Введение

Актуальной проблемой современной гинекологии остается вопрос влияния микробиома эндометрия на репродуктивный потенциал женщин. В ряде исследований показано, что маточный микробиом у пациенток с бесплодием и у фертильных женщин имеет существенные различия [1, 2]. С одной стороны, полость матки длительное время считалась стерильной благодаря ряду защитных механизмов, которые предотвращают попадание микроорганизмов в верхние отделы женских половых путей [3]. Однако современные исследования полностью изменили данную точку зрения. Термин «микробиом» первоначально определен J.M. Whipps и соавт. как «характерное микробное сообщество, занимающее достаточно хорошо определенную среду обитания, которая имеет определенные физико-химические свойства» [4]. Микробиом определяется как коллективные геномы этих микробов [5, 6], которые, в свою очередь, выполняют местные иммунные, метаболические функции и участвуют в эпителизации [7]. Нарушения регуляции приводят к дисбиозу, который определяется как дисбаланс или изменение микробиома.

В частности, определенный интерес представляет присутствие микроорганизмов в эндометрии, где микроорганизмы с низкой биомассой могут воздействовать на местную иммунную среду в полости матки [8]. В ряде исследований показано, что дисбиотические процессы в эндометрии могут приводить к развитию гиперпластических процессов, однако молекулярные механизмы, способствующие нарушению тканевого и клеточного гомеостаза, изучены недостаточно [9, 10].

Отдельно ведутся исследования взаимосвязи маточного микробиома и миомы матки. Установлено, что в видовом составе микрофлоры эндометрия преобладают Lactobacillaceae, Staphylococcaceae и Enterobacteriaceae, однако эти изменения носят неспецифический характер [11, 12].

Кроме того, преобладание условно-патогенных микроорганизмов в эндометрии может оказывать негативное воздействие на процесс имплантации эмбриона и в дальнейшем на формирование плаценты. Все это потенциально влияет на фертильность и развитие акушерских осложнений в более поздние сроки гестации [13]. В ряде исследований доказана взаимосвязь между нарушением микробиома в полости матки и развитием хронического эндометрита, частота которого, по данным разных авторов, колеблется от 2,8 до 68%. Хронический эндометрит является одной из причин невынашивания беременности и неудачных попыток программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [14].

Для обнаружения бактерий традиционно применяются культуральные методы, которые в основном используются в диагностике воспалительных процессов внутренних половых органов. Однако культуральных методов недостаточно для точной качественной и количественной характеристики всех видов бактерий в микробиоме. Как правило, доминируют быстрорастущие аэробные виды, в то время как медленно растущие бактерии, требующие специфических условий, при культуральном методе не обнаруживаются.

В настоящее время микробиом женских половых органов анализируют с помощью метода секвенирования нового поколения (NGS), основанного на анализе гипервариабельных (V) областей гена бактериальной 16S рибо-сомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) или секвенирования всего метагенома (WMS). Секвенирование всего генома (WGS) дает возможность изучить не только интересующие геномы, но и все бактериальные геномы, функции различных генов, а также метаболические взаимосвязи [15].

По данным исследований последних лет, нет однозначно установленной причины появления микроорганизмов в полости матки. Однако рассмотрены различные пути, включая проникновение бактерий через шейку матки, ретроградное распространение через маточные трубы, гематогенное распространение бактерий из полости рта и/или кишечника, во время гинекологических процедур (например, введение/удаление внутриматочных спиралей) и/или со спермой, вследствие сексуальных привычек [16]. При выявлении причин бесплодия в практике гинекологов часто проводятся такие манипуляции, как гистеросальпингография и гистероскопия, что также может стать причиной повышения общей бактериальной обсемененности полости матки [17].

На современном этапе профильное профессиональное сообщество не пришло к единому выводу о видовом составе микробиома эндометрия, необходимого для успешной имплантации эмбриона [18]. В ряде работ показано, что у фертильных женщин эндометрий, как и влагалище, в основном колонизирован микроорганизмами рода Lactobacillus [8]. Согласно данным I. Moreno и соавт., микробиом эндометрия с преобладанием «нелактобацилл» (определяемый как <90% Lactobacillus spp.) ассоциируется со значительным снижением имплантации, вероятности наступления беременности и числа живорождений в циклах ВРТ [2, 19].

Цель исследования — оценить влияние микробиома эндометрия на исходы программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток с бесплодием и предыдущими неудачными попытками ВРТ.

