Введение
Преэклампсия (ПЭ) является одним из наиболее тяжелых осложнений беременности, она оказывает негативное влияние как на состояние здоровья самой беременной, так и на состояние плода и новорожденного [1—3]. ПЭ встречается у 3—8% беременных и является одной из ведущих причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [1, 4, 5]. Ежегодно с ПЭ связано более 60 000 материнских смертей [5]. Следует отметить, что сроки возникновения и степень тяжести ПЭ напрямую коррелируют с состоянием новорожденных, риском неонатальных осложнений, тяжестью течения инфекционных процессов, гипоксически-ишемических состояний [6]. Нередко ПЭ сочетается с задержкой роста плода [7].
Преэклампсия является многофакторным заболеванием со значимой ролью в ее формировании как генетических, так и средовых факторов [8, 9]. К настоящему времени различными отечественными и зарубежными коллективами ученых проведены многочисленные исследования генетических и средовых факторов риска, определяющих предрасположенность к развитию ПЭ [10—14]. Среди факторов риска развития ПЭ важное значение имеют повышенный индекс массы тела, вредные привычки (курение), наличие хронической артериальной гипертензии и сахарного диабета, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (привычное невынашивание беременности, аборты) и др. [1, 4 15]. Влияние генетических факторов на развитие ПЭ не вызывает сомнений и составляет более 50% [8]. Показана значимая роль полиморфных локусов различных групп генов-кандидатов (интерлейкинов, факторов роста, сосудистых реакций, свертывания крови, фолатного цикла, детоксикации ксенобиотиков и др.) в формировании ПЭ [8, 16—20]. Однако следует отметить, что на сегодняшний день не существует ни одного теста, обеспечивающего выявление риска развития ПЭ с достаточными чувствительностью и специфичностью. Это диктует необходимость продолжения исследований молекулярно-генетических основ развития ПЭ [1] с целью выявления генетических детерминант, определяющих ее формирование, и их последующего внедрения в практическую медицину.
Цель исследования — изучить ассоциации полиморфных локусов rs484389 и rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ и рассмотреть их регуляторный потенциал.
Материал и методы
Выборка для настоящего исследования сформирована на базе Перинатального центра ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа» Белгорода в 2008—2015 гг. и составила 514 женщин: 190 беременных с ПЭ (средний возраст 26,88±5,37 года) и 324 с физиологическим течением беременности (контрольная группа) (средний возраст 26,27±4,88 года, p>0,05). Диагноз ПЭ устанавливали на основании наличия генерализованных отеков, артериальной гипертензии и протеинурии. В выборку включены неродственные русские женщины, родившиеся в Центрально-Черноземном регионе РФ [21]. Из исследуемой выборки исключены индивидуумы с заболеваниями матки (фибромиома матки, аномалии развития внутренних половых органов), другой патологией беременности (аномалии прикрепления и расположения плаценты, плацентарная недостаточность с синдромом задержки роста плода, резус-конфликт), патологией плода (врожденные пороки развития), многоплодной беременностью. Клиническое и клинико-лабораторное обследование беременных проведено в срок родоразрешения. Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом медицинского института НИУ «БелГУ». До включения в исследование от всех участников получено письменное информированное добровольное согласие.
Проведено молекулярно-генетическое исследование двух полиморфных локусов — rs484389 и rs1042838 гена PGR (согласно базе данных HaploReg (v. 4.1) (https://compbio.mit.edu/HaploReg), полиморфные локусы имели значимый регуляторный потенциал). Выделение ДНК и генотипирование полиморфных локусов проведено по методике, представленной ранее [22, 23]. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изучаемых полиморфных локусов у женщин с ПЭ и беременных контрольной группы проводили с использованием статистических подходов, изложенных ранее [24].
