ВЗК, находившихся на лечении в отделении патологии кишечника ЦНИИГ, из них 29 больных ЯК (19 мужчин, 10 женщин) и 15 — БК (7 мужчин, 8 женщин). Возраст больных составлял 17—68 лет, средний возраст — 37,4±2,0 года (M±σ). Диагноз верифицирован результатами клинических, лабораторных, инструментальных и гистологических исследований. В зависимости от проводимой терапии больные разделены на 3 группы. В 1-ю группу включены 16 больных, получавших ИНФ в дозе 5 мг на 1 кг массы тела по стандартной схеме (0, 2, 6, 8 нед и далее). Во 2-ю группу вошли 14 больных, которым проводилась комплексная противовоспалительная терапия с введением культуры МСК. За 2—3 дня до введения МСК больным отменяли азатиоприн и снижали дозу ГКС до 15—20 мг/сут. ГКС отменяли в отсутствие синдрома отмены в течение 6—8 нед. Дозу 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) оставляли на уровне 2 г/сут. В состав 3-й группы включены 14 больных, получавших стандартную противовоспалительную терапию препаратами 5-АСК 3—4 г/сут и ГКС 0,5—0,75 мг на 1 кг массы тела в сутки.

Концентрацию α-ФНО, ИФН-γ, ИЛ-2, -5, -8, -12, -15 определяли в сыворотке крови больных иммуноферментным методом с применением тест-систем протеиновый контур (Санкт-Петербург), BioSource (Австрия), BenderMedSystems (Австрия).

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Statistica 6.0, достоверность полученных величин определяли при помощи критерия Манна—Уитни—Вилкоксона.

В каскаде провоспалительных цитокинов ключевая роль принадлежит α-ФНО, обладающему воспалительной и иммунорегуляторной активностью. При воспалении этот цитокин стимулирует T1-хелперы и макрофаги, индуцирует системные реакции острой фазы воспаления с повышенным синтезом ИЛ-1, -2, -6, -8. Значительное повышение их уровней обусловлено выраженностью острофазового ответа и активностью ВЗК.

Индивидуальные колебания концентрации α-ФНО у обследованных больных составляли 30—1100 пг/мл. Пик концентрации α-ФНО в сыворотке крови больных с впервые выявленным ВЗК достигал 340—790 пг/мл, с длительным хроническим течением в отсутствие иммунодепрессантной терапии — 90—240 пг/мл. У больных с непрерывным и часто рецидивирующем течением заболевания, получавших иммуносупрессивную терапию, уровень α-ФНО не превышал 90 пг/мл.

Нами исследована динамика уровня α-ФНО у больных ЯК и БК под влиянием различных методов терапии — ИНФ, комплексной противовоспалительной терапии с применением МСК и стандартной противовоспалительной терапии. Выявлено, что средний исходный уровень α-ФНО у больных ЯК составил 76,5±8,7 пг/мл, после терапии ИНФ он достоверно снизился до 43,7±5,9 пг/мл (p<0,001); достоверное снижение уровня α-ФНО c 24,12±8,7 до 7,9±2,9 пг/мл отмечалось также после клеточной терапии и ГКС — c 60,1±20,0 до 27,0±9,5 пг/мл.

Средний исходный уровень α-ФНО у больных БК составил 110,75±35,2 пг/мл. После терапии ИНФ он достоверно снизился до 45,5±6,7 пг/мл (p<0,001); достоверное снижение уровня α-ФНО отмечалось также после клеточной терапии c 70,6±29,0 до 9,6±2,8 пг/мл и после терапии ГКС c 77,4±23,2 до 30,7±11,9 пг/мл.

Сравнивая полученные результаты, мы выявили, что достоверные различия по уровню α-ФНО между больными ЯК и БК после проведения антицитокиновой, клеточной и стандартной терапии отсутствовали. После терапии ИНФ у больных ЯК уровень α-ФНО составил 43,7±5,9 пг/мл, у больных БК — 45,5±6,7 пг/мл (p=0,56), после комплексной терапии с применением МСК у больных ЯК — 7,9±2,9 пг/мл, у больных БК — 9,6±2,8 пг/мл (p=0,33), у больных ЯК, получавших ГКС, — 27,0±9,5 пг/мл, у больных БК — 30,7±11,9 пг/мл (p=0,46). Учитывая, что α-ФНО является ключевым провоспалительным цитокином, участвующим в воспалительном каскаде у больных ВЗК, мы оценивали динамику уровня провоспалительных цитокинов под влиянием различных методов лечения, объединив больных ЯК и БК в одну группу — больных ВЗК.

