Введение
Распространенность первичного и вторичного бесплодия составляет 1,9 и 10,5% соответственно у женщин 20—44 лет в 190 странах (2010 г.) [1].
Вспомогательная репродукция с медицинской точки зрения позволяет лечить большинство бесплодных пар с целью обеспечения здоровых родов. Успех циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) зависит от различных факторов и обычно оценивается по эффективности имплантации, достижению клинической беременности и живорождению. Существует много факторов, которые способны повлиять на эти исходы [2—12].
Одной из важных задач является определение наиболее подходящего эмбриона для переноса, что делает актуальным вопрос определения точной системы оценки. До недавнего времени самой распространенной являлась оценка эмбриона на основании морфологических характеристик. Однако морфологическая оценка не позволяет выявить хромосомные аномалии, в то время как именно они зачастую являются решающими в прогнозировании успеха ЭКО. Одним из важнейших генетических факторов, негативно влияющих на достижение репродуктивных исходов и ответственных за неудачи в клинической практике, является эмбриональная анеуплоидия, которая достоверно преобладает в циклах ЭКО. Причем очень важно, что распространенность хромосомных анеуплоидий увеличивается с возрастом женщины: риск хромосомной анеуплоидии составляет примерно от 20 до 31% у женщин в возрасте от 26 до 34 лет. В возрасте ≥35 лет частота анеуплоидий в ооцитах и эмбрионах постепенно увеличивается (от 34 до 75%) [13, 14].
Именно поэтому стала актуальной разработка методов, позволяющих оценить генетические аномалии эмбриона. Одним из современных методов, используемых для диагностики генетических аномалий эмбрионов и отбора наиболее оптимальных эмбрионов для переноса является предмплантационное генетическое тестирование (ПГТ, PGT).
ПГТ используется с 90-х годов прошлого века и, как доказано, может способствовать успеху применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Основной задачей включения данного метода в программы ВРТ является повышение их эффективности, увеличение частоты имплантации при одновременном снижении частоты невынашивания беременности [11, 15—21].
Необходимо отметить, что успех ПГТ для скрининга анеуплоидии (ПГТ-А, PGT-AS) не ограничивается самой техникой, а зависит от различных факторов: оптимизации техники ПГТ-А; правильного отбора пациентов для ПГТ-А; количества проанализированных хромосом (ограниченный или комплексный хромосомный скрининг, CCS). Кроме того, большое значение имеют и сами протоколы стимуляции яичников, культивирования эмбрионов in vitro и переноса эмбрионов. Сосредоточив внимание на методе ПГТ-А, в последние годы исследователи оптимизировали различные методологии для преодоления многих технических ограничений, о которых и пойдет речь в данном обзоре. Кроме того, мы также проанализировали данные литературы о правильном отборе пациентов [22].
Цель исследования — обобщить имеющиеся данные о современных подходах к выполнению ПГТ, показаниях и нововведениях.
Материал и методы
В обзоре обобщены данные литературы о различных аспектах, касающихся применения ПГТ-А в современной практике. Для электронного поиска использовались следующие базы данных: PubMed, Scopus, Cochrane Library, ClinicalTrials.gov и Google Scholar. Последний поиск в этих базах данных проведен 15 марта 2023 г. Нами использованы следующие ключевые слова и их комбинации: «In Vitro Fertilization»,
«IVF», «Intracytoplasmic Sperm Injection», «ICSI», «Assisted Reproduction», «Assisted Reproduction Technologies»,»Preimplantation Genetic Testing»,»PGT-A», «Preimplantation Genetic Screening», «PGS», «chromosome abnormality», «aneuploidies», «pregnancy», «live birth», «disorders», «Day 3», «cleavage stage embryo», «Day 5», «Day 6», «Blastocyst», «biopsy».
Всего обнаружено 1898 работ ( PubMed/Medline: n=1177, Embase: n=608, Cochrane Central Library: n=113). После тщательного скрининга отобрано и проанализировано 65 статей, к которым относились оригинальные исследования, систематические обзоры и метаанализы, а также клинические рекомендации.
Результаты
Применение преимплантационного генетического тестирования анеуплоидий
Показания к применению. Получено много данных о преимуществах использования ПГТ-А для различных когорт пациенток, в том числе для возрастных пациенток, пациенток с привычным невынашиванием, повторными неудачами имплантации (RIF) или в случаях тяжелого мужского бесплодия [23—30].
