Введение

Преэклампсия (ПЭ) является одним из наиболее тяжелых осложнений беременности, она оказывает негативное влияние как на состояние здоровья самой беременной, так и на состояние плода и новорожденного [1—3]. ПЭ встречается у 3—8% беременных и является одной из ведущих причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [1, 4, 5]. Ежегодно с ПЭ связано более 60 000 материнских смертей [5]. Следует отметить, что сроки возникновения и степень тяжести ПЭ напрямую коррелируют с состоянием новорожденных, риском неонатальных осложнений, тяжестью течения инфекционных процессов, гипоксически-ишемических состояний [6]. Нередко ПЭ сочетается с задержкой роста плода [7].

Преэклампсия является многофакторным заболеванием со значимой ролью в ее формировании как генетических, так и средовых факторов [8, 9]. К настоящему времени различными отечественными и зарубежными коллективами ученых проведены многочисленные исследования генетических и средовых факторов риска, определяющих предрасположенность к развитию ПЭ [10—14]. Среди факторов риска развития ПЭ важное значение имеют повышенный индекс массы тела, вредные привычки (курение), наличие хронической артериальной гипертензии и сахарного диабета, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (привычное невынашивание беременности, аборты) и др. [1, 4 15]. Влияние генетических факторов на развитие ПЭ не вызывает сомнений и составляет более 50% [8]. Показана значимая роль полиморфных локусов различных групп генов-кандидатов (интерлейкинов, факторов роста, сосудистых реакций, свертывания крови, фолатного цикла, детоксикации ксенобиотиков и др.) в формировании ПЭ [8, 16—20]. Однако следует отметить, что на сегодняшний день не существует ни одного теста, обеспечивающего выявление риска развития ПЭ с достаточными чувствительностью и специфичностью. Это диктует необходимость продолжения исследований молекулярно-генетических основ развития ПЭ [1] с целью выявления генетических детерминант, определяющих ее формирование, и их последующего внедрения в практическую медицину.

Цель исследования — изучить ассоциации полиморфных локусов rs484389 и rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ и рассмотреть их регуляторный потенциал.

Материал и методы

Выборка для настоящего исследования сформирована на базе Перинатального центра ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» Белгорода в 2008—2015 гг. и составила 514 женщин: 190 беременных с ПЭ (средний возраст 26,88±5,37 года) и 324 с физиологическим течением беременности (контрольная группа) (средний возраст 26,27±4,88 года, p>0,05). Диагноз ПЭ устанавливали на основании наличия генерализованных отеков, артериальной гипертензии и протеинурии. В выборку включены неродственные русские женщины, родившиеся в Центрально-Черноземном регионе РФ [21]. Из исследуемой выборки исключены индивидуумы с заболеваниями матки (фибромиома матки, аномалии развития внутренних половых органов), другой патологией беременности (аномалии прикрепления и расположения плаценты, плацентарная недостаточность с синдромом задержки роста плода, резус-конфликт), патологией плода (врожденные пороки развития), многоплодной беременностью. Клиническое и клинико-лабораторное обследование беременных проведено в срок родоразрешения. Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом медицинского института НИУ «БелГУ». До включения в исследование от всех участников получено письменное информированное добровольное согласие.

Проведено молекулярно-генетическое исследование двух полиморфных локусов — rs484389 и rs1042838 гена PGR (согласно базе данных HaploReg (v. 4.1) (https://compbio.mit.edu/HaploReg), полиморфные локусы имели значимый регуляторный потенциал). Выделение ДНК и генотипирование полиморфных локусов проведено по методике, представленной ранее [22, 23]. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изучаемых полиморфных локусов у женщин с ПЭ и беременных контрольной группы проводили с использованием статистических подходов, изложенных ранее [24].

Изучены ассоциации рассматриваемых полиморфных локусов с развитием ПЭ в рамках аддитивной, доминантной и рецессивной генетических моделей с помощью метода логистического регрессионного анализа. Характер ассоциации оценивали на основании полученных значений отношения шансов (OR) и их 95% доверительного интервала (95% CI) по методике, изложенной ранее [25]. Коррекция на множественные сравнения проведена с использованием адаптивного пермутационного теста (p_perm). Статистически значимым считали уровень p_perm<0,05. Расчеты выполнены в программе PLINK v. 2.050 (https://zzz.bwh.harvard.edu/plink).

Рассмотрено функциональное значение изучаемых полиморфных локусов: связь с аминокислотными заменами в кодируемом полипептиде (определяли предикторный потенциал с помощью программы PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml), ассоциации с экспрессией генов (eQTL) и альтернативным сплайсингом (sQTL), изучали связи аллельных вариантов полиморфных локусов с уровнем транскрипции генов и альтернативного сплайсинга с использованием данных проекта GTExportal (https://www.gtexportal.org) по ранее представленной методике [26]), эпигенетические эффекты (с помощью онлайн-программы HaploReg (v. 4.1) (https://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) по методике, изложенной ранее [25]).