Распределение больных по группам в зависимости от назначенного лечения указано выше. Концентрация α-ФНО в сыворотке крови у больных 1-й группы, получавших ИНФ, составляла 165,1±52,4 пг/мл и была в несколько раз выше, чем у больных, получавших МСК (2-я группа) и стандартную терапию 5-АСК и ГКС (3-я группа): 31,4±15,7 и 26,3±13,7 пг/мл соответственно (р<0,001). Это обусловлено тем, что в данную группу включались больные с наибольшей продолжительностью и высокой активностью заболевания, которые оказались рефрактерными к терапии препаратами 5-АСК и ГКС, а также иммуносупрессорами.

Влияние терапии на уровень α-ФНО и ИФН-γ отражено в табл. 1.

Исходный уровень ИЛ-2 во всех сравниваемых группах больных ВЗК был повышен (норма <50 пг/мл) и находился в прямой зависимости от степени активности заболевания. Более тесная связь выявлена с обострением БК (r=0,88; р<0,01), нежели с обострением ЯК (r=0,7; р<0,01). После лечения в группе больных, которые получали 5-АСК и ГКС, уровень ИЛ-2 достоверно снизился с 279,6±58,8 до 192,8±49,1 пг/мл (p<0,001). В группе больных получавших ИНФ, выявлено недостоверное снижение продукции провоспалительного ИЛ-2 с 158,1±54,4 до 135,3±31,3 пг/мл (р=0,103), после трансплантации МСК уровень ИЛ-2 незначительно снизился с 294,3±55,5 до 288±50,9 (p=0,764) (табл. 2).

Динамика уровня ИЛ-5 на фоне противовоспалительной терапии ВЗК представлена в табл. 2. Концентрация ИЛ-5 в период обострения в группе больных, получавших МСК и стандартную противовоспалительную терапию, была выше, чем у больных, которые получали ИНФ, причем наибольший его уровень отмечался в группе больных, получавших ГКС. Наименьший уровень ИЛ-5 в группе больных, получавших ИНФ, может быть связан с тем, что в данную группу включались больные ЯК и БК с более тяжелым течением заболевания. В свою очередь увеличение продолжительности заболевания, частоты рецидивов, высокая активность процесса обусловливали необходимость более частого применения высоких доз иммуносупрессоров. Следовательно, уменьшение уровня концентрации некоторых цитокинов, в частности ИЛ-5, можно расценить как результат угнетения функциональной, в том числе цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток, развитием вторичного иммунодефицита, а также ингибирующим эффектом интенсивной терапии антибактериальными препаратами, ГКС, иммуносупрессорами.

После лечения отмечалось достоверное снижение продукции ИЛ-5 у больных, которым проводилась системная трансплантация МСК, и у пациентов, получавших ГКС, с 43,7±13,1 до 28,4±3,7 и с 54,8±8,7 до 30,8±3,6 пг/мл соответственно (p<0,001). В группе больных, получавших ИНФ, несмотря на проводимую терапию, выявлено достоверное увеличение продукции ИЛ-5 с 30,6±4,2 до 38,1±3,2 пг/мл (p<0,001).

По данным проведенных исследований во всех сравниваемых группах в период обострения ВЗК отмечалась повышенная концентрация провоспалительного хемокина ИЛ-8, причем наибольший его уровень отмечался в группе получавших ИНФ и ГКС (табл. 3).

