Особенности локальной экспрессии генов мРНК про- и противовоспалительных цитокинов при доношенной беременности

Беременность является, по сути, иммунологическим «вызовом» организму женщины [1—5], в поддержании которой важную роль играет переключение типа иммунного ответа с изменением преобладания Th1 на Th2, что находит отражение в особенностях экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов.

Цитокины — важные участники процесса родов, и их роль в индукции физиологических родов, а также в патогенезе «больших акушерских синдромов» бесспорна [6, 7], однако не все аспекты их продукции и взаимодействия изучены. Внедрение современных молекулярно-биологических методов исследования позволяет приоткрыть эту завесу, а исследование экспрессии генов мРНК про- и противовоспалительных цитокинов при доношенной неосложненной беременности может послужить основой для выявления патогенетических звеньев осложнений гестации.

Большинство ядросодержащих клеток могут служить продуцентами цитокинов, но основными источниками служат нейтрофилы, моноциты, макрофаги и T-хелперы. За активацию или ингибирование уровня экспрессии цитокинов отвечают специфические факторы транскрипции, связь с клеточными рецепторами обусловливает передачу внутриклеточного сигнала и изменение экспрессии целого ряда генов [8—13].

В разные годы предложены различные методы исследования цитокинов: иммуноферментный, иммуногистохимический, а также метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), благодаря которому появилась возможность выявить локальную воспалительную реакцию по интегральной оценке транскрипционных профилей генов иммунного ответа и оценить ее интенсивность [10—16]. Было предложено определение референсных значений концентраций цитокинов в сыворотке крови, слюнной жидкости, влагалище, амниотической жидкости и иных локусах. Однако с учетом преимущественно локальных функций цитокинов у беременных наиболее целесообразно исследование непосредственно в плаценте и плодных оболочках, а, учитывая быстрое расходование и разрушение цитокинов, оптимальным методом следует признать исследование методом ОТ-ПЦР экспрессии генов мРНК анализируемых цитокинов.

Клетки плаценты обладают особенно высоким потенциалом экспрессии иммунологических факторов, обеспечивая сосуществование генетически чужеродных организмов при беременности — матери и плода [1, 2, 14, 17, 18]. Недостаточная продукция плацентой противовоспалительных цитокинов (TGFβ, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-15) или усиление продукции провоспалительных цитокинов с иммуностимулирующим эффектом (TNFα, ИЛ-1β) приводит к срыву адаптационных механизмов, обеспечивающих иммунологическую толерантность матери к чужеродным антигенам плода.

В плаценте, децидуальной, хориальной и амниотической оболочках содержатся практически все виды иммунокомпетентных клеток: макрофаги, дендритные клетки, T- и B-лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, которые принимают активное участие в формировании толерантности при беременности за счет сложных межклеточных взаимодействий как при непосредственном контакте, так и за счет цитокиновых коммуникаций, которые в начале беременности определяют механизмы ее поддержания и развития, а по завершении гестации инициацию и реализацию всех трех периодов родов.

Представленное проспективное одноцентровое исследование выполнено на клинической базе ФГБОУ ВО «СамГМУ» Минздрава России (ГКБ №1 им. Н.И. Пирогова). В него было включено 16 беременных с доношенной беременностью (37,0—41,0 нед), родоразрешенных путем кесарева сечения в плановом порядке (показаниями служили неправильное положение и предлежание плода, рубец на матке после предыдущего кесарева сечения).

Критериями исключения из исследования служили наличие до беременности сахарного диабета, гестационного сахарного диабета, нарушения плацентации, акушерские осложнения (преэклампсия, синдром задержки развития плода), острые и обострение хронических воспалительных заболеваний, в том числе кольпит, применение антибактериальной терапии во время беременности, первый период родов, нарушение целостности плодного пузыря.

Методом количественной ОТ-ПЦР выполнено определение уровня экспрессии генов мРНК провоспалительных (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, TNFα, ИЛ-17А, ИЛ-18, ИЛ-23, IFN-γ) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов. Материал для исследования брали из четырех локусов: мазок из цервикального канала, образцы околоплодных вод, плаценты и плодных оболочек у всех обследованных. Исследование проводилось на базе лаборатории молекулярно-генетических методов. Образцы плаценты и плодных оболочек забирали интраоперационно в стерильных условиях в пределах операционного поля с помощью конхотома с диаметром рабочей поверхности 9,4 мм. Образец плаценты брали на ¹/₂ расстояния от места прикрепления пуповины до наиболее отдаленной точки края плаценты с захватом участка из глубины плаценты (с предварительным отсечением амниона, хорионической пластинки и децидуальной ткани с материнской стороны), образец плодных оболочек — посередине расстояния между краем плаценты и внутренним зевом. Полученные образцы помещали в «эппендорфы» с транспортной средой. Околоплодные воды собирали специальным устройством для асептического сбора околоплодных вод (патент 198317 U1, 30.06.20).