Роль ПГТ-А как универсального скринингового теста, необходимого всем пациентам в программах ЭКО, все еще остается спорной [22].
Выполнен ряд исследований, подтверждающих преимущества данной методики в отношении улучшения показателей живорождения после проведения ПГТ-А у пациентов с благоприятным прогнозом в программе ЭКО селективного переноса одного эмбриона, что делает возможным расширение использования этой стратегии с дальнейшим потенциальным снижением частоты наступления многоплодной беременности. Однако каждое из этих исследований имеет определенные ограничения, кроме того, вопрос о рациональном подборе пациентов и платформ для тестирования остается открытым [31].
Возможные ограничения применения. Обсуждая возможные ограничения применения ПГТ-А, нельзя не затронуть такую тему, как эмбриональный мозаицизм. Нарушения расхождения хромосом в ходе первых делений дробления эмбриона может приводить к возникновению в составе одного эмбриона клонов клеток с различным хромосомным набором [6]. Это явление получило название эмбрионального мозаицизма, являющегося одной из основных причин искажения результатов ПГТ-А [32—40].
Установление степени мозаицизма у эмбрионов является сложной задачей, поскольку показатели значительно варьируют в зависимости от стадии развития, большое значение также имеют техническое оснащение и платформа, используемая для диагностики. Кроме того, на вариабельность этого показателя могут оказывать влияние такие факторы, как этиология бесплодия, возраст женщины или даже культура in vitro и условия окружающей среды. Однако отмечается закономерность, согласно которой наблюдается уменьшение степени мозаицизма от 15 до 75% на стадии дробления до 3—24% на стадии бластоцисты, что связывают с механизмами самокоррекции и преимущественного развития эуплоидных клеток [41].
Влияние мозаицизма на развитие эмбриона и течение последующей беременности зависит от его типа, уровня мозаицизма, вовлеченных хромосом или размера хромосомных участков, локализации клеток, а также типа патологии [42]. Мозаичные или потенциально мозаичные эмбрионы стали новой категорией в классификации эмбрионов [43].
Согласно рекомендациям PGDIS [44], эмбрионы со степенью мозаицизма менее 20% могут рассматриваться как эуплоидные (пригодные для переноса), тогда как эмбрионы с более чем 80% аномальных клеток классифицируются как анеуплоидные. Остальные (20—80%) относят к мозаикам. Вопрос до каких значений эмбрионы являются подходящими для эмбриотрансфера, все еще остается открытым, по этому поводу существует много противоречивых мнений.
В исследовании, проведенном C. Simon и соавт., зафиксировано снижение частоты достижения имплантации и увеличение частоты наступления выкидышей и осложнений беременности у пациенток с эмбрионами со степенью мозаицизма свыше 50%, на основании чего авторы сделали предположение о том, что такие эмбрионы должны признаваться анеуплоидными и непригодными для переноса [43].
Следует также отметить и этические аспекты переноса мозаичных эмбрионов, согласно которым специалисты PGDIS опубликовали рекомендации по определению приоритетности переноса мозаичных эмбрионов [43—45].
Перенос такого эмбриона может быть осуществлен в случае отсутствия у пары эуплоидных эмбрионов и только после информирования пациентов о риске выкидыша и неблагоприятных исходах, с которыми они могут столкнуться. Еще одним обсуждаемым ограничением в применении ПГТ является вероятность повреждения эмбриона в ходе выполнения тестирования. Однако на данный момент нет достоверных данных о неблагоприятном влиянии биопсии трофэктодермы, подтверждающих или опровергающих это предположение. Кроме того, потенциальное негативное влияние на жизнеспособность эмбриона корректируется более современными методиками, все активнее внедряемыми в практику. Так, например, общепризнанным является то, что биопсия трофэктодермы оказывает меньшее влияние на жизнеспособность эмбриона, чем биопсия на стадии дробления [46, 47].
К еще одному потенциальному недостатку следует отнести большие экономические и временные затраты для каждого пациента [48, 49].
Методики проведения преимплантационного генетического тестирования анеуплоидий
Биопсия трофэктодермы. Наиболее оптимальной и современной, по данным литературы, является методика проведения ПГТ с биопсией трофэктодермы. Бластоциста состоит из двух типов клеток: клеток эмбриобласта (внутренняя клеточная масса), из которых в последующем и будет развиваться эмбрион, и клеток трофобласта, являющихся источником плаценты.
