Введение

Моделирование септопластики у крыс приводит к развитию мощной стрессовой реакции. Имеются немногочисленные экспериментальные исследования, изучающие последствия операций, проведенных в области носа [1].

Стрессоры приводят к изменениям функционального состояния нейронов с возникновением в последующем морфофизиологических нарушений [2]. Особое внимание при стрессе уделяется гиппокампу, поскольку он очень чувствителен к различным повреждающим факторам [3, 4]. При повреждении нейронов, как и при повреждении других клеток, белок p53 является активатором транскрипции определенного набора генов-мишеней, тормозящим регуляторным фактором клеточного цикла и эффектором клеточных ответов на повреждение, включая остановку клеточного цикла и апоптоз [5]. Однако также было показано, что p53 обладает нейропротективным действием. Например, это было продемонстрировано на модели таупатии in vivo [6]. Белок p53 контролирует транскрипцию группы генов, участвующих в синаптической функции нейронов. Транскрипционный контроль p53 этих синаптических генов законсервирован в нейронах мыши и мозге человека [6]. Морфологически измененные нейроны после воздействия стрессоров могут иметь базофилию в окраске [3, 7]. Такие нейроны обычно называют темными нейронами. Они имеют специфические морфологические признаки: усохшую цитоплазму, сморщенное ядро с сегментированным хроматином и неровными границами, штопорообразный аксон [3, 7]. Считается, что в этих нейронах происходит апоптоз [8]. Однако не исключено, что темные нейроны способны восстанавливать свое морфофункциональное состояние при определенных условиях [7]. Однако исследования, оценивающие параллелизм экспрессии белка p53 в нейронах гиппокампа и появление там темных нейронов при моделировании септопластики у крыс, не проводились.

Цель настоящего исследования — определение роли хирургического стресса в формировании p53-позитивных и темных нейронов в гиппокампе, а также изучение параллелизма их образования в пирамидном слое гиппокампа.

Материал и методы

Хирургическое вмешательство. Работа была проведена на 20 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 250±20 г. Контрольную группу составили 5 крыс. В экспериментальную группу включили 15 крыс, которым за 10 мин до операции в целях общей анестезии внутрибрюшинно вводили раствор золетила 100 в дозировке 15 мг/кг. Моделирование септопластики проводили стандартным методом путем зигзагообразной скарификации слизистой оболочки полости носа (рис. 1, а) [9]. Животных содержали в специально оборудованном помещении, доступ в которое был ограничен. Интактные животные находились в клетках для индивидуального содержания. В эксперименте крыс-самцов использовали не ранее чем через 2 нед, в течение которых происходит адаптация к новым условиям содержания. Крысы получали стандартный рацион 1 раз в сутки при свободном доступе к воде. Все животные во время экспериментов находились в одинаковых условиях. Содержание крыс, моделирование септопластики, а также вывод животных из опыта осуществляли в соответствии с этическими нормами, установленными Женевской конвенцией «Международные принципы проведения биомедицинских исследований с участием животных» (Женева, 1990 г.).

Рис. 1. Схема проведения моделирования септопластики и расположение субполей гиппокампа крысы.

а — схема проведения моделирования септопластики (стрелками указано направление скарификации слизистой перегородки носа); б — расположение субполей гиппокампа крысы. Иммуногистохимическая реакция анти-p53. Докрашивание гематоксилином Майера. Ув. 3,5; в — расположение субполей гиппокампа крысы. Окрашивание по Нисслю.

Иммуногистохимическая и гистологическая оценка головного мозга. В экспериментальной группе крыс эвтаназию проводили на 2, 6 и 14-е сутки после операции по 5 особей путем введения летальных доз золетила 100. Фиксацию головного мозга как в контрольной, так и в экспериментальной группах осуществляли до трепанации черепа путем перфузии через сердце физиологического раствора, а затем 10% раствора формалина в течение 5—10 мин. После трепанации черепа головной мозг фиксировали аппликацией 10% раствором формалина, после чего извлекали и заключали в парафиновые блоки. Получали 8 срезов головного мозга во фронтальной плоскости толщиной 4 мкм с каждой крысы. Из них 4 среза окрашивали с помощью метода иммуногистохимии к белку p53 с докрашиванием гематоксилином Майера и 4 среза — толуидиновым синим по Нисслю. Окрашенные стекла заключали в специальную полимерную ленту.

Изучали субполя гиппокампа CA1, CA2, CA3 и зубчатую извилину (DG) (см. рис. 1, б, в). В пирамидном слое субполей подсчитывали количество нейронов, у которых была положительная реакция с антителами к белку p53 в цитоплазме, а также количество темных нейронов (рис. 2).