Обработку полученных данных осуществляли с помощью программы MS Excel на основании данных, полученных с помощью прибора. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод ΔCq). Уровень экспрессии генов мРНК измеряли в относительных единицах (ОЕ), отражающих представленность транскрипта относительно нормировочного фактора, рассчитанного на основе уровня экспрессии мРНК референсного гена (В2М).

Перед началом исследования у всех включенных пациенток получено письменное согласие на участие в нем. Проведение исследования одобрено комитетом по биоэтике ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (протокол №207 от 20 мая 2020 г.). Расчет гестационного возраста плода выполнялся при первом УЗИ или по 1-му дню последней менструации.

Статистический анализ. Для оценки результатов исследования применены программы Statistica 10.0, SPSS 13. Количественные данные представлены в виде среднего (M) и стандартного отклонения (SD) при условии соответствия нормальному распределению, при несоответствии нормальному распределению — в виде медианы (Me) и верхнего (Q₁) и нижнего (Q₃) квартилей. Оценка соответствия нормальному распределению выполнена с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для сравнения количественных переменных по локусам (4 подгруппы) применен непараметрический критерий Краскела—Уоллиса, после чего при выявлении статистически значимых различий попарное сравнение проводилось с помощью критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони. Бинарные качественные переменные представлены в виде абсолютных частот и процентов, сравнение выполнено с помощью таблиц сопряженности, с применением критерия хи-квадрат (χ²) либо двустороннего точного критерия Фишера. Статистически достоверными считали различия при p<0,05.

Возраст обследованных женщин составил в среднем 28 лет [28; 34], медиана срока гестации равнялась 39,1 [39; 39,4] нед. Большинство пациенток были повторнородящими: в среднем на одну пациентку приходилось 2,53±1,81 беременности, первородящими были 33,33%. Особенности экспрессии генов мРНК цитокинов представлены на рисунке, на цв. вклейке.

Частота выявления экспрессии генов мРНК про- и противовоспалительных цитокинов (%) в цервикальном канале, околоплодных водах, плодных оболочках и плаценте при интактном плодном пузыре.

При доношенной неосложненной беременности цервикальный канал характеризуется 100% частотой экспрессии генов мРНК провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-18 и TNFα и противовоспалительного ИЛ-10, в плодных оболочках и плаценте данные транкрипты встречались также с высокой частотой. Экспрессия гена мРНК ИЛ-4 выявлена только в плодных оболочках у 4 (25%) из 16 и в плаценте — у 2 (12,5%) из 16 пациенток, а ИЛ-17 наблюдалась исключительно в цервикальном канале — у 2 (12,5%) из 16. Экспрессия генов мРНК ИЛ-23 наблюдалась в цервикальном канале в 13 (81,2%) из 16 наблюдений, в околоплодных водах — в 3 (25%) из 12, плодных оболочках — в 3 (18,7%) из 16 и плаценте — в 7 (43,7%) из 16.

Экспрессия генов мРНК ИЛ-6 не наблюдалась в околоплодных водах, однако почти у 50% обследованных присутствовала в других локусах: цервикальном канале — у 7 (43,8%) из 16 обследованных, плодных оболочках — у 6 (37,5%) из 16 беременных, плаценте — у 9 (56,2%) из 16.

Нами была проведена количественная оценка экспрессии генов иммунного ответа мРНК и изучено соотношение в разных локусах (таблица).

Количественные показатели экспрессии генов мРНК про- и противовоспалительных цитокинов в цервикальном канале, околоплодных водах, плодных оболочках и плаценте при доношенной неосложненной беременности

В цервикальном канале наблюдались свои ритмы экспрессии генов мРНК, значимо превышающие таковые в других локусах. Особенно это касалось таких провоспалительных цитокинов, как ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-18, TNFα. Учитывая, что мы имели дело с доношенной беременностью, можно столь высокую экспрессию провоспалительных цитокинов в цервикальном канале расценить как физиологический этап подготовки шейки матки к родам.