Изучены ассоциации рассматриваемых полиморфных локусов с развитием ПЭ в рамках аддитивной, доминантной и рецессивной генетических моделей с помощью метода логистического регрессионного анализа. Характер ассоциации оценивали на основании полученных значений отношения шансов (OR) и их 95% доверительного интервала (95% CI) по методике, изложенной ранее [25]. Коррекция на множественные сравнения проведена с использованием адаптивного пермутационного теста (pperm). Статистически значимым считали уровень pperm<0,05. Расчеты выполнены в программе PLINK v. 2.050 (https://zzz.bwh.harvard.edu/plink).
Рассмотрено функциональное значение изучаемых полиморфных локусов: связь с аминокислотными заменами в кодируемом полипептиде (определяли предикторный потенциал с помощью программы PolyPhen-2 (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml), ассоциации с экспрессией генов (eQTL) и альтернативным сплайсингом (sQTL), изучали связи аллельных вариантов полиморфных локусов с уровнем транскрипции генов и альтернативного сплайсинга с использованием данных проекта GTExportal (https://www.gtexportal.org) по ранее представленной методике [26]), эпигенетические эффекты (с помощью онлайн-программы HaploReg (v. 4.1) (https://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php) по методике, изложенной ранее [25]).
Результаты и обсуждение
Анализ медико-биологических и клинико-анамнестических характеристик беременных с ПЭ и контрольной группы (табл. 1) показал, что беременные с ПЭ отличаются более высоким индексом массы тела, высокой частотой выявления сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, до беременности, наличием ПЭ в анамнезе. Кроме того, для беременных с ПЭ характерны раннее появление менархе, высокая частота артифициальных абортов, выкидышей и мертворождений в анамнезе.
Таблица 1. Медико-биологические, клинические и клинико-анамнестические характеристики беременных с преэклампсией и женщин контрольной группы
| Характеристика | Беременные с ПЭ | Контрольная группа | p |
| Количество исследуемых, n | 190 | 324 | — |
| Средний возраст, годы (min—max) | 26,88±5,37 (17,0—45,0) | 26,18±4,98 (18,0—41,0) | 0,28 |
| Индекс массы тела, кг/м2 | 24,77±5,07 | 23,77±3,60 | 0,01 |
| Артериальная гипертензия до беременности, % (n) | 6,84 (13) | 2,16 (7) | 0,02 |
| Преэклампсия в анамнезе, % (n) | 9,47 (18) | 3,70 (12) | 0,01 |
| Возраст появления менархе и менструальный цикл | |||
| Возраст появления менархе, годы | 12,62±1,10 | 12,54±1,02 | 0,36 |
| Раннее появление менархе (<12 лет), % (n) | 12,63 (24) | 5,86 (19) | 0,01 |
| Среднее появление менархе (12—14 лет), % (n) | 84,21 (160) | 87,03 (282) | 0,44 |
| Позднее появление менархе (>14 лет), % (n) | 3,26 (6) | 7,10 (23) | 0,09 |
| Длительность менструаций, дни | 5,06±0,73 | 5,03±0,80 | 0,46 |
| Длительность менструального цикла, дни | 27,96±1,95 | 28,32±1,62 | 0,23 |
| Показатели реализации репродуктивной функции | |||
| Количество беременностей | 1,39±1,73 | 1,05±1,83 | 0,03 |
| Количество родов | 0,54±0,63 | 0,56±0,74 | 0,78 |
| Количество мертворождений | 0,04±0,16 | 0,01±0,06 | 0,04 |
| Количество выкидышей | 0,21±0,39 | 0,12±0,28 | 0,02 |
| Количество артифициальных абортов | 0,61±1,01 | 0,36±0,71 | 0,001 |
| Сопутствующие экстрагенитальные заболевания, % (n) | |||
| сердечно-сосудистой системы | 13,16 (25) | 7,10 (23) | 0,03 |
| эндокринных органов | 6,84 (13) | 3,70 (12) | 0,17 |
| пищеварительной системы | 2,11 (4) | 2,47 (8) | 0,99 |
| мочевыделительной системы | 7,37 (14) | 4,01 (13) | 0,15 |
| дыхательной системы | 1,05 (2) | 1,23 (4) | 0,99 |
Примечание. ПЭ — преэклампсия.
