Введение
Мужское бесплодие является важной медицинской и социальной проблемой. Значимость этой проблемы обусловлена не только высокой долей мужского фактора в структуре бесплодного брака, но и отсутствием единых и эффективных подходов к диагностике и лечению данного заболевания [1]. Несмотря на постоянную разработку отечественных и международных клинических рекомендаций, доля идиопатического бесплодия в структуре нарушений мужской фертильности остается, по-прежнему, достаточно высокой (40—60% по данным разных авторов) [2]. Однако даже при установлении генеза бесплодия возможности лечения этого заболевания крайне ограничены.
Среди основных консервативных методов преодоления мужской инфертильности можно выделить коррекцию негативных факторов образа жизни, лечение острых и обострений хронических воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы, гормональную терапию. Хирургические методы лечения бесплодия (за исключением случаев реконструкции семявыносящих путей при обструктивной азооспермии) представлены в основном оперативными пособиями при варикозном расширении вен мошонки (варикоцеле) [1—3].
С учетом изложенного одним из наиболее эффективных методов лечения мужского бесплодия можно считать экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) с введением сперматозоида внутрь яйцеклетки (ИКСИ). Данная технология позволила стать биологическими родителями миллионам мужчин по всему мира в таких ситуациях, когда ни консервативные, ни оперативные методы лечения не возымели эффекта [4]. Вместе с тем, несмотря на доказанную эффективность, пока нет достоверных данных о безопасности процедуры ИКСИ и отдаленных последствиях, т.е. о влиянии на здоровье ребенка [5].
Отдельным вопросом является непосредственное воздействие процедуры ИКСИ при мужском факторе бесплодия на исходы программ ЭКО. Трудности в интерпретации данных заключаются как в возможном самом негативном влиянии техники ИКСИ (например, повреждении веретена деления зрелого ооцита), так и в использовании сперматозоида с генетическими и структурными аномалиями. При тяжелых нарушениях сперматогенеза риск использования генетически аномального сперматозоида особенно высок [6]. Сперматозоиды мужчин с тяжелой степенью патозооспермии могут иметь не только структурные хромосомные аномалии, но и различные моногенные дефекты, влияющие, возможно, на исходы программ ЭКО.
Цель исследования — оценить влияние степеней патозооспермии на исходы программ ЭКО.
Материал и методы
Настоящая работа проведена в ООО «Клиника профессора В.М. Здановского» с 2019 по 2022 г. В исследование включены 185 бесплодных пар, проходящих лечение с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО). Средний возраст мужчин составил 36 лет. Средний возраст женщин — 33 года. Сформировано 2 группы. В исследуемую группу вошли 102 пары с мужским фактором бесплодия. Контрольную группу составили 83 бесплодные пары с нормальными показателями эякулята у партнера. Из исследования исключены женщины старше 40 лет, имеющие длительность лечения бесплодия более 2,5 лет и более 4 попыток ЭКО в анамнезе. Всем мужчинам проводилось стандартное обследование, исследование простаты (трансабдоминально) и органов мошонки с допплерографией, две спермограммы, выполненные согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения. По показаниям проводили исследование гормонального статуса (лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тестостерон) и генетическое обследование (кариотип, микроделеции AZF, носительство мутаций в гене CFTR). Не выявлены бактериальные или вирусные инфекции посредством бактериологических и молекулярно-биологических методов. На основании предложенной классификации (доступно по ссылке: https://disk.yandex.ru/d/yOf318M_5ptlWw) все мужчины исследуемой группы разделены по степени тяжести патозооспермии (легкая, средняя, умеренно-тяжелая, тяжелая степени и азооспермия) [7].
Коротко о принципах классификации. В основе лежит оценка качества эякулята по трем основным показателям: 1) концентрация, млн/мл; 2) подвижность, % (учитывали только прогрессивно-подвижные сперматозоиды, PR); 3) морфология по Крюгеру, %. Каждый показатель представлен 5 категориями, обозначенных латинскими буквами (n, a, b, c, d), где n — это норма, a, b, c, d — степени отклонения от нее по возрастанию. Таким образом, категория a соответствует незначительным отклонениям в концентрации, подвижности или морфологии, а категория d — самым тяжелым. Каждой категории присвоено определенное количество баллов. При подсчете степени тяжести патозооспермии баллы от всех трех показателей суммировали. В отдельную категорию выделена азооспермия, при наличии которой баллы не начисляли.
Подготовка эякулята для инсеминации
После разжижения при комнатной температуре (23 °C) и стандартного спермиологического исследования, согласно рекомендациям ВОЗ, эякулят центрифугировали в двойном градиенте плотности с помощью набора градиентов плотности для подготовки спермы Sil Select Plus («FertiPro N.V.», Бельгия) в течение 20 мин при 300g согласно инструкции производителя. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали с GMOPS («Vitrolife Sweden AB», Швеция) и повторно центрифугировали в течение 10 мин при 300g. Супернатант отбирали до конечного объема 4 мл.