В околоплодных водах экспрессия мРНК большинства генов цитокинов отсутствовала или была выявлена в крайне низких количествах и значимо уступала экспрессии в цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте, что связано с низким количеством клеток — продуцентов генов мРНК исследуемых показателей в околоплодных водах.

При доношенной неосложненной беременности плацента характеризуется стабильной экспрессией всех изучаемых цитокинов, кроме ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-17. При сравнении по локусам показатели уровня цитокинов статистически значимо отличались друг от друга (p<0,05), исключение составили ИЛ-4, ИЛ-17, IFN-γ. По экспрессии большинства показателей плодные оболочки были сопоставимы с плацентой, наблюдалось соответствие экспрессии генов мРНК в плодных оболочках и плаценте, что свидетельствует в пользу их территориальной и иммунологической близости, а также синергичного действия клеток-продуцентов.

Максимальный уровень экспрессии генов мРНК ИЛ-1β наблюдался в цервикальном канале — 3625 [1270; 7464] ОЕ, промежуточное значение занимали околоплодные воды — 532,2 [310,0; 1115,6] ОЕ (p<0,05), минимальный уровень — в плодных оболочках и плаценте: 129,5 [47,8; 250,0] ОЕ и 61,3 [23,6; 121,9] ОЕ соответственно.

Для ИЛ-8, ИЛ-18 и TNFα ситуация была сходной. Максимум экспрессии ИЛ-8 отмечен в цервикальном канале — 2380 [1035,0; 3922,4] ОЕ, что статистически значимо отличалось от показателей околоплодных вод (49,2 [0,0; 150,9] ОЕ), плодных оболочек (29,6 [4,7; 102,5] ОЕ), плаценты (10,7 [6,6; 34,2] ОЕ), где различия между ними были статистически незначимы. Максимальный уровень экспрессии ИЛ-18 наблюдался в цервикальном канале — 2638,5 [634,0; 5205,4] ОЕ, превышая в сотни раз экспрессию в других исследуемых локусах, срединное положение занимает экспрессия в околоплодных водах (73,8 [16,3; 642,0] ОЕ), тогда как в плаценте и плодных оболочках это число составило 4,0 [1,6; 10,2] ОЕ и 5,2 [3,0; 16,3] ОЕ соответственно.

Уровень экспрессии ИЛ-10 во всех локусах был низким, с минимальным значением в околоплодных водах.

Основная экспрессия ИЛ-23 представлена в цервикальном канале — 4,2 [0,4; 12,9] ОЕ, уровень которой статистически значимо отличался от уровней в остальных локусах с медианой экспрессии, равной нулю.

Экспрессия IFN-γ наблюдалась преимущественно в плаценте — 10 (62,5%) наблюдений, и медиана составила 1,3 [0,0; 3,3] ОЕ, статистически значимые различия выявлены при сравнении экспрессии гена мРНК IFN-γ с таковой в цервикальном канале.

По данным литературы, продуцентами цитокинов в цервикальном канале являются материнские иммунокомпетентные клетки (макрофаги, моноциты, лимфоциты и фибробласты). В плодных оболочках клетки — продуценты про- и противовоспалительных цитокинов при доношенной беременности обнаружены в основном в клетках мезенхимального слоя амниона и трофобластов хориона [19, 20]. В околоплодных водах основными источниками цитокинов служат макрофаги и моноциты, мигрирующие из амниона преимущественно на воспалительные стимулы в плаценте (дендритные клетки, макрофаги, NK-клетки) [22]. Липополисахариды, пептидогликаны, зимозан, являющиеся основными компонентами клеточной стенки бактерий, считаются базовыми триггерами экспрессии генов мРНК ИЛ-1β и других провоспалительных цитокинов [8, 9]. Однако не только бактериальный компонент служит инициатором экспрессии цитокинов. Их активация происходит также в процессе асептического воспаления, связанного с программированной гибелью клеток (апоптозом), неизбежно возникающей в случае доношенной беременности при старении плаценты и плодных оболочек, а также в результате механического растяжения плодных оболочек. Соотношение и особенности экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов при неосложненной доношенной беременности в различных локусах остаются предметом дискуссии. ИЛ-1β является воспалительным медиатором, который может индуцировать выработку других медиаторов родов (ИЛ-6, ИЛ-8, TNFα, COX-2, PGE₂), что было продемонстрировано в систематическом обзоре E. Hadley и соавт. (2018) [22]. ИЛ-1β способствует адгезии лейкоцитов за счет увеличения экспрессии молекул адгезии. Большинство включенных в настоящий обзор статей подтвердило наличие белка и мРНК ИЛ-1β в плаценте и плодных оболочках и повышение его уровня при срочных родах и in vitro в ответ на наличие препаратов, имитирующих роды [22]. Провоспалительные цитокины играют важную роль в иммунной регуляции плодово-материнских коммуникаций в процессе имплантации, развития и роста плаценты, а также противодействии инфекционным факторам [23]. Члены семейства ИЛ-1 включают исследованные нами ИЛ-1β и ИЛ-18. По результатам проведенного исследования, экспрессия генов мРНК ИЛ-1β, ИЛ-8 и ИЛ-18 наблюдалась у всех обследованных пациенток во всех локусах и была выше по сравнению с экспрессией генов других цитокинов, причем максимум наблюдался в цервикальном канале, на втором месте были околоплодные воды, а в плаценте и плодных оболочках их уровень был минимален. Так как срок беременности у обследованных пациенток составил 37,0—41,0 нед, столь высокий уровень экспрессии свидетельствует о начале структурных изменений шейки матки на фоне доношенной беременности. При физиологическом течении беременности без родовой деятельности незначительная экспрессия генов мРНК ИЛ-1β, ИЛ-8 и ИЛ-18 поддерживается на плодных оболочках и в плаценте, но при этом их уровень в десятки раз ниже, чем в цервикальном канале. Результаты нашего исследования подтверждают данные литературы [21, 22].