Проведенная оценка наблюдаемого распределения генотипов по полиморфным локусам rs484389 и rs1042838 гена PGR показала их соответствие ожидаемому распределению согласно равновесию Харди—Вайнберга (p>0,05) как у беременных с ПЭ, так и у женщин контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют об ассоциации полиморфизма rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ (табл. 2). Установлено, что в группе беременных с ПЭ частота аллеля T rs1042838 была в 1,34 выше, чем в контрольной группе (p=0,04). Среди беременных с ПЭ выявлена более высокая частота генотипа G/T rs1042838 (в 1,36 раза) и низкая частота генотипа G/G rs1042838 (в 1,15 раза) по сравнению с контрольной группой (p=0,04). Итак, генетическими факторами риска развития ПЭ являются генотип G/T (OR=1,54, 95% CI 1,02—2,33, p=0,04) и аллель T (OR=1,42, 95% CI 1,01—1,98, p=0,04) полиморфного локуса rs1042838 гена PGR, а протективное значение имеют генотип G/G (OR=0,65, 95% CI 0,43—0,97, p=0,04) и аллель G (OR=0,71, 95% CI 0,49—0,99, p=0,04) этого полиморфизма.
Таблица 2. Характеристика частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена PGR у беременных с преэклампсией и женщин контрольной группы
| Локусы | Аллели, генотипы | Беременные с ПЭ (n=190), абс. (%) | Контрольная группа (n=324), абс. (%) | OR (95% CI) | p |
| rs484389 | T | 274 (72,87) | 493 (77,52) | 0,78 (0,58—1,06) | 0,11 |
| C | 102 (27,13) | 143 (22,48) | 1,28 (0,95—1,74) | ||
| T/T | 100 (53,19) | 194 (61,00) | 0,73 (0,49—1,06) | 0,10 | |
| T/C | 74 (39,36) | 105 (33,02) | 1,32 (0,89—1,95) | 0,18 | |
| C/C | 14 (7,45) | 19 (5,98) | 1,26 (0,58—2,73) | 0,64 | |
| T/T vs. T/C vs. C/C (аддитивная модель) | — | — | 1,27 (0,95—1,70) | 0,10 | |
| T/T vs. T/C + C/C (доминантная модель) | — | — | 1,38 (0,95—1,98) | 0,08 | |
| T/T + T/C vs. C/C (рецессивная модель) | — | — | 1,27 (0,62—2,59) | 0,52 | |
| rs1042838 | G | 303 (80,59) | 547 (85,47) | 0,71 (0,49—0,99) | 0,04 |
| T | 73 (19,41) | 93 (14,53) | 1,42 (1,01—1,98) | ||
| G/G | 120 (63,83) | 234 (73,12) | 0,65 (0,43—0,97) | 0,04 | |
| G/T | 63 (33,51) | 79 (24,69) | 1,54 (1,02—2,33) | 0,04 | |
| T/T | 5 (2,66) | 7 (2,19) | 1,22 (0,33—4,36) | 0,97 | |
| G/G vs. G/T vs. T/T (аддитивная модель) | — | — | 1,43 (1,02—2,02) | 0,04 | |
| G/G vs. G/T + T/T (доминантная модель) | — | — | 1,54 (1,05—2,27) | 0,03 | |
| G/G + G/T vs. T/T (рецессивная модель) | — | — | 1,22 (0,38—3,90) | 0,73 |
Примечание. ПЭ — преэклампсия; OR — показатель отношения шансов; 95% CI — его 95% доверительный интервал; p — уровень статистической значимости, жирным шрифтом выделены статистически значимые различия.
