Морфологические маркеры митохондриальной дисфункции цитотрофобласта базальной пластинки плаценты при преэклампсии разной степени тяжести

Преэклампсия (ПЭ) — серьезное осложнение, возникающее во время беременности и оказывающее негативное влияние на мать и плод. Это одна из ведущих причин материнской и младенческой смертности [1]. При осложненном течении беременности патологические изменения развиваются во всех элементах функциональной системы «мать–плацента–плод». Плацента играет ключевую роль в течении и исходе беременности, выполняя множество важных функций, которые напрямую зависят от энергии, поставляемой митохондриями. Известно, что плацента при ПЭ подвержена митохондриальной дисфункции, что находит отражение в нарушении структуры митохондрий [2, 3].

В настоящее время, несмотря на большое внимание к изучению вопросов этиологии и патогенеза ПЭ, не разработаны иммуногистохимические и ультраструктурные маркеры диагностики митохондриальной дисфункции вневорсинчатого цитотрофобласта (ЦТБ), определяющего развитие плаценты, что подтверждает актуальность данного исследования [4—6].

Цель исследования — выявить морфологические маркеры митохондриальной дисфункции цитотрофобласта базальной пластинки плаценты у женщин с преэклампсией разной степени тяжести.

Проведен комплексный морфологический анализ 90 плацент от женщин, родоразрешенных на базе ФГБУ «Ивановский НИИ МиД им. В.Н. Городкова» Минздрава России. В 1-ю группу вошло 30 плацент от женщин с неосложненным течением беременности (группа контроля), во 2-ю — 30 плацент от женщин с умеренной ПЭ (УПЭ), в том числе на фоне хронической артериальной гипертензии (ХАГ), в 3-ю — 30 плацент от женщин с тяжелой ПЭ (ТПЭ), в том числе на фоне ХАГ. Критериями невключения являлись другие гипертензивные расстройства во время беременности, многоплодная и наступившая в результате вспомогательных репродуктивных технологий беременность, наличие врожденных пороков развития у плода.

Комплексное морфологическое исследование образцов плацент включало стандартные методики, иммуногистохимическое исследование и трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ) [7].

Обзорная гистология образцов базальной пластинки проводилась на гистологических срезах, полученных после стандартной парафиновой проводки плацент женщин при различных степенях тяжести ПЭ и включала описание клеток ЦТБ, децидуальной ткани, слоев фибриноида Рора и Нитабуха, а также патологических очагов в виде воспалительных, дистрофических изменений и кровоизлияний.

При проведении иммуногистохимических исследований по стандартному протоколу срезы инкубировали с биотинилированными вторичными антителами с последующей окраской DAB-хромогеном и гематоксилином Майера. Для оценки экспрессии митохондриального транскрипционного фактора A (TFAM) использовали первичные поликлональные козьи антитела к TFAM (TFAM, A-16 фирмы SantaCrus, США), кроличьи к полимеразе гамме (POLG), митохондриальной изоцитратдегидрогеназе (NADH+) и цитохрому C, рабочее разведение 1:200. С помощью системы подсчета HistoScore определялся индекс экспрессии:

ИЭ=∑P(i)/100,

где i — интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3; P(i) — процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью (C.M. McCarthyetal., 1985).

Для выявления структурных особенностей митохондрий использовали ТЭМ. Образцы плаценты размером 0,1 х 0,1 см фиксировали в растворе Караганова, Миллонинга с последующей постфиксацией 1% раствором четырехокиси осмия через батарею возрастающих по концентрации спиртов и завершали обезвоживанием в абсолютном ацетоне. Подготовленные с учетом определенных зон ультратонкие срезы просматривали и фотографировали в электронном микроскопе (ЭВМ — 100 АК).

Математические методы включали статистический анализ, осуществляемый в пакете StatisticaStatSoft, ver.13, методы клинической эпидемиологии с применением системы OpenEpi. Для оценки значимости распределения качественного признака между группами применяли критерий χ². Используя критерии Колмогорова и Шапиро—Уилка, осуществляли проверку рядов данных на нормальность распределения. Количественное описание величин с нормальным распределением выполняли с помощью подсчета среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Различия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента. Если распределение отличалось от нормального, значения величин представляли в виде медианы с указанием 25-го и 75-го процентилей — Me (Q25%–Q75%). Если распределение отличалось от нормального, достоверность различий между показателями оценивали с помощью критерия Манна—Уитни. Уровень значимости p<0,05 определяли как статистически значимый.