ИЛ-23 является одним из основных цитокинов, запускающих иммунитет по пути Th1, вызывает пролиферацию T-клеток памяти и субпопуляции Th17, которые экспрессируют гены мРНК ИЛ-17. ИЛ-23 наблюдался в цервикальном канале у 81,3% обследованных, тогда как в других локусах экспрессия ИЛ-23 была минимальной. Однако при доношенной беременности ИЛ-17 выявлен только у 12,5% в цервикальном канале и отсутствовал во всех локусах фетоплацентарного комплекса. Согласно данным литературы ИЛ-23 и ИЛ-17 являются ключевыми цитокинами при аутоиммунных заболеваниях [12, 19, 24]. По нашему мнению, отсутствие экспрессии ИЛ-17 в тканях фетоплацентарного комплекса свидетельствует об интактности Th17 в клетках иммунной системы плода. Так, продуценты Th17 в основном представлены в слизистой оболочке матки, где они поддерживают иммунологический барьер для микробиоты, включая бактерии и грибы. Однако отсутствие экспрессии ИЛ-17 в клетках фетоплацентарного комплекса свидетельствует в пользу их инертности, возможно, из-за отсутствия активаторов экспрессии ИЛ-17, которыми являются продукты аутоиммунного и хронического воспалительного процесса [24]. Экспрессия генов мРНК ИЛ-17, по данным литературы, наблюдалась у беременных с преэклампсией, синдромом задержки роста плода, сахарным диабетом, преждевременными родами и признаками внутриматочного воспаления, а также была ассоциирована с ишемическими изменениями в плаценте [11, 12]. Таким образом, экспрессия генов мРНК ИЛ-17 в норме в структурах фетоплацентарного комплекса при доношенной беременности не наблюдается.

ИЛ-6 служит общеизвестным маркером интраамниотического воспаления, причем независимо от наличия или отсутствия микробного фактора [21], по данным литературы, была выявлена связь хориоамнионита с генетическим полиморфизмом ИЛ-6. Соответственно, экспрессия ИЛ-6 в околоплодных водах в норме нехарактерна, что подтверждено нашими результатами. По данным литературы, в цервикальном канале, в плодных оболочках и плаценте экспрессия генов мРНК ИЛ-6 ассоциируется как с воспалительным процессом инфекционного генеза, так и с инициацией родовой деятельности независимо от срока беременности. В нашем исследовании в цервикальном канале она выявлена у 43,8% пациенток, у 37,5% — на плодных оболочках, у 56,2% — в плаценте, т.е. на определенном уровне ИЛ-6 содержался как в цервикальном канале, так и в тканях, имеющих прямое отношение к плоду при доношенной неосложненной беременности, что подтверждают другие исследования [3, 25].