Можно выделить три основных преимущества биопсии трофэктодермы, к которым в первую очередь относится то, что в ходе биопсии не происходит извлечения внутренних клеток эмбриона, изымаются клетки, из которых впоследствии формируются внезародышевые ткани. Второе преимущество заключается в том, что к моменту взятия биопсии эмбрион имеет активированный геном, и это повышает вероятность получения более достоверных результатов. Диагностика генетических нарушений в этом случае также более точна, так как можно использовать большее количество клеток.
Еще одна спорная тема, касающаяся биопсии трофэктодермы, заключается в том, следует ли анализировать бластоцисты, развившиеся на 6-е и 7-е сутки. M.M. Piccolomini и соавт. проверяли, может ли медленное развитие отражать плоидный статус эмбриона. Проведена биопсия бластоцист, сформировавшихся на 5-е и 6-е сутки. По результатам данного исследования, статистически значимой разницы по частоте анеуплодий не было (61,4% на 5-е сутки и 69,9% на 6-е сутки) [50]. Однако в исследовании, проведенном T.H. Taylor и соавт., показано, что бластоцисты, сформировавшиеся к 5-м суткам, имеют более высокую вероятность быть эуплоидными, чем бластоцисты на 6-е сутки (54,6 и 42,8%), вместе с тем разницы в показателях живорождения в последующем не было [51].
C. Hernandez-Nieto и соавт. обнаружили, что уровень эуплоидии эмбрионов был значительно ниже в бластоцистах на 7-е сутки по сравнению с бластоцистами на 5-е или 6-е сутки (40,5, 54,7 и 52,9% соответственно). В этом исследовании также наблюдалось значительное снижение вероятности имплантации, клинической беременности и показателей живорождения [52].
С одной стороны, бластоцисты на 5-е сутки могут иметь более высокий уровень эуплоидии, но его связь с развитием эмбриона до сих пор неясна [53—55]. С другой стороны, эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты на 7-е сутки, могут оказаться жизнеспособными, иметь высокую морфологическую оценку, быть эуплоидными и приводить к здоровому живорождению. Таким образом, культивирование эмбрионов в течение дополнительных суток увеличивает количество эмбрионов, пригодных для использования в цикле ЭКО, и предоставляет дополнительные возможности для пациентов с небольшим количеством бластоцист или с низкокачественными бластоцистами. Эти результаты подчеркивают важность проведения биопсии всех доступных бластоцист независимо от их морфологии или времени роста [47].
Неинвазивное преимплантационное генетическое тестирование
Одним из недостатков классического ПГТ является необходимость биопсии эмбриона, это может ограничивать клиническую применимость ПГТ из-за инвазивности и сложности процесса. Поэтому предложена методика неинвазивного скрининга хромосом (NICS), впервые описанная J. Xu и соавт. в 2016 г. Данный метод основан на секвенировании геномной ДНК, секретируемой в среде для культивирования бластоцист [56].
Во время развития эмбрионов in vitro ДНК высвобождается в культуральную среду, где ее концентрация увеличивается по мере роста числа клеток бластоцисты. Секвенирование производится методом NGS (next generation sequencing). Данный подход представляет собой неинвазивный метод оценки количества копий хромосом в клетках эмбриона.
Принципиальным моментом является то, что сбор ДНК из эмбриональной питательной среды для генетической диагностики не требует биопсии эмбриона, и, следовательно, повреждение эмбриона в момент биопсиии возможные эпигенетические эффекты, ложноположительные или ложноотрицательные результаты могут быть полностью нивелированы. Ложноположительные результаты вызывают особое беспокойство, поскольку они могут привести к отбраковке эмбрионов, способных обеспечить нормальную беременность. Ложноотрицательные результаты также вызывают беспокойство, потому что перенос эмбрионов в этом случае может либо не завершиться беременностью, либо привести к аномальному развитию плода [57].