Плаценты исследуемых групп были сопоставимы по форме и типу прикрепления пупочного канатика. Значимо чаще при ТПЭ определялись гипоплазированные плаценты III степени (46,6%) по сравнению с УПЭ (13,3%; p<0,01).

В структуре патоморфологических изменений в плаценте независимо от степени тяжести ПЭ ведущее место занимали нарушения маточно-плацентарного кровообращения. Материнская и плодовая мальперфузия, геморрагические инфаркты, интрадецидуальные кровоизлияния, патогенетически связанные с нарушением инвазии ЦТБ, значимо чаще отмечались у женщин с ТПЭ (48,6%) по сравнению с аналогичным параметром в группе с УПЭ (11,3%; (p<0,01), что совпадает с данными проведенных исследований [3, 8, 9]. Доказана патогенетическая значимость ЦТБ в ремоделировании спиральных артерий. Кроме того, ЦТБ базальной пластинки определяет процессы имплантации и плацентации, а в III триместре беременности обеспечивает иммунологический гомеостаз в функциональной системе «мать–плацента–плод» [10]. По данным исследований ряда авторов [11], глубина проникновения инвазивных клеток ЦТБ в стенки спиральных артерий определяется морфофункциональным состоянием трофобласта. По нашим данным, при гистологическом исследовании трофобласта базальной пластинки выявлено, что в группе контроля и при УПЭ толщина базальной пластинки была больше, чем при ТПЭ, за исключением участков отхождения якорных ворсин (p<0,05). В плацентах при ТПЭ значимо чаще (60%) по сравнению с аналогичным параметром при УПЭ (30%) и с группой контроля (10%) определялись участки троекратного истончения базальной пластинки в сочетании с уменьшением удельной площади децидуальных (ДК) и цитотрофобластических клеток (p<0,05) (табл.1).

Таблица 1. Морфометрические параметры базальной пластинки плацент при преэклампсии, Me (Q25%–Q75%)

Примечание.Здесь и в табл. 2: коэффициент значимости разности результатов между группами: 1-й и 2-й — p₁; 1-й и 3-й — p₂; 2-й и 3-й — p₃.

Недифференцированные клетки светлоклеточного ЦТБ формировали тяжи, а высокодифференцированные объединялись в трабекулярные структуры. Уменьшенная по толщине базальная пластинка при ТПЭ была фрагментирована за счет очагов деструкции и разрывов с формированием различных по площади кровоизлияний. При этом из всех компонентов базальной пластинки при ТПЭ преобладающей субстанцией являлся фибриноид на фоне уменьшения удельной площади ДК и цитотрофобластических клеток (табл. 1), что совпадает с данными проведенного ранее исследования [12].

Особенности структурной перестройки ЦТБ при ПЭ зависят в том числе от энергии, вырабатываемой митохондриями клеток [3]. Митохондрии имеют собственную ДНК (мтДНК), которая кодирует субъединицы комплекса окислительного фосфорилирования и образования АТФ. Мутации мтДНК могут приводить к нарушению выработки энергии и в конечном счете — к гибели клетки [13].

При иммуногистохимическом исследовании плацент с антителами к белкам транскрипции (TFAM) и репликации (POLG), от которых напрямую зависят функции митохондрий [14, 15], в ЦТБ базальной пластинки определялась мембранная и цитоплазматическая экспрессия данных белков. В группах с ПЭ выявлено значимое снижение экспрессии TFAM и POLG по сравнению с группой контроля (рис. 1, табл. 2). Снижение экспрессии было максимально выражено при ТПЭ (p=0,000 во всех случаях) (см. табл. 2). Полученные данные согласуются с проведенными ранее исследованиями, свидетельствующими о снижении компенсаторных возможностей белков транскрипции для выработки АТФ при ПЭ, особенно при ее тяжелой степени [8].

Рис. 1. Экспрессия белка транскрипции мтДНК TFAM в ЦТБ базальной пластинки.