Материал и методы

Нами проведено пилотное рандомизированное проспективное исследование, включившее 22 пациентки, получавших лечение в отделении ВРТ.

Критерии включения в исследование: возраст пациенток от 18 до 45 лет, верифицированный диагноз бесплодие, неудачные попытки ЭКО более одного раза, нормальный овариальный резерв (уровень антимюллерового гормона >1,2 нг/мл, количество антральных фолликулов по данным трансвагинального ультразвукового исследования (УЗИ) более 5 суммарно в обоих яичниках.

Критерии исключения: возраст женщины младше 18 и старше 45 лет, патология эндометрия, применение антибактериальной терапии в течение 3 месяцев, отказ пациентки от участия в исследовании.

Перед началом исследования все пациентки подписывали информированное добровольное согласие. Предварительное обследование проводили с использованием общеклинических и специальных методов исследования по стандартной методике в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации №803н от 31.07.20 «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».

В рамках исследования произведена аспирационная биопсия эндометрия с 15-го по 25-й день менструального цикла. Метагеномный анализ микробиома эндометрия является современным генетическим исследованием, позволяющим дать качественную и количественную оценку микроорганизмов, населяющих ткани эндометрия, изучить их взаимодействие и оценить микробное сообщество.

Особенность забора материала для метагеномного анализа состоит в отборе образца тканей, не загрязненных кровью, и их перенос стерильным пинцетом в специальную пробирку с транспортной средой (рис. 1, 2).

Рис. 1. Образец механизма обработки полученного материала из полости матки.

Рис. 2. Образец механизма обработки полученного материала из полости матки (продолжение).

Образцы ткани эндометрия, помещенные в консервационный буфер, стабильны при комнатной температуре +20—22 °C до 5—7 дней, рекомендованная температура при транспортировке в лабораторию +4—8 °C.

Материал для исследования подготавливали и выделяли из эндометрия набором QIAamp DNA Investigator Kit («Qiagen GmbH», Германия), номер ID: 56504, по протоколу производителя с модификациями и перемещали с помощью пинцета и скальпеля в заранее подготовленные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Далее добавляли 180 мкл буфера ATL и 20 мкл протеиназы K, после чего перемешивали вортексированием и откручивали на микроспине для осаждения капель. Пробирки со смесью помещали в термошейкер и инкубировали при 56 °C в течение 24 ч, затем образцы инкубировали при 90 °C в течение 30 мин.

После инкубации к образцам по очередности добавляли 200 мкл буфера AL и 200 мкл EtOH (96—100%), на каждом этапе смесь перемешивали пульсационным способом в течение 15 с. После образцы инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре.

Полученный лизат переносили на колонку с пробиркой для сбора образцов, после чего центрифугировали при 8000 об/мин в течение 1 мин. Далее колонку переносили в чистую пробирку для сбора. Следующий этап состоял из трех последовательных промывок буферами AW1, AW2 и EtOH (96—100%). В колонку вносили 500 мкл буфера AW1, после 700 мкл буфера AW2 и для финальной промывки использовали 700 мкл этилового спирта. На каждом этапе промывки колонки центрифугировали при 8000 об/мин в течение 1 мин и переносили в чистую пробирку для сбора.

После ПЦР проводили чистку продукта с помощью магнитных частиц KAPA Pure Beads. К продукту добавляли 20 мкл частиц комнатной температуры и инкубировали 5 мин вне магнитного штатива. Далее образцы помещали на магнитный штатив на 5 мин, после инкубации удаляли супернатант с последующими 2 промывками в 180 мкл 80% EtOH. Контроль качества индексированных библиотек проводили с помощью Qubit dsDNA BR Assay Kit и LabChip GX Touch HT Nucleic Acid Analyzer.

Филогенетический состав бактериальных сообществ на разных таксономических уровнях определяли в ходе сравнения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК с эталонными последовательностями рРНК из базы данных SILVA (база обновленная) с использованием функции «assignTaxonomy» пакета dada2.

На основании относительной количественной оценки разных типов микроорганизмов, находящихся в образце, сформированы две исследовательские группы сравнения: 1-я группа (n=7) — пациентки с преобладанием Lactobacillus spp. (более 90% от общей бактериальной массы), 2-я группа (n=15) — пациентки с преобладанием других штаммов. Пациенткам 2-й группы проведена этиотропная антибактериальная терапия с дотацией пробиотиков и последующим контролем проводимого лечения. На следующем этапе выполнен криоперенос эмбриона всем пациенткам. Основным прогностическим критерием явилось наступление клинической беременности у пациенток каждой из исследуемых групп.