L. Huang и соавт. сранили результаты инвазивной PGT-A и данные, полученные с помощью NICS. В это исследование включены 52 эмбриона (средний возраст матери на момент извлечения 35,9 года); 41 эмбрион размораживали после витрификации на 5-е сутки, а 11 — после витрификации на 6-е сутки. Независимо от дня размораживания, все 52 эмбриона культивировали в течение ровно 24 часов, и все эмбрионы и соответствующие им 52 образца отработанных сред успешно амплифицированы. Ложноположительные результаты значительно реже получены при NICS (20%), чем при PGT-A (50%). Кроме того, показатели конкордантности как для эмбриональной плоидности, так и для числа копий хромосом были выше при неинвазивной PGT-A, чем при биопсии трофэктодермы с PGT-A. Эти результаты свидетельствуют о том, что неинвазивный скрининг менее подвержен ошибкам, связанным с эмбриональным мозаицизмом, и более надежен, чем биопсия эмбриона [57].
С помощью метода NICS J. Xu и соавт. провели хромосомный скрининг эмбрионов семи пар со сбалансированной транслокацией, азооспермией или невынашиванием беременности. У шести из них наступила успешная клиническая беременность, а у пяти родились здоровые дети [56].
В ретроспективном когортном исследовании H. Xi и соавт. изучено влияние NICS на клинические исходы у пациенток с привычным невынашиванием беременности или повторной неудачей имплантации при использовании ВРТ. В это исследование включены 273 женщины. У пациенток с привычным невынашиванием применение NICS поволило снизить частоту выкидышей на перенос замороженных эмбрионов (FET), улучшить частоту продолжающихся беременностей и частоту живорождения: 17,9% по сравнению с 42,6%, ОШ 0,39, 95% ДИ 0,16—0,95; 40,7% по сравнению с по сравнению с 25,0%, ОШ 2,00, 95% ДИ 1,04—3,82; 38,9% по сравнению с 20,6%, ОШ 2,53, 95% ДИ 1,28—5,02 соответственно. Для пациенток с повторными неудачами имплантации в анамнезе частота наступления беременности на криоперенос в группе NICS была значительно выше, чем в группе без NICS (46,9% по сравнению с 28,7%, ОШ 2,82, 95% ДИ 1,20—6,66). Это исследование продемонстрировало снижение частоты выкидышей у пациенток с пациенток с привычным невынашиванием беременности и улучшение частоты клинической беременности у пациенток с повторными неудачами имплантации при отборе эуплоидных эмбрионов с помощью NICS [58].
В исследовании L. Chen и соавт. сравнивали эффективность NICS с обычной биопсией трофэктодермы при ПГТ. Оценивали данные, доступные для 265 донорских эмбрионов. Анализ NICS показал многообещающие результаты, которые сопоставимы с биопсией трофэктодермы (чувствительность: 87,36 по сравнению с 89,66%; специфичность: 80,28 по сравнению с 82,39%). Кроме того, NICS предоставляет систему оценки для приоритезации эмбрионов: эмбрионы можно разделить на три группы с вероятностью предсказания эуплоидии 90,0, 27,8 и 72,2% для групп эуплоидных, анеуплоидных и эмбрионов с множественными аномальными хромосомами [59].
В исследовании R. Fang и соавт. хромосомного скринингу подвергли 164 бластоцисты. Скрининг показал эуплоидию у 79 эмбрионов, анеуплоидию у 52 эмбрионов и мозаичную плоидность у 33 эмбрионов. Частота эуплоидии была сопоставима у пар с нормальным кариотипом (50,7%; 38/75) и хромосомной перестройкой (43,2%; 41/95). Всего перенесено 52 эуплоидных эмбриона (50 циклов извлечения ооцитов) у 43 женщин. Биохимическая частота наступления беременности составила 72,0% (36/50). Частота наступления клинической беременности достигла 58,0% (29/50). Частота самопроизвольных выкидышей составила 3/29 (ни одного случая с хромосомной анеуплоидией). Всего родилось 27 здоровых детей [60]. Таким образом, с помощью NICS можно выявлять хромосомные аномалии эмбрионов у пар с хромосомной перестройкой или без нее с удовлетворительными клиническими результатами.
Молекулярные технологии в преимплантационном генетическом тестировании анеуплоидий
Новейшим и самым точным, по данным литературы, подходом к ПГТ является методика с проведением высокопроизводительного секвенирования (Next Generation Sequencing, NGS). Принцип метода NGS основан на определении последовательности нуклеиновых кислот.