Результаты и обсуждение

Анализ медико-биологических и клинико-анамнестических характеристик беременных с ПЭ и контрольной группы (табл. 1) показал, что беременные с ПЭ отличаются более высоким индексом массы тела, высокой частотой выявления сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, до беременности, наличием ПЭ в анамнезе. Кроме того, для беременных с ПЭ характерны раннее появление менархе, высокая частота артифициальных абортов, выкидышей и мертворождений в анамнезе.

Таблица 1. Медико-биологические, клинические и клинико-анамнестические характеристики беременных с преэклампсией и женщин контрольной группы

Примечание. ПЭ — преэклампсия.

Проведенная оценка наблюдаемого распределения генотипов по полиморфным локусам rs484389 и rs1042838 гена PGR показала их соответствие ожидаемому распределению согласно равновесию Харди—Вайнберга (p>0,05) как у беременных с ПЭ, так и у женщин контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют об ассоциации полиморфизма rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ (табл. 2). Установлено, что в группе беременных с ПЭ частота аллеля T rs1042838 была в 1,34 выше, чем в контрольной группе (p=0,04). Среди беременных с ПЭ выявлена более высокая частота генотипа G/T rs1042838 (в 1,36 раза) и низкая частота генотипа G/G rs1042838 (в 1,15 раза) по сравнению с контрольной группой (p=0,04). Итак, генетическими факторами риска развития ПЭ являются генотип G/T (OR=1,54, 95% CI 1,02—2,33, p=0,04) и аллель T (OR=1,42, 95% CI 1,01—1,98, p=0,04) полиморфного локуса rs1042838 гена PGR, а протективное значение имеют генотип G/G (OR=0,65, 95% CI 0,43—0,97, p=0,04) и аллель G (OR=0,71, 95% CI 0,49—0,99, p=0,04) этого полиморфизма.

Таблица 2. Характеристика частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена PGR у беременных с преэклампсией и женщин контрольной группы

Примечание. ПЭ — преэклампсия; OR — показатель отношения шансов; 95% CI — его 95% доверительный интервал; p — уровень статистической значимости, жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

С помощью логистического регрессионного анализа установлена ассоциация аллеля T rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ согласно аддитивной (OR=1,43, 95% CI 1,02—2,02, p=0,04, p_perm=0,05) и доминантной (OR=1,54, 95% CI 1,05—2,27, p=0,03, p_perm=0,04) генетическим моделям взаимодействия аллелей.

Данные о регуляторном потенциале полиморфизма rs1042838 гена PGR, полученные с помощью современных мировых баз данных по функциональной геномике, свидетельствуют о его важном функциональном значении в организме.

Во-первых, согласно базе данных PolyPhen-2, указанный полиморфный локус, расположенный в 72-й позиции 4-го экзона гена-рецептора прогестерона (всего в гене PGR 8 экзонов), определяет несинонимичную замену аминокислоты валин на аминокислоту лейцин в 660-м положении полипептида рецептора прогестерона (Val660Leu). Эта миссенс-мутация имеет предикторный класс BENIGN (score=0,006, чувствительность — 0,97, специфичность — 0,75).

Во-вторых, в соответствии с онлайн-программой HaploReg (v. 4.1) полиморфный локус rs1042838 расположен в эволюционно консервативном регионе, локализуется в области регуляторных мотивов ДНК, являющихся сайтами связывания с четырьмя факторами транскрипции (AP-2rep, BDP1_disc3, CACD_1, Sp4), находится в регионе модифицированных гистонов (H3K4me1), маркирующих энхансеры в культуре клеток мезодермы, яичниках и регионе модифицированных гистонов (H3K9ac), маркирующих «активные» промоторы в культуре клеток, производных трофобласта (H1 BMP4 Derived Trophoblast Cultured Cells) и культуре клеток H9. Следует отметить, что аллель T, ассоциированный с повышенным риском развития ПЭ, снижает афинность к трем рассматриваемым транскрипционным факторам — AP-2rep (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет –5,7), CACD_1 (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет –1,0), Sp4 (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет –5,9) и повышает афинность к фактору транскрипции BDP1_disc3 (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет 0,4).

В-третьих, по данным проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx), установлена связь полиморфизма rs1042838 с уровнем экспрессии гена PGR в культуре клеток фибробластов (коэффициент линейной регрессии для аллеля T равен β=0,45, p=4,9e^–10, p_FDR≤0,05), подкожной жировой ткани (коэффициент линейной регрессии для аллеля T равен β=0,17, p=2,3e^–7, p_FDR≤0,05), надпочечниках (коэффициент линейной регрессии для аллеля T равен β=0,43, p=0,0000034, p_FDR≤0,05). Следует подчеркнуть, что данные органы, ткани и культуры клеток имеют важное значение в патогенезе ПЭ [4, 5].

