Введение

Коронарный атеросклероз является ведущей причиной ишемической болезни сердца (ИБС) и ключевым фактором, ассоциированным с частотой сердечно-сосудистой смерти в нашей стране и мире [1, 2]. Поиск дополнительных методов ранней и неинвазивной диагностики и стратификации сердечно-сосудистого риска при коронарном атеросклерозе является важной научно-исследовательской задачей. В этом аспекте особенно актуально исследование циркулирующих биомаркеров, отражающих ключевые звенья патогенеза атеросклероза, среди которых важную роль играет хроническое воспаление. Системное воспаление способствует более тяжелой эндотелиальной дисфункции, повышению жесткости артерий, развитию атеросклероза и, в конечном итоге, повышению риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий [3]. Провоспалительные цитокины обусловливают патологическую активацию эндотелия, увеличивая экспрессию молекул адгезии, облегчая адгезию лейкоцитов и их инфильтрацию в стенку сосуда, что является важным механизмом в развитии атеросклероза [4]. В то же время действие цитокинов не всегда специфично, и точные механизмы регуляции процессов воспаления остаются недостаточно изученными [5]. Одним из направлений в изучении тонких механизмов, регулирующих интенсивность воспаления, является анализ ферментов каспаз. Каспазы — это семейство цистеиновых аспартат-специфических протеаз, которые являются ключевыми регуляторами клеточного цикла [6]. Помимо этого, ряд каспаз участвует в регуляции воспаления, выступая как инициаторами, так и модуляторами воспалительных каскадов [6, 7].

Из широкого спектра каспаз особого внимания заслуживает каспаза-1, которая участвует в образовании зрелых форм провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1β и IL-18. Активация каспазы-1 опосредована инфламмасомами, которые представляют собой сложные молекулярные комплексы, инициирующие воспалительный каскад [8]. Примечательно, что активированные иммунные клетки, такие как макрофаги и нейтрофилы, при стимуляции воспалительными триггерами могут высвобождать активную каспазу-1 во внеклеточную среду, что приводит к ее попаданию в кровь, где ее концентрация может быть измерена иммунохимическими методами [9].

Не менее важным членом семейства каспаз является каспаза-8, которая относится к так называемым инициаторным каспазам и служит активатором каскада эффекторных каспаз. По данным экспериментальных исследований, каспаза-8 участвует в ряде процессов, включая регуляцию некроптоза (программируемой некротической гибели клеток), опосредованного взаимодействием сериновых/треониновых киназ с рецепторами, экспрессии воспалительных цитокинов, активации инфламмасом, а также активации пироптоза (воспалительной гибели клеток) [10, 11].

Согласно накопленным к настоящему времени данным, большинство исследований каспазы-1 и каспазы-8 при атеросклерозе проводилось в человеческих тканях, культурах клеток и на животных моделях [12—14], тогда как концентрацию и активность циркулирующих каспаз практически не изучали. В последние годы показана способность клеток активно секретировать каспазы посредством неклассических секреторных путей, независимых от гибели клеток, что открыло перспективы для изучения концентраций циркулирующих каспаз при различных сердечно-сосудистых заболеваниях (ССЗ), в основе которых лежит атеросклероз [4].

Цель исследования — выполнить анализ связи концентраций каспазы-1, каспазы-8 в сыворотке крови и их соотношения с наличием атеросклеротического поражения коронарных артерий.

Материалы и методы

В исследование ретроспективно включено 144 пациента в возрасте от 42 до 82 лет, которым проведена коронароангиография в ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России в период 2020—2022 гг.

Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России (№ 09-05/19) и выполнялось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации; каждым пациентом подписано информированное добровольное согласие на участие в исследовании, включая согласие на обработку персональных данных и биобанкирование сыворотки крови.

Атеросклеротическое поражение коронарных артерий (КА) выявляли при проведении коронароангиографического исследования с использованием радиального или трансфеморального доступа по методике M. Judkins в условиях рентгеноперационной на ангиографических установках Allura Integris (Philips Medical Systems Nederland B.V., Нидерланды) и Innova 4100 (GE Medical Systems S.C.S., Франция).