а — цитоплазматическая экспрессия TFAM при неосложненном течении беременности; б — очаговое скопление клеток ЦТБ с перинуклеарными включениями в группе умеренной преэклампсии; в — дистрофические изменения клеток ЦТБ с резким снижением иммунопозитивных включений при тяжелой преэклампсии. Иммуногистохимическая реакция, ×200.

Таблица 2. Индекс экспрессии иммуногистохимических маркеров митохондриальной дисфункции клеток цитотрофобласта базальной пластинки плацент у женщин с преэклампсией, Me (Q25%–Q75%)

До настоящего времени нет однозначного мнения о роли мутации мтДНК в развитии ПЭ и негативного ее влияния на активность дыхательной цепи. Имеются данные об изменении иммуногистохимических параметров, свидетельствующих о митохондриальной дисфункции, в эпителии ворсин при ПЭ [16], однако исследования особенностей и механизмов формирования АТФ в ЦТБ базальной пластики при этой патологии не проводились.

Основное действующее звено внутренней мембраны митохондрий — дыхательная цепь, включающая совокупность пяти белковых и небелковых комплексов-переносчиков электронов. Наиболее крупным и сложным энзимным комплексом дыхательной цепи является I комплекс (NADH+никотинамиддинуклеотид) [17]. При оценке экспрессии данного параметра в нашем исследовании отмечено значимое снижение экспрессии NADH+ в клетках ЦТБ при ПЭ по сравнению с группой контроля, а при ТПЭ снижение экспрессии было статистически значимым также и по сравнению с группой УПЭ (см. табл. 2).

Одним из не менее важных компонентов дыхательной цепи митохондрий является цитохром C, который участвует в клеточном дыхании путем переноса электронов во внутренней мембране митохондрий и в апоптозе клеток [18]. В обеих группах ПЭ индекс экспрессии данного параметра был достоверно снижен по сравнению с контрольной группой, различие экспрессии в группах УПЭ и ТПЭ было недостоверным (см. табл. 2).

Для оценки структурных особенностей митохондрий использовалась ТЭМ образцов базальной пластинки плацент. При УПЭ по сравнению с группой контроля выявлено двукратное уменьшение количества митохондрий как в перинуклеарных зонах, так и между цистернами гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) (рис. 2). При этом изменялось соотношение между овальными по форме и округлыми митохондриями в сторону увеличения числа округлых органелл, что обусловлено набуханием центральных отделов крист и деструкцией внутренней мембраны. В образцах плаценты при ТПЭ не определялись митохондрии, контактирующие с элементами ГЭР, в результате чего нарушалась структурная основа связи энергетического обмена между митохондриями и ГЭР. При этом встречались единичные органеллы с деструктивными изменениями мембраны (см. рис. 2). В ряде митохондрий обнаружены псевдовезикулы, образованные чаще остатками внутренней, реже наружной мембран, что совпадает с данными проведенного раннее исследования [19]. Распространенная деструкция крист завершается их некрозом.

Рис. 2. Ультраструктурные особенности митохондрий ЦТБ базальной пластинки плацент при преэклампсии.

а — очаговое скопление митохондрий с параллельно ориентированными кристами и участками просветления; б — нарушение упорядоченного расположения крист, вакуолизация крист митохондрий и цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума при умеренной преэклампсии; в — вакуолизация и деструкция крист митохондрий при тяжелой преэклампсии. Трансмиссионная электронная микроскопия. а, б — ×25 000, в — ×26 000.

Снижение экспрессии белков транскрипции (TFAM) и репликации (POLG) мтДНК, максимально выраженное при ТПЭ, в сочетании с нарушением функции дыхательной цепи и ультраструктурными изменениями митохондрий являются диагностическими критериями митохондриальной дисфункции цитотрофобласта базальной пластинки при беременности, осложненной ПЭ.

Структурную основу митохондриальной дисфункции клеток ЦТБ базальной пластинки составляют набухание, деструкция крист митохондрий и нарушение связи митохондрий и гранулярного эндоплазматического ретикулума.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования —Хизриева З.С., Кулида Л.В., Панова И.А.

Сбор и обработка материала —Хизриева З.С., Кулида Л.В.

Статистическая обработка —Хизриева З.С.

Написание текста —Хизриева З.С., Кулида Л.В.

Редактирование —Хизриева З.С., Кулида Л.В., Панова И.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.