В-четвертых, полиморфный локус rs1042838 согласно материалам, представленным в базе GTExportal, ассоциирован с уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1 в яичниках (ID интрона — 101159255:101209343:clu_7415, нормализованный коэффициент вырезания интронов для аллеля T равен β=–0.88, p=1,7e^–8, p_FDR≤0,05).

Таким образом, полученные нами материалы свидетельствуют о существенном регуляторном потенциале полиморфного локуса rs1042838 гена PGR — он определяет аминокислотную замену в полипептиде рецептора прогестерона (Val660Leu), связан с экспрессией гена PGR в культуре клеток фибробластов, подкожной жировой ткани, надпочечниках, влияет на уровень альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1 в яичниках, определяет афинность ДНК к четырем факторам транскрипции (AP-2rep, BDP1_disc3, CACD_1, Sp4), находится в регионе модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в культуре клеток мезодермы, производных трофобласта, яичниках, что может являться медико-биологической основой установленной нами ассоциации полиморфизма rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ. При этом аллель Т этого полиморфного локуса, являющийся фактором риска развития ПЭ (OR>1), обусловливает повышенную экспрессию гена PGR и низкий уровень альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1, снижает афинность мотивов ДНК к трем транскрипционным факторам — AP-2rep, CACD_1, Sp4 и повышает афинность к фактору транскрипции BDP1_disc3, приводит к несинонимической замене аминокислоты в полипептиде рецептора прогестерона (Val660Leu).

По данным информационного ресурса GeneCards: The Human Gene Database (https://www.genecards.org), ген PGR является членом суперсемейства генов стероидных рецепторов. Кодируемый им белок (рецептор прогестерона) опосредует физиологические эффекты прогестерона, который играет центральную роль в репродуктивных событиях, связанных с возникновением и сохранением беременности. Прогестерон, вовлеченный через взаимодействие со своими рецепторами в регуляцию клеточного цикла, ангиогенез, лизосомальную активацию, сигнализацию рецепторов инсулина и апоптоз, является одним из наиболее важных регуляторов дифференцировки эндометрия, известной как децидуализация [27], что имеет ключевое значение для инвазии трофобласта. Высказывается мнение о важной роли сенсибилизации организма к прогестерону при развитии ПЭ [29]. Следует отметить, что в гене PGR имеются два различных промотора и несколько разных стартовых сайтов трансляции в первом экзоне для получения нескольких вариантов транскрипта, как кодирующих белок, так и не кодирующих полипептид (https://www.genecards.org). Большинство эффектов прогестерона в организме человека опосредуется его ядерными рецепторами, являющимися, по существу, белками, регулирующими транскрипцию генов [28]. Выделяют две основные изоформы ядерных рецепторов прогестерона — PGR-А и PGR-В, биологические эффекты которых (перечень регулируемых генов) значительно различаются (https://www.genecards.org). Следует отметить, что в ряде исследований установлено увеличение уровня экспрессии рецепторов прогестерона (при сниженной экспрессии ESR1 и повышенной экспрессии ESR2) в преэкламптических плацентах [30].

В ранее проведенных исследованиях выявлены ассоциации полиморфного локуса rs1042838 гена PGR, вовлеченного, по нашим данным, в формирование ПЭ (аллель Т повышает риск развития ПЭ), с идиопатическим невынашиванием беременности (аллель Т является рисковым) [31], развитием рака эндометрия (для аллеля Т OR=1,25) [32]. В то же время имеются исследования, свидетельствующие о связи аллеля Т rs1042838 гена PGR с поздним менархе и более коротким менструальным циклом [33], и работы, в которых не выявлены ассоциации полиморфного локуса rs1042838 с развитием эндометриоза [34], рака молочной железы [35].

Заключение

Полиморфизм rs1042838 гена PGR ассоциирован с развитием преэклампсии: генотип G/T (OR=1,54, 95% CI 1,02—2,33, p=0,04) и аллель T (OR=1,42, 95% CI 1,01—1,98, p=0,04) повышают риск развития преэклампсии, а генотип G/G (OR=0,65, 95% CI 0,43—0,97, p=0,04) и аллель G (OR=0,71, 95% CI 0,49—0,99, p=0,04) имеют протективное значение. Полиморфный локус rs1042838 гена PGR обладает выраженным регуляторным потенциалом — он определяет аминокислотную замену в полипептиде рецептора прогестерона (Val660Leu), связан с экспрессией гена PGR в культуре клеток фибробластов, подкожной жировой ткани, надпочечниках, влияет на уровень альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1 в яичниках, определяет афинность ДНК к четырем факторам транскрипции (AP-2rep, BDP1_disc3, CACD_1, Sp4), находится в регионе модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в культуре клеток мезодермы, производных трофобласта, яичниках.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ «Изучение генетических факторов репродуктивного здоровья женщин» (МД-3284.2022.1.4).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Чурносов М.И.

Сбор и обработка материала — Головченко О.В., Абрамова М.Ю.

Статистический анализ данных — Головченко О.В., Пономаренко И.В.

Написание текста — Головченко О.В.

Редактирование — Чурносов М.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.