Критерии включения: пациенты с хроническими ССЗ (гипертоническая болезнь, стабильная ИБС, фибрилляция предсердий), находившиеся на стационарном лечении и получавшие стандартную медикаментозную терапию по основному заболеванию. Иную специфическую терапию по другим нозологиям (противовоспалительной, гормональной, противоопухолевой) пациенты не получали.

Критерии невключения: острые состояния, в том числе в стадии декомпенсации, атеросклеротические осложнения за последние 6 месяцев, острые воспалительные заболевания, выраженная почечная и сердечная недостаточность, онкологические и аутоиммунные заболевания.

Пациенты распределены на две основные группы: 91 пациент с наличием атеросклеротического поражения КА по данным коронароангиографии и 53 пациента с интактными КА, составившие группу сравнения.

Подробная характеристика пациентов исследуемых групп представлена в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика пациентов (клинико-анамнестические и инструментальные данные)

Примечание. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Me [Q₂₅—Q₇₅], абсолютных и относительных частот n (%). ИМТ — индекс массы тела; ОТ — окружность талии; СД — сахарный диабет; ГБ — гипертоническая болезнь; ФП — фибрилляция предсердий; САД — систолическое артериальное давление; ДАД — диастолическое артериальное давление; ЧСС — частота сердечных сокращений. Здесь и в табл. 2: КА — коронарные артерии.

Для исследования биохимических маркеров взятие крови осуществляли натощак до проведения каких-либо инвазивных процедур из кубитальной вены в вакуумные пробирки с активатором свертывания. Кровь центрифугировали при 3000g в течение 10 минут при температуре +4 °C, далее сыворотку крови аликвотировали в криопробирки и хранили в лаборатории Банк биологического материала ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России при температуре -70 °C.

Количественное определение каспазы-1 и каспазы-8 в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа сэндвич-типа с использованием стандартизованных тест-систем Quantikine ELISA Human Caspase-1 Immunoassay R&D Systems (Bio-Techne Corporation R&D Systems, США) и Ray-Biotech (RayBiotech Inc., США), Human Caspase-8 ELISA Kit (RayBiotech Inc., США) с аналитической чувствительностью (минимальным лимитом детекции) 0,68 и 14,5 пг/мл соответственно. Регистрация оптической плотности проведена на микропланшетном ридере Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific Instruments Co., Ltd., США).

Статистический анализ выполнен в программе IBM SPSS Statistics version 22 (IBM Corporation, США) с использованием методов непараметрической статистики: критерия Манна—Уитни для непрерывных переменных и точного двухстороннего критерия Фишера для категориальных переменных. Анализ потенциальной диагностической эффективности исследуемых аналитов выполнен с применением методологии ROC-анализа (Receiver Operating Characteristic Analysis). Для всех показателей и их соотношений рассчитывали площадь под кривой (AUC, area under curve), а также определяли пороговые уровни с учетом максимального коэффициента Юдена. Уровень статистической значимости при проверке гипотез считали равным 0,05.

Результаты

Концентрации [медиана, Me (интерквартильный размах, Q₂₅—Q₇₅)] каспазы-1 и каспазы-8 определены в сыворотке крови у всех 144 больных, включенных в исследование (табл. 2). Концентрация каспазы-1 была статистически значимо (p=0,049) ниже у больных группы с атеросклеротическим поражением КА по сравнению с пациентами группы с интактными КА, при этом наиболее высокая концентрация данного фермента в сыворотке крови также выявлена у лиц группы с интактными КА и составила 390 нг/мл. Уровни каспазы-8, напротив, были более высокими у больных группы с коронарным атеросклерозом. Так, концентрация каспазы-8 у больных группы с атеросклеротическим поражением КА была более чем в 1,5 раза выше, чем у пациентов с интактными КА (p=0,036). У лиц группы с интактными КА концентрация каспазы-8 не превышала 985,8 пг/мл, тогда как у больных группы с поражением КА выявлены 4 случая гиперсекреции данного фермента более 3000 пг/мл.