Рис. 2. Количество нейронов, у которых была положительная реакция с антителами к белку p53 в цитоплазме, а также количество темных нейронов.

P53-позитивные нейроны (б, г, е, з) (желтые стрелки, окр. мышиными моноклональными антителами к белку p53, ув. 400) и темные нейроны (а, в, д, ж) (голубые стрелки, окр. толуидиновым синим по Нисслю, ув. 400) в гиппокампе у крыс на 2-е (а, б), 4-е (в, г) и 6-е сутки (д, е) после моделирования септопластики.

Зелеными стрелками обозначены интактные нейроны.

Статистический анализ. Полученные данные подсчета клеток были представлены как среднее значение ± SE. Затем их сравнивали между данными подсчета нейронов в контрольной и экспериментальной группах с помощью t-теста с SPSS 21software.

Результаты

P53-позитивные нейроны. Согласно критерию Манна—Уитни в субполе гиппокампа CA1 количество p53-позитивных нейронов достоверно повысилось на 2, 4 (p<0,001) и 6-е сутки (p<0,05) после проведения моделирования септопластики, по сравнению с контрольной группой. В динамике пик роста экспрессии белка p53 в цитоплазме пирамидного слоя CA1 и CA2 гиппокампа пришелся на 2—4-е сутки после операции, а на 6-е сутки количество этих нейронов значимо снизилось (p<0,001). При этом в субполе CA2 на 6-е сутки по p53-позитивным нейронам экспериментальная группа не отличалась от контрольной (рис. 3, а). В пирамидном слое субполя CA3 на всех сроках после хирургического вмешательства была отмечена повышенная стойкая экспрессия в цитоплазме нейронов белка p53 по сравнению с контрольной группой (p<0,001).

Рис. 3. Динамика изменения количества p53-позитивных нейронов (p53) и темных нейронов при моделировании септопластики.

а — динамика изменения количества p53-позитивных нейронов; б — динамика изменения количества темных нейронов; * — достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p<0,001); ^ — достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p<0,05); ^† — достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p<0,001); ^‡ — достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p<0,05).

В зубчатой извилине у крыс экспериментальной группы по сравнению с интактными крысами количество p53-позитивных нейронов было значимо выше на всех сроках оценки. При этом пик численности этих клеток пришелся на 4-е сутки по сравнению с остальными постоперационными сроками (p<0,001) (см. рис. 3, а).

Темные нейроны. По количеству темных нейронов в пирамидном слое гиппокампа в экспериментальной и контрольной группах распределение данных было не Гаусово. Согласно критерию Манна—Уитни в пирамидном слое субполя CA1 количество темных нейронов на 2-е и 4-е постоперационные сутки достоверно не отличалось от контрольной группы, но на 6-е сутки после моделирования септопластики было отмечено снижение их количества (p<0,001) (см. рис. 3, б).

В субполе CA2 экспериментальной группы через 2 суток после операции было зафиксировано минимальное количество темных нейронов, по сравнению с 4-ми сутками (p<0,001). В субполе CA3 на 4-е сутки после операции наблюдался пик численности темных нейронов в пирамидном слое по сравнению с остальными периодами (p<0,001). В контрольной группе количество темных нейронов не отличалось от уровня 2-х суток, но было достоверно ниже по сравнению с 4-ми (p<0,001) и 6-ми (p<0,05) послеоперационными сутками (см. рис. 3, б).

В DG наблюдались аналогичные результаты, что и в субполе CA3. Так, на всех сроках у животных после септопластики количество темных нейронов было значимо больше, чем в контрольной группе (p<0,001). На 4-е сутки произошло резкое увеличение количества темных нейронов по сравнению со 2-ми сутками, а на 6-е сутки была зафиксирована отрицательная динамика (p<0,001).

Корреляция между p53-позитивными и темными нейронами. При сопоставлении количества нейронов, в которых белок p53 экспрессировался в цитоплазме, и количества темных нейронов, была обнаружена положительная сильная связь на всех сроках оценки и во всех субполях гиппокампа (рис. 4). Самый низкий R² был обнаружен при оценке субполя СА2 на 4-е сутки после операции (таблица).

Рис. 4 (а—е). Корреляция между количеством темных нейронов (DN) и p53-позитивных нейронов (p53) в подполях гиппокампа после моделирования септопластики.

CA1 (а—в), CA2 (г—е), CA3 (ж—т) и DG (к—м); а, г, ж, к — на 2-е сутки; б, д, з, л — на 4-е сутки; в, е, и, м — на 6-е сутки.