С помощью логистического регрессионного анализа установлена ассоциация аллеля T rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ согласно аддитивной (OR=1,43, 95% CI 1,02—2,02, p=0,04, pperm=0,05) и доминантной (OR=1,54, 95% CI 1,05—2,27, p=0,03, pperm=0,04) генетическим моделям взаимодействия аллелей.
Данные о регуляторном потенциале полиморфизма rs1042838 гена PGR, полученные с помощью современных мировых баз данных по функциональной геномике, свидетельствуют о его важном функциональном значении в организме.
Во-первых, согласно базе данных PolyPhen-2, указанный полиморфный локус, расположенный в 72-й позиции 4-го экзона гена-рецептора прогестерона (всего в гене PGR 8 экзонов), определяет несинонимичную замену аминокислоты валин на аминокислоту лейцин в 660-м положении полипептида рецептора прогестерона (Val660Leu). Эта миссенс-мутация имеет предикторный класс BENIGN (score=0,006, чувствительность — 0,97, специфичность — 0,75).
Во-вторых, в соответствии с онлайн-программой HaploReg (v. 4.1) полиморфный локус rs1042838 расположен в эволюционно консервативном регионе, локализуется в области регуляторных мотивов ДНК, являющихся сайтами связывания с четырьмя факторами транскрипции (AP-2rep, BDP1_disc3, CACD_1, Sp4), находится в регионе модифицированных гистонов (H3K4me1), маркирующих энхансеры в культуре клеток мезодермы, яичниках и регионе модифицированных гистонов (H3K9ac), маркирующих «активные» промоторы в культуре клеток, производных трофобласта (H1 BMP4 Derived Trophoblast Cultured Cells) и культуре клеток H9. Следует отметить, что аллель T, ассоциированный с повышенным риском развития ПЭ, снижает афинность к трем рассматриваемым транскрипционным факторам — AP-2rep (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет –5,7), CACD_1 (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет –1,0), Sp4 (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет –5,9) и повышает афинность к фактору транскрипции BDP1_disc3 (различие между LOD scores аллелей T (alt) и G (ref) составляет 0,4).
В-третьих, по данным проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx), установлена связь полиморфизма rs1042838 с уровнем экспрессии гена PGR в культуре клеток фибробластов (коэффициент линейной регрессии для аллеля T равен β=0,45, p=4,9e–10, pFDR≤0,05), подкожной жировой ткани (коэффициент линейной регрессии для аллеля T равен β=0,17, p=2,3e–7, pFDR≤0,05), надпочечниках (коэффициент линейной регрессии для аллеля T равен β=0,43, p=0,0000034, pFDR≤0,05). Следует подчеркнуть, что данные органы, ткани и культуры клеток имеют важное значение в патогенезе ПЭ [4, 5].
В-четвертых, полиморфный локус rs1042838 согласно материалам, представленным в базе GTExportal, ассоциирован с уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1 в яичниках (ID интрона — 101159255:101209343:clu_7415, нормализованный коэффициент вырезания интронов для аллеля T равен β=–0.88, p=1,7e–8, pFDR≤0,05).
Таким образом, полученные нами материалы свидетельствуют о существенном регуляторном потенциале полиморфного локуса rs1042838 гена PGR — он определяет аминокислотную замену в полипептиде рецептора прогестерона (Val660Leu), связан с экспрессией гена PGR в культуре клеток фибробластов, подкожной жировой ткани, надпочечниках, влияет на уровень альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1 в яичниках, определяет афинность ДНК к четырем факторам транскрипции (AP-2rep, BDP1_disc3, CACD_1, Sp4), находится в регионе модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в культуре клеток мезодермы, производных трофобласта, яичниках, что может являться медико-биологической основой установленной нами ассоциации полиморфизма rs1042838 гена PGR с развитием ПЭ. При этом аллель Т этого полиморфного локуса, являющийся фактором риска развития ПЭ (OR>1), обусловливает повышенную экспрессию гена PGR и низкий уровень альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1, снижает афинность мотивов ДНК к трем транскрипционным факторам — AP-2rep, CACD_1, Sp4 и повышает афинность к фактору транскрипции BDP1_disc3, приводит к несинонимической замене аминокислоты в полипептиде рецептора прогестерона (Val660Leu).