ИЛ-12, являясь провоспалительным цитокином, образуется макрофагами, дендритными клетками и В-лимфоцитами под влиянием стимуляции бактериальными продуктами. Показано, что в исследуемых образцах сыворотки крови у больных ВЗК, получавших ИНФ, в стадии обострения отмечалась повышенная концентрация противовоспалительного ИЛ-12. Уровень ИЛ-12 в данной группе был повышен в 2 раза и более, в среднем до 145,5±27,0 пг/мл. После терапии ИНФ отмечалось достоверное снижение содержание ИЛ-12 с 145,5±27,0 до 28,8±9,4 пг/мл (р<0,001). Данное снижение сопровождалось клиническим улучшением течения как ЯК, так и БК, а также уменьшением активности воспалительного процесса. Содержание ИЛ-12 в сыворотке крови у больных, получавших МСК, до лечения составило 71,2±10,1 пг/мл, что было достоверно ниже, чем у получавших ИНФ (145,5±27,0 пг/мл; р<0,001). После системной трансплантации МСК уровень ИЛ-12 составил 28,1±8,8 пг/мл.

В группе получавших ГКС, несмотря на лечение больных ВЗК, концентрация ИЛ-12 достоверно повысилась с 53,8±17,9 до 94,5±45,3 пг/мл (p<0,05) (см. табл. 3). Изученные иммунологические параметры коррелировали с клиническим течением заболевания в период как обострения, так и ремиссии, что подтверждает точку зрения об участии ИЛ-12 в качестве одного из основных факторов воспалительного каскада при ВЗК.

На фоне противовоспалительной терапии ИНФ по мере уменьшения клинической активности ЯК и БК отмечалось достоверное снижение концентрации ИЛ-15 с 59,3±16,0 до 45,5±15,2 пг/мл (p=0,013). Анализ уровня ИЛ-15 у больных, получавших МСК, демонстрирует достоверное снижение с 111,4±42,5 пг/мл в стадии обострения заболевания до 62,8±22,6 пг/мл в период ремиссии (p<0,001). На фоне терапии препаратами 5-АСК и ГКС уровень ИЛ-15 практически не изменился: до начала терапии он составил 55,8±9,0 пг/мл, после — 55,2±6,5 пг/мл (p=0,73) (см. табл.3).

При анализе полученных результатов установлено, что содержание провоспалительных цитокинов максимально повышено у пациентов с впервые выявленным заболеванием, но снижается при терапии 5-АСК, ИНФ и достигает минимальных значений при длительном применении иммуносупрессоров. Базисная терапия при хронических ВЗК сопровождается у большинства больных достоверным снижением содержания цитокинов в сыворотке крови по сравнению с уровнем, предшествующим лечению. Эти данные отражают положительную динамику заболевания, улучшение показателей клинической, биохимической, морфологической активности, иммунного статуса, эффективность применяемой терапии.

Стойкое повышение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, -5, -8, -12, -15, ИНФ-γ, α-ФНО) на фоне терапии свидетельствует об отсутствии выраженных позитивных изменений, прогрессировании воспалительных, иммунопатологических процессов. Следовательно, обострения хронических ВЗК сопровождаются многократным увеличением содержания в сыворотке крови широкого спектра провоспалительных цитокинов, отражающих динамику патологического процесса. С нарастанием активности воспалительного процесса отмечалось повышение уровней провоспалительных цитокинов, что согласуется с данными литературы [15—17]. Повышение содержания этих цитокинов совпадало с обострением заболеваний, что может быть использовано для оценки активности ВЗК.

Выполненные нами исследования свидетельствуют об увеличении уровней провоспалительных цитокинов: α-ФНО, ИФН-γ, ИЛ-2, -8, -12, -15 в сыворотке крови больных ВЗК, указывая на участие этих цитокинов в механизмах развития данных заболеваний. Анализ динамики уровня провоспалительных цитокинов позволяет оценить как активность воспалительного процесса, так и эффективность проводимой терапии.

Несмотря на селективность действия ИНФ на α-ФНО, диапазон его биологического действия намного шире, а лечебный потенциал выше, чем у стандартных базисных препаратов. Терапия ИНФ, снижая уровень α-ФНО, приводит к снижению концентрации других провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, -2, -6, -8), способствуя тем самым уменьшению воспалительной активности ВЗК.

Трансплантация МСК также снижает уровень большинства провоспалительных цитокинов, уменьшая тем самым интенсивность иммунопатологических процессов одновременно с позитивной динамикой клинической картины заболевания.