Рис. 4. Корреляция между количеством темных нейронов (DN) и p53-позитивных нейронов (p53) в подполях гиппокампа после моделирования септопластики.

CA1 (а—в), CA2 (г—е), CA3 (ж—т) и DG (к—м); а, г, ж, к — на 2-е сутки; б, д, з, л — на 4-е сутки; в, е, и, м — на 6-е сутки.

Коэффициенты детерминации при сопоставлении количества темных нейронов и p53-позитивных нейронов в гиппокамповой формации после моделирования септопластики

Обсуждение

Синтез белка p53 активируется при клеточном стрессе и повреждении ДНК. В зависимости от тяжести стресса и конкретного типа клеток он может способствовать адаптивным ответам на стресс, запускать остановку клеточного цикла или апоптоз [10]. В случае когда нормальные пролиферирующие клетки подвергаются повреждению ДНК, они реагируют остановкой клеточного цикла или апоптозом. Белок p53 участвует в обоих процессах [11]. Он является важным компонентом апоптоза нейронов [12]. Увеличение числа таких нейронов наблюдается при ишемии, черепно-мозговых травмах [13]. В ряде исследований было доказано, что p53 является частью биохимических процессов в клетке, вызванных активацией NMDA-рецепторов (N-метил-D-аспартат) и в конечном итоге приводящих к апоптозу [14].

Предполагается, что механизмы проапоптотического действия реализуются через индукцию экспрессии гена TP53 (белок p53), регуляция которого тормозит прохождение клеточного цикла из G1 в S-фазу, что блокирует деление раковых и опухолевых клеток [15]. Помимо широко изученной роли p53 как регулятора запуска апоптоза, также была продемонстрирована его нейропротективная роль [16]. Основной целью нейропротекции является предотвращение гибели нейронов в зоне ишемии, где апоптоз является одним из механизмов гибели нейронов. Биоэнергетические процессы замедляются в полутенях и остающихся в них нейронах, которые еще не погибли. В связи с этим отсутствие нейронов гиппокампа с явными морфологическими признаками апоптоза при анализе полученных в настоящем исследовании срезов может свидетельствовать о наличии нейропротективных свойств белка p53. Показано, что посттрансляционные модификации p53 могут способствовать дифференцировке нейронов, а также росту и регенерации аксонов [17].

Известно, что p53 является нейропротектором в модели таупатии in vivo [6]. Путем анализа чипа иммунопреципитации хроматина установлено, что p53 контролирует транскрипцию группы генов, участвующих в обеспечении синаптической функции. Генетические манипуляции с этими генами изменили нейротоксичность тау-белка. Авторы обнаружили, что как в нейронах мышей, так и в мозге человека транскрипционный контроль этих синаптических генов поддерживается за счет p53. Так, было высказано предположение, что обеспечение синаптической функции как проявление нейропротекции может осуществляться белком p53 [6].

Помимо активации гена TP53, NMDA-рецепторы участвуют в каспаззависимом апоптозе, повышая уровень ионов кальция и активность фермента каспазы-3. Этот фермент, в свою очередь, запускает образование темных нейронов и их последующую дегенерацию. При ингибировании каспаз ингибитором панкаспаз FK011 достигнуто уменьшение изменений, характерных для темных нейронов [18].

Ранее также было показано, что темные нейроны могут как восстанавливать свое морфофункциональное состояние за счет увеличения цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума с образованием мембранных завитков, переходом этого процесса в астроцитарные отростки и, как следствие, с последующим снижением степени структурного уплотнения клетки [7], так и быть признаком окончательного некротического распада клетки независимо от причины гибели нейронов, включая различные биохимические каскады апоптоза [8]. Существует мнение, что темные нейроны — результат окислительного стресса. Так, выявлено, что применение лютеолина после повреждения головного мозга in vivo снижает количество темных нейронов и окислительный стресс в них в гиппокампе [19]. Сообщается, что наличие регенерирующих темных нейронов в случае исследований на животных свидетельствует об уязвимости нейропротективных свойств нейроглии [20]. Наличие таких явлений, как усадка цитоплазмы и редукция поверхности в темных нейронах, ряд авторов сравнивают с проявлением признаков нейропластичности [21, 22]. На самом деле пластичность относится к уникальной способности мозга (нейрона) изменяться и реорганизовываться в ответ на изменения в окружающей среде. Это свойство нейронов способствует их жизнеспособности и, следовательно, выживанию организма [23]. Наиболее известными примерами пластичности нейронов являются образование новых синапсов, пролиферация дендритных шипиков, ретракция и упрощение дендритов, а также редукция дендритных шипиков в стрессовых условиях. Результаты некоторых исследований показали, что эндогенные или экзогенные стрессоры связаны со снижением поверхностных и дендритных спайков нейронов [24].