По данным информационного ресурса GeneCards: The Human Gene Database (https://www.genecards.org), ген PGR является членом суперсемейства генов стероидных рецепторов. Кодируемый им белок (рецептор прогестерона) опосредует физиологические эффекты прогестерона, который играет центральную роль в репродуктивных событиях, связанных с возникновением и сохранением беременности. Прогестерон, вовлеченный через взаимодействие со своими рецепторами в регуляцию клеточного цикла, ангиогенез, лизосомальную активацию, сигнализацию рецепторов инсулина и апоптоз, является одним из наиболее важных регуляторов дифференцировки эндометрия, известной как децидуализация [27], что имеет ключевое значение для инвазии трофобласта. Высказывается мнение о важной роли сенсибилизации организма к прогестерону при развитии ПЭ [29]. Следует отметить, что в гене PGR имеются два различных промотора и несколько разных стартовых сайтов трансляции в первом экзоне для получения нескольких вариантов транскрипта, как кодирующих белок, так и не кодирующих полипептид (https://www.genecards.org). Большинство эффектов прогестерона в организме человека опосредуется его ядерными рецепторами, являющимися, по существу, белками, регулирующими транскрипцию генов [28]. Выделяют две основные изоформы ядерных рецепторов прогестерона — PGR-А и PGR-В, биологические эффекты которых (перечень регулируемых генов) значительно различаются (https://www.genecards.org). Следует отметить, что в ряде исследований установлено увеличение уровня экспрессии рецепторов прогестерона (при сниженной экспрессии ESR1 и повышенной экспрессии ESR2) в преэкламптических плацентах [30].
В ранее проведенных исследованиях выявлены ассоциации полиморфного локуса rs1042838 гена PGR, вовлеченного, по нашим данным, в формирование ПЭ (аллель Т повышает риск развития ПЭ), с идиопатическим невынашиванием беременности (аллель Т является рисковым) [31], развитием рака эндометрия (для аллеля Т OR=1,25) [32]. В то же время имеются исследования, свидетельствующие о связи аллеля Т rs1042838 гена PGR с поздним менархе и более коротким менструальным циклом [33], и работы, в которых не выявлены ассоциации полиморфного локуса rs1042838 с развитием эндометриоза [34], рака молочной железы [35].
Заключение
Полиморфизм rs1042838 гена PGR ассоциирован с развитием преэклампсии: генотип G/T (OR=1,54, 95% CI 1,02—2,33, p=0,04) и аллель T (OR=1,42, 95% CI 1,01—1,98, p=0,04) повышают риск развития преэклампсии, а генотип G/G (OR=0,65, 95% CI 0,43—0,97, p=0,04) и аллель G (OR=0,71, 95% CI 0,49—0,99, p=0,04) имеют протективное значение. Полиморфный локус rs1042838 гена PGR обладает выраженным регуляторным потенциалом — он определяет аминокислотную замену в полипептиде рецептора прогестерона (Val660Leu), связан с экспрессией гена PGR в культуре клеток фибробластов, подкожной жировой ткани, надпочечниках, влияет на уровень альтернативного сплайсинга транскрипта гена PGR-AS1 в яичниках, определяет афинность ДНК к четырем факторам транскрипции (AP-2rep, BDP1_disc3, CACD_1, Sp4), находится в регионе модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в культуре клеток мезодермы, производных трофобласта, яичниках.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ «Изучение генетических факторов репродуктивного здоровья женщин» (МД-3284.2022.1.4).
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Чурносов М.И.
Сбор и обработка материала — Головченко О.В., Абрамова М.Ю.
Статистический анализ данных — Головченко О.В., Пономаренко И.В.
Написание текста — Головченко О.В.
Редактирование — Чурносов М.И.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.