Получение и подготовка материала после тестикулярной экстракции сперматозоидов (TESE) у мужчин с азооспермией
Процедуру TESE проводили с внутривенной седацией (Propofol 1%) и блокадой семенного канатика по Лорин—Эпштейну. Первоначально выполняли тонкоигольную пункцию и аспирацию содержимого придатков (PESA). При отсутствии сперматозоидов в аспирате продольным разрезом вскрывали оболочки яичка. С помощью пинцета забирали тестикулярную ткань и передавали в эмбриологическую лабораторию для исследования. Далее тестикулярную ткань измельчали на предметном стекле в чашке Петри с буфером с помощью скальпеля или маленьких ножниц. После визуализации сперматозоидов дальнейшую подготовку биоматериала проводили так же, как и при подготовке эякулята для инсеминации.
Контролируемая стимуляция яичников
Для стимуляции яичников использовали как менопаузальные гонадотропины (Menopur «Ferring», Германия), так и рекомбинантный ФСГ (Gonal-«Merck Serono S.p.A.», Италия; Elonva «Organon», Нидерланды). Суточное мониторирование роста фолликулов осуществляли с помощью ультразвукового контроля. Индукцию овуляции вызывали внутримышечным введением 10 000 МЕ человеческого хорионического гонадотропина (Pregnyl «Organon», Нидерланды). Трансвагинальную пункцию фолликулов проводили через 36 ч с момента назначения триггера под внутривенной седацией (Propofol 1%).
Эмбриологический этап процедуры экстракорпорального оплодотворения
Стандартную процедуру инсеминации проводили во всех случаях при нормозооспермии. В исследуемой группе инсеминацию выполняли методом ИКСИ за исключением трех случаев легкой патозооспермии, когда стандартное ЭКО комбинировали с ИКСИ. Оплодотворение оценивали на следующий день по наличию двух пронуклеусов. Культивирование эмбрионов осуществляли в планшетном инкубаторе K-Systems («CooperSurgical», Дания) при 6% CO2 и 5% O2, при 37 °C. Использовали многоступенчатые среды («Vitrolife Sweden AB», Швеция). Оценку качества эмбрионов проводили по шкале Гарднера. Перенос эмбриона в полость матки выполняли на 3-и или 5-е сутки культивирования в зависимости от динамики развития эмбрионов. Криоконсервацию эмбрионов проводили на 5-е сутки с использованием сред и протоколов «Kitazato Corporation» (Япония).
Через 12 дней после переноса эмбриона женщина сдавала тест на хорионический гонадотропин. Уровень β-ХГЧ > 0 мМЕ/мл расценивали как показатель имплантации эмбриона. Маточную беременность выявляли по наличию плодного яйца в полости матки спустя 14 дней после положительного анализа на β-ХГЧ. Клиническую беременность подтверждали при выявлении сердцебиения плода при ультразвуковом исследовании спустя 5-7 недель после переноса эмбриона.
Статистический анализ данных выполняли в программах MS Excel и StatTech 2.4.8. Уровень p-value <0,05 считали статистически значимым.
Результаты
Первоначально сравнивали характеристики пациентов и исходы ЭКО в исследуемой (n=102) и контрольной (n=83) группах (табл. 1).
Таблица 1. Сравнительные характеристики пациентов и исходы экстракорпорального оплодотворения в исследуемой и контрольных группах
| Параметр | Исследуемая группа (n=102) | Контрольная группа (n=83) | p |
| Mean±SD | |||
| Возраст женщины | 33,31±3,74 | 34,22±3,20 | 0,099 |
| Возраст мужчины | 36,64±6,46 | 35,63±5,53 | 0,282 |
| Число проведенных ранее программ ЭКО | 1,43±0,80 | 1,22±0,66 | 0,017 |
| Число ооцитов | 11,95±8,00 | 11,26±9,01 | 0,194 |
| Число ооцитов MII | 9,58±6,94 | 9,16±7,07 | 0,525 |
| Число зигот (2pn) | 7,34±5,67 | 7,63±6,12 | 0,993 |
| Количество бластоцист* | 4,88±3,57 | 4,10±3,96 | 0,059 |
| Криопротокол, % | 43/102 (42,16) | 43/83 (51,81) | 0,191 |
| Отмена переноса, % | 2/102 (1,96) | 2/83 (2,41) | 1 |
| Кумулятивная частота имплантации, % | 66/100 (66) | 51/81 (62,96) | 0,671 |
| Кумулятивная частота наступления маточной беременности, % | 63/100 (63) | 48/81 (59,26) | 0,607 |
| Кумулятивная частота наступления клинической беременности, % | 56/100 (56) | 48/81 (59,26) | 0,659 |
Примечание. Данные представлены в виде Mean±SD. * — учитывали число бластоцист только высокого качества: AA, AB, BA (по классификации Гарднера). Непрерывные переменные — Mean±SD, категориальные переменные — n (%). Различия расценивали как статистически значимые при p<0,05. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение.