К противовоспалительным цитокинам относится фактор дифференцировки T- и B-клеток ИЛ-4. Повышение уровня ИЛ-4 в системном кровотоке отмечается преимущественно при развитии аллергических реакций. Это индуктор дифференцировки Th2 и альтернативной активации макрофагов в клетки макрофагов с фенотипом М2 с ингибированием классической активации макрофагов в клетки M1, обеспечивающий локальную иммуносупрессию за счет ограничения синтеза макрофагами провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, TNFα [26]. До сих пор нет однозначного мнения об особенностях экспрессии ИЛ-4 поздней плацентой при неосложненной беременности. По данным одних авторов, плацента продуцирует ИЛ-4 и предотвращает реакцию иммунной системы матери на антигены плаценты [27], повышение уровня ИЛ-4 связывают с плацентарной недостаточностью на фоне генитальной инфекции [28]. По другим данным [29], в плацентах в норме и при преэклампсии экспрессия генов мРНК ИЛ-4 не наблюдалась. Мы выявили экспрессию ИЛ-4 только у 4 (25%) пациенток и только в плодных оболочках и плаценте, в количественном отношении в тысячу раз ниже, чем экспрессия основных провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-18, TNFα). Мы считаем, что экспрессия гена ИЛ-4 при доношенной неосложненной беременности нехарактерна ни для цервикального канала, ни для тканей плаценты и плодных оболочек, и его выявление связано с частными изменениями, что подтверждают данные литературы [30]. В отличие от ИЛ-4 другой противовоспалительный цитокин ИЛ-10 представлен практически у всех обследованных в цервикальном канале, плодных оболочках и плаценте, хотя его уровень был в десятки раз ниже, чем провоспалительных цитокинов, но положительные корреляции имелись. Одновременно с активацией провоспалительного каскада происходит компенсаторный рост количества противовоспалительных субстанций, а именно ИЛ-10, который тоже продуцируется цитотоксическими клетками, моноцитами, макрофагами, а также T-хелперами (Th-1 и Th-2), по принципу обратной связи паракринным и апокринным путями, подавляя синтез провоспалительных цитокинов и пролиферацию иммунокомпетентных клеток [31]. Особая роль отведена ИЛ-10 в процессах сохранения беременности, снижение его уровня наблюдалось при преэклампсии, преждевременных родах [13, 30, 32], в нашем исследовании его низкую экспрессию можно объяснить завершающим этапом беременности.

IFN-γ обладает противовирусным, противопаразитарным и противоопухолевым свойствами. По данным R. Casazza и соавт. (2020) [34], IFN-γ плохо определялся в плаценте, но значительно экспрессировался в децидуальной ткани как при доношенной, так и при недоношенной беременности по данным иммуногистохимических исследований. В образцах плаценты его экспрессия была значительно снижена при доношенной беременности по сравнению с более ранними сроками. В нашем исследовании экспрессия IFN-γ наблюдалась преимущественно в плаценте и плодных оболочках, статистически значимо превышая ее в других локусах, а в цервикальном канале, наоборот, наблюдалась реже всего (3 из 16 наблюдений). По всей видимости, экспрессия в плаценте и плодных оболочках IFN-γ ингибирует выработку PTGS2, которая участвует в запуске родовой деятельности. В отсутствие потенциальных внутриклеточных патогенов в цервикальном канале и околоплодных водах экспрессия IFN-γ не происходит.

Таким образом, во всех изучаемых локусах наблюдается выраженная экспрессия провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-18, TNFα), максимальная в цервикальном канале, что мы склонны связывать с процессами созревания шейки матки перед родами. Экспрессия генов мРНК ИЛ-23 и ИЛ-17 отсутствовала в клетках фетоплацентарного комплекса, но наблюдалась в цервикальном канале в 81,3 и 12,5% наблюдениях соответственно. Экспрессия генов мРНК ИЛ-6 нехарактерна для околоплодных вод при доношенной неосложненной беременности. Экспрессия генов мРНК ИЛ-4 и IFN-γ характерна для плацент и плодных оболочек и отсутствовала в цервикальном канале. Разнонаправленная экспрессия цитокинов в цервикальном канале, околоплодных водах, плаценте и плодных оболочках связана с различным предназначением локусов: в цервикальном канале происходит привлечение иммунокомпетентных клеток с повышенной выработкой провоспалительных цитокинов; в свою очередь, плацента защищает плод от избыточного влияния провоспалительных цитокинов за счет экспрессии генов мРНК ИЛ-4 и IFN-γ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.А. Каганова, Н.В. Спиридонова

Сбор и обработка материала, статистическая обработка — М.А. Каганова

Написание текста — М.А. Каганова

Редактирование — Н.В. Спиридонова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — M.A. Kaganova, N.V. Spiridonova,

Data collection and processing, statistical processing of the data — M.A. Kaganova

Text writing — M.A. Kaganova

Editing — N.V. Spiridonova

Authors declare lack of the conflicts of interests.