Результаты и обсуждение

Возраст пациенток, включенных в исследование, не различался между исследуемыми группами и колебался от 26 до 40 лет (средний возраст 34,22±3,78 года). Средний возраст пациенток 1-й группы составил 32,71±3,9 года, 2-й группы — 34,93±3,43 года. Среднее количество предыдущих попыток ЭКО составило 3,45±0,83, по группам 3±0,84 и 3,66±0,78 соответственно. Продолжительность бесплодия (как первичного, так и вторичного) у пациенток обеих группах составила 6,36±2,16 года, по группам 5,57±2,77 и 6,73±1,7 года соответственно. Таким образом, оказалось, что у пациенток с нелактобациллярной флорой в полости матки отмечалось более длительное бесплодие и ранее проведено большее количество попыток ЭКО.

Сопутствующая гинекологическая патология — интерстициальная миома матки до 4 см — обнаружена у 8 пациенток при проведении УЗИ органов малого таза, все они относились ко второй группе. Длительность заболевания миомой матки составила в среднем 5,82±2,66 года. Дополнительно проведен расширенный иммуногистохимический анализ рецепторного статуса эндометрия, включающий в себя оценку ER, PR, CD138, CD56, LIF. У 50% из числа обследованных женщин отмечена средняя экспрессия прогестероновых рецепторов и низкая экспрессия эстрогеновых рецепторов, при этом соотношение их количества составило в среднем 5,5±3,45. Как известно, для фертильных женщин этот показатель в среднем составляет от 2 до 4 [20]. Кроме того, следует отметить, что у 2 (25%) пациенток обнаружено более 5 CD-138-позитивных клеток, что свидетельствует о возможном наличии хронического воспалительного процесса. Средний уровень LIF составил 4,5±1,43, таким образом, отмечено уменьшение количество пиноподий в секреторной фазе эндометрия, что также может служить причиной неудачных попыток ЭКО за счет неполноценности рецепторного статуса эндометрия.

Только у 7 (31,8%) из 22 пациенток выявлена флора с доминированием Lactobacillus spp. (см. таблицу). Этим пациенткам произведен перенос одного замороженно-размороженного эуплоидного эмбриона (после проведения преимплантационного генетического тестирования) в естественных циклах.

Данные и результаты исследуемых пациенток

У 15 (68,2%) женщин преобладали условно-патогенные микроорганизмы, такие как Gardnerella, Streptococcus, Atopobium, Prevotella, Enterococcus, Corynebacterium и другие.

Преобладающим по количеству условно-патогенных бактерий в полости матки является род Gardnerella (у 7 (32%) пациенток) (рис. 3). Присутствие бактерий рода Gardnerella связано с нарушением репродуктивной функции, что следует рассматривать как возможную причину неудач имплантации или невынашивания беременности [2]. Следует отметить, что этническая принадлежность пациенток является важным фактором в формировании микробиома эндометрия, поскольку у афроамериканских и латиноамериканских женщин наблюдается тенденция к большей колонизации представителями нелактобацилл, чем у женщин европейского происхождения [19].

Рис. 3. Преобладающие микроорганизмы в эндометрии при проведении метагеномного анализа.

Следующей преобладающей группой явились грамположительные бактерии рода Streptococcus (у 3 (13,6%) пациенток), что рассматривается как один из основных факторов развития хронического эндометрита. R.L. Fang и соавт. обнаружили, что популяция внутриматочных бактерий у пациенток с хроническим эндометритом более разнообразная, что означает необходимость более пристального внимания к оценке микробиома и последующей тактике ведения [21].

Другими выявленными преобладающими микроорганизмами в исследуемых образцах эндометрия явились Atopobium — у 2 (9%) женщин, Enterococcus — у 2 (9%), Corynebacterium — у 1 (4,5%), Prevotella — у 1 (4,5%).

После получения результатов метагеномного теста MEMA пациенткам с преобладанием условно-патогенных микрорганизмов рекомендована этиологическая антибиотикотерапия (Амоксициллин в комбинации с Клавулоновой кислотой в дозе 875 мг + 125 мг 2 раза в сутки 8 дней) с последующим применением пробиотиков Lactobacillus spp. в течение 14 дней.