Таблица 2. Сравнительный анализ уровней каспаз в сыворотке крови у пациентов исследуемых групп

Примечание. Здесь и на рис. 1: Min—Max — минимальное и максимальное значения переменной.

На основании полученных данных о статистически значимых ассоциациях атеросклеротического поражения КА с повышением уровня каспазы-8 и снижением каспазы-1 проведен анализ расчетного индекса — соотношения концентрации каспазы-8 (пг/мл)/концентрация каспазы-1 (пг/мл). Величина соотношения каспаза-8/каспаза-1 у больных группы с поражением КА была практически в 2 раза выше, чем у пациентов с интактными КА (p=0,0027); примечательно, что у больных с атеросклерозом КА максимальное значение данного индекса достигало 78,9, тогда как у лиц группы без поражения КА оно не превышало 7,1. Результаты сравнительного анализа соотношения концентраций каспаз представлены на рис. 1.

Рис. 1. Различия в соотношении концентраций каспазы-8 и каспазы-1 у пациентов исследуемых групп.

КА — коронарные артерии.

С целью оценки потенциальной диагностической эффективности определения уровней каспазы-1, каспазы-8 и расчетного индекса каспаза-8/каспаза-1 нами проведен ROC-анализ (рис. 2). Наибольшая площадь под кривой AUC=0,649 (95% ДИ 0,560—0,738) характерна для соотношения каспаза-8/каспаза-1, тогда как потенциальная диагностическая эффективность теста, основанного на изолированном определении циркулирующих каспаз, была ниже: для каспазы-1 — AUC=0,598 (95% ДИ 0,560—0,738) и для каспазы-8 — AUC=0,605 (0,510—0,710). Для соотношения каспаза-8/каспаза-1, исходя из максимального индекса Юдена (J-max=0,255), рассчитан пороговый уровень (cut-off), равный 1,9, превышение которого ассоциировано с наличием атеросклеротического поражения КА с диагностической чувствительностью 53,8%, диагностической специфичностью 71,7%.

Рис. 2. Результаты ROC-анализа у больных с атеросклерозом коронарных артерий относительно группы пациентов без этой патологии.

95% ДИ — асимптотический доверительный интервал; AUC — площадь под кривой.

Обсуждение

Значение хронического низкоинтенсивного воспаления в развитии коронарного атеросклероза активно исследуется в течение многих лет, однако роль каспаз в данном патофизиологическом процессе остается не до конца изученной. В настоящем исследовании впервые проанализированы уровни каспазы-1 и каспазы-8 в сыворотке крови больных с поражением КА, верифицированным по данным коронароангиографии, по сравнению с показателями у пациентов группы с интактными КА. Показано, что атеросклероз ассоциирован с более низкими концентрациями каспазы-1 и более высокими уровнями каспазы-8.

Большинство ранее проведенных исследований, посвященных анализу каспазы-1 и -8 при атеросклерозе и ССЗ, выполнено на животных моделях [15—17]. Так, C. Zeng и соавт. в экспериментальной модели на мышах определили, что пироптоз кардиомиоцитов, вызванный активацией инфламмасомы NLRP3 посредством каспазы-1, способствует прогрессированию кардиомиопатии [16]. Еще в одном экспериментальном исследовании выявлена связь гиперсекреции каспазы-8 с активацией макрофагами крысы инфламмасомы и высвобождением IL-1β, что приводило к активации воспалительной реакции [17]. В исследовании X. Shi и соавт. в атеросклеротических бляшках сонной артерии человека выявлена гиперэкспрессия компонентов сигнального пути инфламмасомы: белков NLRP3 и ASC (apoptosis-associated speck-like protein), каспазы-1, а также IL-1β и IL-18, что может свидетельствовать о потенциальной роли данных факторов в атерогенезе [18].