Первый этап этого протокола состоит в WGA (полногеномная амплификация), как и для aCGH (метод сравнительной гибридизации на микрочипах). После амплификации генома происходит процедура штрихкодирования, при которой разные образцы маркируются определенными последовательностями. Этот процесс позволяет комбинировать от 24 до 96 биопсий в цикле секвенирования и оптимизировать затраты на секвенированный эмбрион. Каждая последовательность затем сравнивается с эталонным геномом человека с использованием специального программного обеспечение для выявления вариаций числа копий и крупных делеций или дупликаций [61—63].
Доступность различных молекулярных методов вызвала споры об их чувствительности и надежности для ПГТ. J. Friedenthal и соавт. отметили более высокие значения таких показателей, как частота имплантации, частота наступления беременности, а также улучшение показателей живорождения у женщин в циклах с NGS (71,6 и 62,0% соответственно) по сравнению с женщинами, оцененными с помощью метода сравнительной гибридизации на микрочипах aCGH (64,6 и 54,4% соответственно). Кроме того, исследователями отмечено значительное снижение частоты самопроизвольных абортов в группе NGS по сравнению с группой aCGH (12,4 и 12,7% соответственно).
На основании этих результатов авторы пришли к выводу, что ПГТ с использованием NGS значительно улучшает клинические исходы по сравнению с методом aCGH, и предположили, что NGS является более эффективным методом в отношении выявления мозаичных эмбрионов и эмбрионов с частичной анеуплоидией или триплоидией [42, 64].
Необходимо упомянуть, что, несмотря на высокую чувствительность методик PGT с применением как NGS, так и aCGH, клиницисты не должны исключать возможность возникновения ошибки [65].
Заключение
Преимплантационное генетическое тестирование является действенным методом оценки эуплоидии и мозаицизма эмбриона перед переносом. Целесообразность применения, согласно результатам исследований, в большей степени связана с состояниями, при которых может увеличиться риск анеуплоидий эмбрионов, и оправдана у пациенток высокого риска, в то время как использование этой методики у пациенток с хорошим прогнозом до сих пор остается под вопросом.
Существуют различные подходы, среди которых можно выделить NGS как самый точный метод молекулярной диагностики, а биопсию трофэктодерма на стадии бластоцисты — как наиболее используемый метод биопсии эмбриона. Следует также упомянуть, что, несмотря на высокую чувствительность методик преимплантационного генетического тестирования с применением NGS, клиницисты не должны исключать возможность возникновения ошибки. Кроме того, появляются данные и о разработке новых подходов, исключающих инвазивное вмешательство. Неинвазивный хромосомный скрининг способен улучшать частоту продолжающихся беременностей и снижать частоту выкидышей, он является многообещающим методом, который поможет снизить частоту ложноположительных результатов при преимплантационном генетическом тестировании. Неинвазивный хромосомный скрининг исключает необходимость биопсии эмбриона и, следовательно, предотвращает возможные потери эмбрионов во время биопсии. Метод имеет потенциал для гораздо более широкого применения в клиническом экстракорпоральном оплодотворении благодаря его высокой точности и неинвазивности.
Внедрение инноваций в программы вспомогательных репродуктивных технологий не исключает необходимости рассматривать эмбрион как «индивидуального пациента». Врачам следует уделять больше внимания междисциплинарному подходу в лечении фертильности: учитывать возможную роль гинекологической патологии и других факторов (эндокринных, генетических, эпигенетических, иммунологических и т.д.).
Преимплантационное генетическое тестирование следует выполнять только пациентам с особыми показаниями. Лечение бесплодия должно быть комплексным и сопровождаться оценкой состояния гамет, эмбрионов, эндометрия, а также общего состояния здоровья пациента. Каждое дополнение к программе вспомогательных репродуктивных технологий должно иметь строгие показания и быть клинически оправданным. Все вмешательства должны быть обсуждены с пациентами и выбраны ими, так как в некоторых случаях применение вспомогательных репродуктивных технологий может ограничить наступление спонтанной беременности в целом.
Вместе с тем нужно больше клинических испытаний, чтобы полностью ответить на все вопросы, касающихся биопсии эмбриона, преимплантационного генетического тестирования и других дополнительных методов в программах вспомогательных репродуктивных технологий.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Адамян Л.В.
Сбор и обработка материала — Пивазян Л.Г., Исаева С.Г.
Написание текста — Елагин В.В., Пивазян Л.Г., Исаева С.Г.
Редактирование — Адамян Л.В., Елагин В.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.