Высокие коэффициенты детерминации, обнаруженные в настоящем исследовании, подтверждают теорию о том, что наличие темных нейронов в гиппокампе и зубчатой извилине, скорее всего, тесно связано с экспрессией белка p53 во время хирургического стресса, вызванного моделированием септопластики у крыс. Вероятно, это связано с активацией NMDS-рецепторов в нейронах под влиянием хирургического стресса, так как было показано, что стресс приводит к увеличению содержания NMDA-рецепторов в дендритном спайковом аппарате [25]. Кроме того, воздействие большого количества глутамата способствует функциональным изменениям нейронов и последующему запуску программы апоптоза [26]. Известно, что стресс приводит к дегенерации дендритов нейронов гиппокампа [27]. В темных нейронах дендриты развиты слабо или практически отсутствуют в результате модуляции NMDA-рецепторов. Это было продемонстрировано на примере нейронов подполя CA3 в гиппокампе [28]. Кроме того, сообщалось, что хронический стресс вызывает атрофию пирамидного слоя подполя CA1 [29, 30], снижает долговременную потенциацию нейронов подполя CA1 гиппокампа [31] и вызывает апоптоз нейронов, а также снижение плотности дендритных отростков в нейронах области CA1 гиппокампа [32]. Таким образом, можно предположить наличие общего механизма, приводящего к запуску двух процессов, обсуждаемых в настоящей статье, — экспрессии белка p53 в цитоплазме и образования темных нейронов. Триггером этих путей, вероятно, является активация NMDA-рецепторов нейронов.

Морфологические изменения в гиппокампе подтверждаются нашими предыдущими исследованиями, показавшими, что имитация септопластики у крыс провоцирует развитие многих стрессовых реакций [33] и даже срыв адаптации [34]: увеличение количества темных нейронов [35], экспрессию белка p53 [3], значительный выброс кортикостерона в плазму крови [36] и усиление дегрануляции тучных клеток [37], нарушения баланса вегетативной нервной системы [38, 39], изменение поведения при тестировании крыс в открытом поле [9], появление тревожности и депрессивноподобного состояния [40].

Заключение

Моделирование септопластики у крыс приводит к запуску патогенетических каскадов, что, в свою очередь, изменяет морфофункциональные свойства нейронов пирамидного слоя гиппокампа и способствует их нейропластичности. Активация NMDS-рецепторов нейронов при стрессе, по-видимому, инициирует два пути жизнедеятельности нейронов — начало экспрессии белка p53 и образование темных нейронов. Оба пути могут в конечном итоге привести к апоптозу. Образование темных нейронов и экспрессия в них белка p53, скорее всего, взаимосвязаны и, вероятно, могут обеспечивать нейропротективные механизмы появления темных и p53-позитивных нейронов в гиппокампальной формации у крыс после моделирования септопластики является типовыми ответными реакциями нервной ткани на стресс. Очевидно, что экспрессия белка p53 связана с базофилией цитоплазмы нейронов, их морфофункциональным состоянием.

Предстоящие исследования должны определить роль белка p53 в дальнейшей судьбе поврежденных нейронов в пирамидном слое гиппокампа, дифференцировать механизмы его экспрессии, определить условия его нейропротективной функции.

Соблюдение этических норм

Содержание крыс, моделирование септопластики, а также вывод животных из опыта осуществлялись в соответствии с этическими нормами, установленными Женевской конвенцией «Международные принципы проведения биомедицинских исследований с участием животных» (Женева, 1990 г.).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.В. Кастыро, Г.В. Хамидулин, А.А. Цымбал, В.И. Попадюк:

Сбор и обработка материала — И.В. Кастыро, Г.В. Хамидулин, М.Г. Костяева, С.С. Шилин

Экспериментальное исследование — Г.В. Хамидулин, И.В. Кастыро, Ю.Е. Дьяченко, М.Г. Костяева, С.С. Шилин

Гистологическое исследование — Г.В. Хамидулин , И.В. Кастыро, Ю.Е. Дьяченко, М.Г. Костяева, С.С. Шилин

Статистическая обработка данных — И.В. Кастыро, А.А. Цымбал, С.С. Шилин

Написание текста — И.В. Кастыро, Ю.Е. Дьяченко, С.С. Шилин, В.И. Попадюк, П.В. Михальская , И.Б. ГАНШИН

Редактирование — И.В. Кастыро, П.В. Михальская, А.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.