Количество работ, посвященных исследованию каспазы-1 в крови, и в отечественной, и в зарубежной литературе весьма ограничено. Так, в работе С.С. Попова и соавт. проанализирована активность каспазы-1 у больных с неалкогольным стеатогепатитом на фоне сахарного диабета 2 типа, которая в данной группе пациентов была выше, чем у лиц контрольной группы [19]. В многолетнем проспективном исследовании, проведенном на китайской популяции, включающей более 40 тыс. человек, с периодом наблюдения более 13 лет, гиперсекреция каспазы-1 в плазме крови была ассоциирована с повышенным риском развития ССЗ [20]. В исследовании, проведенном J. Pérez-Bárcena и соавт., уровни каспазы-1 определены в сыворотке крови больных с черепно-мозговой травмой по сравнению с контрольной группой, при этом уровень фермента был независимым предиктором исходов у данных больных [21]. Более близкой к нашему исследованию является работа А.В. Логаткиной и соавт., в которой проведен анализ концентраций каспазы-1 в сыворотке крови у пациентов со стенокардией напряжения, впервые возникшей стенокардией, пневмонией по сравнению с группой практически здоровых людей [22]. Примечательно, что в данном исследовании уровни каспазы-1 у пациентов со стенокардией напряжения и впервые выявленной стенокардией были статистически значимо ниже, чем у практически здоровых людей. Это согласуется с полученными нами результатами, показавшими, что у больных с атеросклерозом КА концентрация каспазы-1 в сыворотке крови также статистически значимо ниже, чем у пациентов с интактными КА.

Описанные в литературе исследования каспазы-8 в сыворотке крови демонстрируют ее гиперсекрецию при различных кардиометаболических заболеваниях, что согласуется с полученными нами данными о повышенной секреции каспазы-8 у больных с поражением КА. В исследованиях, проведенных О.М. Драпкиной и соавт. [23], а также T. Svensson и соавт. [24], выявлена связь более высокого уровня каспазы-8 с метаболическим синдромом и сахарным диабетом 2 типа соответственно. В более поздних исследованиях обнаружена связь повышенных концентраций каспазы-8 в сыворотке крови с риском смерти пациентов от спонтанного внутримозгового кровоизлияния [25], а также более высокая концентрация данного аналита при артериальной гипертонии по сравнению с контрольной группой [26]. Следует отметить, что нами не найдены публикации, в которых анализировалось бы соотношение уровней каспазы-8 и каспазы-1 как при коронарном атеросклерозе, так и при других кардиометаболических заболеваниях, что делает полученные в настоящем исследовании результаты приоритетными, их дальнейшее изучение и валидацию необходимо выполнить на бóльших выборках.

Ограничение исследования — относительно небольшой объем выборки. Нами использованы иммуноферментные методы оценки концентрации ферментов каспаз-1 и каспаз-8, в то же время для оценки их активности было бы целесообразно измерение не только их уровня, но и кинетики.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о возможной вовлеченности дисбаланса секреции каспазы-8 и каспазы-1 в патогенез атеросклероза коронарных артерий. Анализ диагностической эффективности соотношения каспаза-8/каспаза-1 показал потенциальную возможность для применения данного расчетного показателя в качестве маркера атеросклеротического поражения коронарных артерий. Вместе с тем необходимы дальнейшие валидационные исследования и совершенствование методологии лабораторных исследований.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Тимофеев Ю.С., Гострый А.В., Метельская В.А., Драпкина О.М.; сбор и обработка материала — Гострый А.В., Коровина О.О., Борисова А.Л.; статистический анализ данных — Тимофеев Ю.С.; написание текста — Тимофеев Ю.С., Гострый А.В., Метельская В.А., Дубовская Н.И., Коровина О.О., Рахмонова Ш.М.; научное редактирование — Метельская В.А., Драпкина О.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: study design — Timofeev Yu.S., Gostry A.V., Metelskaya V.A., Drapkina O.M.; data collection and processing — Gostry V.A., Korovina O.O., Borisova A.L.; statistical analysis — Timofeev Yu.S.; text writing — Timofeev Yu.S., Gostry A.V., Metelskaya V.A., Dubovskaya N.I., Korovina O.O., Rahmonova Sh.M.; scientific editing — Metelskaya V.A., Drapkina O.M.