Следует отметить, что у 1 пациентки обнаружено небольшое количество ДНК бактерий с видовым профилем, которой рекомендовано лечение только препаратами пробиотиков, содержащих Lactobacillus spp., что также указано в заключении проводимого теста.

Для контроля эффективности восстановления микрофлоры проведено повторное исследование у 14 пациенток, по результатам которого у 9 (64,3%) наблюдался лактобациллярный тип микробиома эндометрия. Остальным пациенткам предложен повторный курс антибактериальной терапии с заменой препарата на Офлоксацин 200 мг 2 раза в сутки 14 дней и Метронидазол 500 мг 2 раза в сутки 7 дней с последующей дотацией пробиотиков. При этом следует отметить, что только у 5 пациенток с миомой маткой удалось достигнуть нормализации маточной микрофлоры.

После проведенного лечения пациенткам выполнен криоперенос в естественном цикле. Пациенткам с «тонким» эндометрием производился перенос одного замороженно-размороженного эуплоидного эмбриона в цикле заместительной гормональной терапии (ЗГТ) по достижении оптимальной толщины по данным УЗИ органов малого таза. ЗГТ проводилась препаратами эстрогенов со 2—3-го дня менструального цикла. Далее с 15-го дня менструального цикла (при толщине эндометрия >7 мм) назначен ежедневный прием микродозированного прогестерона. На 5-й день приема гестагена произведен перенос эмбриона. В случае благополучного исхода беременности ЗГТ продолжали до 12 недель гестации.

По результатам проведенного исследования у 6 (27,2%) пациенток с преобладанием Lactobacillus spp. в эндометрии наступила клиническая беременность после переноса криоконсервированного эуплоидного эмбриона.

После проведенного лечения у 2 (13,3%) из 15 пациенток в следующем цикле наступила беременность, у 3 (20%) пациенток — после второго цикла лечения со сменой антибактериального препарата с последующим применением пробиотиков. У 10 (66,6%) обследуемых женщин после завершения второго цикла лечения беременность не наступила (рис. 4). На исход данных результатов могли повлиять сопутствующая гинекологическая патология (миома матки), недостаточная рецептивность эндометрия, а также неэффективность проводимой антибактериальной терапии. Необходимы дополнительные исследования в данной области.

Рис. 4. Клинические исходы в зависимости от преобладания рода Lactobacillus в микробиоме эндометрия у пациенток с повторными неудачами циклов экстракорпорального оплодотворения.

Заключение

Результаты пилотного исследования подтверждают современные представления о важности микробиома эндометрия в процессах имплантации эмбрионов и благоприятных исходах ЭКО [1, 2, 8]. Таким образом, дисбиотические процессы в полости матки могут служить одной из возможных причин снижения частоты наступления беременности у пациенток с бесплодием и повторными неудачами циклов ВРТ [10, 16].

Дополнительным методом обследования данной когорты может стать метагеномный анализ микробиома эндометрия, который предполагает качественную и количественную оценку микроорганизмов и их соотношение. Однако главным недостатком метода является отсутствие оценки чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам. С одной стороны, микрофлора эндометрия с доминированием Lactobacillus spp. может стать предиктором успешной нидации эмбриона [19]. С другой стороны, преобладание условно-патогенных микроорганизмов таких, как Gardnerella, Streptococcus, Enterococcus, Atopobium, могут отрицательно влиять на фертильность, что означает необходимость дальнейшего изучения [2, 19].

Современные подходы к коррекции дисбиоза в полости матки основаны на применении антибактериальных препаратов и дотации пробиотиков, причем в ряде случаев достаточно только изолированного назначения лактобактерий, что может стать основным методом преодоления данной проблемы после подтверждения результатами крупномасштабных исследований.

Кроме того, микробиом эндометрия нельзя оценивать изолированно от структурно-функциональных особенностей эндометрия и его рецептивности, на которые могут влиять и другие факторы, в том числе интерстициальная миома матки [20].

В настоящее время недостаточно опубликованных данных для ответа на вопрос о необходимости дополнительной диагностики и лечения микрофлоры полости матки. Однако этот подход может быть использован в комплексном и персонализированном ведении пациенток с бесплодием и повторными неудачными попытками методов ВРТ для улучшения репродуктивных исходов.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации — это разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.