Как видно из представленных данных кумулятивная частота имплантации, наступления маточной и клинической беременностей в исследуемой и контрольных группах статистически не различались.
Далее проведен анализ исследуемой группы с целью установления предикторов успешности ЭКО (табл. 2).
Таблица 2. Предикторы частоты имплантации, наступления маточной и клинической беременностей в программах экстракорпорального оплодотворения
| Показатель | Частота имплантации | Частота наступления маточной беременности | Частота наступления клинической беременности | |||||||||
| n (%) | p | AUC | CI | n (%) | p | AUC | CI | n (%) | p | AUC | CI | |
| Количественные признаки* | ||||||||||||
| Возраст жены | — | 0,800 | 0,515±0,060 | 0,397—0,633 | — | 0,806 | 0,514±0,059 | 0,399—0,630 | — | 0,415 | 0,547±0,057 | 0,435—0,659 |
| Возраст мужа | — | 0,535 | 0,537±0,060 | 0,419—0,656 | — | 0,495 | 0,523±0,059 | 0,407—0,640 | — | 0,842 | 0,511±0,058 | 0,398—0,625 |
| Предыдущие программы ЭКО | — | 0,439 | 0,538±0,061 | 0,418—0,657 | — | 0,442 | 0,537±0,060 | 0,420—0,654 | — | 0,24 | 0,555±0,058 | 0,441—0,668 |
| Число ооцитов | — | 0,010 | 0,656±0,055 | 0,548—0,764 | — | 0,014 | 0,647±0,055 | 0,539—0,755 | — | 0,023 | 0,632±0,055 | 0,523—0,740 |
| Число ооцитов MII | — | 0,004 | 0,675±0,054 | 0,569—0,782 | — | 0,005 | 0,667±0,054 | 0,560—0,774 | — | 0,011 | 0,649±0,055 | 0,542—0,757 |
| Число зигот 2pn | — | <0,001 | 0,701±0,053 | 0,598—0,804 | — | 0,001 | 0,697±0,053 | 0,594—0,800 | — | 0,004 | 0,669±0,054 | 0,564—0,775 |
| Категориальные данные** | ||||||||||||
| Степень патозооспермии | ||||||||||||
| легкая+средняя | 28/35 (80) | 0,030 | — | 1,084—7,453 | 28/35 (80) | 0,010 | — | 1,311—8,965 | 23/35 (65) | 0,151 | — | 0,794—4,351 |
| умеренно-тяжелая + тяжелая | 29/51 (56,9) | 0,049 | — | 0,182—1,005 | 27/51 (52,9) | 0,034 | — | 0,175—1,940 | 25/51 (49) | 0,151 | — | 0,251—1,242 |
| азооспермия | 9/14 (64,3) | 1,000 | — | 0,281—2,984 | 8/14 (57) | 0,767 | — | 0,239—2,365 | 8/14 (57) | 1,000 | — | 0,337—3,303 |
Примечание. * — сравнение по количественному показателю выполняли с помощью U-критерия Манна—Уитни. Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода применили метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определяли по наивысшему значению индекса Юдена. ** — категориальные данные описывали с указанием абсолютных значений и процентных долей. Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполняли с помощью критерия χ2 Пирсона (при значениях ожидаемого явления более 10), точного критерия Фишера (при значениях ожидаемого явления менее 10). Различия расценивали как статистически значимые при p<0,05. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение.
Для поиска предикторов использовали метод анализа ROC-кривых. Статистически незначимым оказалось влияние на частоту имплантации, частоту наступления беременности и частоту замершей беременности таких показателей, как возраст жены (в исследование не включены женщины старше 40 лет), возраст мужа, число предыдущих попыток ЭКО (в исследование не включены женщины с более чем 4 попытками ЭКО в анамнезе).
В качестве статистически значимых предикторов имплантации и наступления беременности выявлены следующие показатели: число ооцитов (для имплантации — p=0,010, чувствительность и специфичность модели — 89,1 и 44,4% соответственно; для наступления маточной беременности — p=0,014, чувствительность и специфичность модели — 71 и 60,5% соответственно; для наступления клинической беременности — p=0,023, чувствительность и специфичность модели — 89,1 и 37,8% соответственно); число зрелых ооцитов MII (для имплантации — p=0,004, чувствительность и специфичность модели — 81,2 и 48,6% соответственно; для наступления маточной беременности — p=0,005, чувствительность и специфичность модели — 82,3 и 48,6% соответственно; для наступления клинической беременности — p=0,011, чувствительность и специфичность модели — 83,6и 45,5%, соответственно); число зигот 2pn (для имплантации — p<0,001, чувствительность и специфичность модели — 75,0 и 60,0% соответственно; для наступления маточной беременности — p=0,001, чувствительность и специфичность модели — 75,8 и 59,5% соответственно; для наступления клинической беременности — p=0,004, чувствительность и специфичность модели составили 76,4 и 54,5% соответственно).
Далее использована ранее предложенная классификация патозооспермии для дальнейшего поиска предикторов успешности ЭКО. Причем объединены легкая степень патозооспермии со средней, а умеренно тяжелая с тяжелой. Статистически значимой оказались корреляции легкой + средней степеней патозооспермии и умеренно и тяжелой + тяжелой с частотой имплантации (80 и 56,9% соответственно) и с частотой наступления маточной беременности (80 и 52,9% соответственно). Так, при легкой + средней степени патозооспермии кумулятивная частота имплантации составила 80% (28 из 35 женщин), а при умеренно тяжелой+тяжелой степени — 56,9% (29 из 51 женщины), p<0,005. Статистически значимых корреляций с частотой наступления клинической беременности не было.
Обсуждение
Данные о влиянии патозооспермии на оплодотворение, развитие эмбриона и исходы ЭКО являются противоречивыми. В работах ряда авторов отмечена худшая частота оплодотворения и качества эмбрионов в программах ЭКО со сниженными показателями эякулята по сравнению с нормальными [8, 9]. Однако в ряде исследований не выявлены статистически значимые связи между патозооспермией и исходами ЭКО [10, 11]. В настоящей работе мы также не получили статистически значимых различий в частоте имплантации и клинической беременности между группами с патозооспермией и нормозооспермией. В ряде исследований высказывалось предположение о повышенной частоте прерывания беременности на ранних сроках при ИКСИ по поводу мужского фактора бесплодия. В данной работе частота прерывания беременности в группе с патозооспермией оказалось несколько выше по сравнению с группой нормозооспермии, однако эти результаты не были статистически значимыми (p>0,005). Подобные противоречия могли быть связаны с отсутствием объективной оценки тяжести патозооспермии. Так, A. Mokánszki и соавт. выявили корреляции между низкой концентрацией сперматозоидов в нативном эякуляте и частотой анэуплоидий в них [12]. Получены данные о связи морфологии с индексом фрагментации ДНК сперматозоидов, что, по мнению A. Ferrigno и соавт., может являться причиной повторных неудачных попыток ЭКО [13]. В настоящем исследовании продемонстрировано влияние не самой патозооспермии, а ее тяжести на исходы ЭКО. Несколько сниженная частота имплантации и маточной беременности при умеренно тяжелой и тяжелой степени патозооспермии по сравнению с легкой и средней может быть объяснена наличием хромосомных аномалий и/или критическим числом разрывов ДНК в сперматозоидах. Вместе с тем не выявлено снижение частоты имплантации, частоты наступления маточной и клинической беременности при использовании сперматозоидов, полученных при PESA/TESE. Вероятно, это может быть связано с тем, что в большинстве случаев азооспермия носила обструктивный характер и не была связана непосредственно с нарушениями сперматогенеза.
Заключение
Проведенное исследование показало значимость предложенной классификации для клинической практики, т.к. она предлагает практический инструмент, позволяющий врачу прогнозировать исходы программ экстракорпорального оплодотворения при различных степенях нарушения сперматогенеза. Показано, что при легкой и средней степени патозооспермии результаты экстракорпорального оплодотворения сопоставимы с теми, что имеют место при нормозооспермии у партнера, что подчеркивает ведущую роль женских гамет в раннем эмбриогенезе при условии молодого возраста пациенток и сохранности овариального резерва. Вместе с тем при умеренной и тяжелой патозооспермии статистически значимо снижается частота имплантации эмбрионов и частота наступления маточной беременности, что обусловливает необходимость в проведении дальнейших исследований для оценки качества сперматозоидов при тяжелых формах нарушения сперматогенеза и разработки методов выбора наиболее полноценного сперматозоида при проведении процедуры интрацитоплазматической инъекции сперматозоида.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Назаренко Р.В.
Сбор и обработка материала — Бедник Д.Ю., Куликова О.Р.
Статистический анализ данных — Назаренко Р.В.
Написание текста — Назаренко Р.В.
Редактирование — Здановский В.М.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.