Введение

Преэклампсия (ПЭ) связана с гипоксией утероплацентарного интерфейса¹. Это обусловлено нарушенной плацентацией, слабой миграцией и инвазией трофобласта в спиральные артерии и, как результат, нарушением их ремоделирования. Вследствие этого развивается персистирующая гипоксия, происходят гибель клеток плаценты, освобождение различных медиаторов и экзосом и циркуляция их в материнском кровотоке [1]. В периферической крови матери плацентарные биологические субстанции активируют эндотелий сосудов, что приводит к превалированию вазоконстрикции над вазодилатацией и подъему артериального давления. Дисфункция эндотелия на уровне почек ведет к появлению протеинурии.

Гипоксия активирует синтез гипоксией индуцируемого фактора-1α (ГИФ-1α), включающего три различные изоформы ГИФ-1, ГИФ-2, ГИФ-3. ГИФ-1, -2, -3 являются гетеродимерными транскрипционными факторами, формируемыми из кислородчувствительной α-субъединицы и кислороднечувствительной β-субъединицы. При нормоксии α-субъединица подвергается гидроксилированию, после чего убиквитинированию² с последующей протеосомальной деградацией. Гипоксия стабилизирует α-субъединицу ГИФ, которая, объединяясь с β-субъединицей и двумя кофакторами, образует комплекс. Он связывается с элементом, отвечающим на гипоксию (hypoxia response element) [2].

ГИФ-1α является ключевым фактором транскрипции, активируя многие гены, в том числе гены эритропоэтина и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Он играет ключевую роль в адаптации к тканевой гипоксии и воспалительному ответу иммунных клеток, участвуя в росте плаценты в I и II триместрах. VEGF также влияет на такие функции иммунной системы, важные для нормального развития беременности, как жизнеспособность, дифференцировка, миграция, фагоцитоз, изменение метаболизма с окислительного фосфорилирования на гликолиз. Он способствует переключению с T×2- на Т×1-ответ и М2-макрофагов на М1-макрофаги, важнейших патогенетических факторов, сопровождающих преэклампсию [3]. ГИФ-1α реагирует как на гипоксию, так и на анемию. Первый фактор является патологическим, а второй — осложнением, сопровождающим отдельных пациенток с ПЭ. Считается, что ГИФ-1α служит важнейшим биомаркером функции плаценты и васкуляризации при беременности, влияя посредством регуляции ангиогенных/антиангиогенных факторов. ГИФ-1α осуществляет связь между воспалительными сигнальными путями развитии ПЭ.

Цель исследования — изучение содержания ГИФ-1α, эритропоэтина, фактора роста эндотелия сосудов А (VEGF-А), мочевой кислоты (МК), трийодтиронина (T₃), тироксина (T₄), тиреоидстимулирующего гормона (ТСГ) в сыворотке крови и их возможной роли как молекул, участвующих в развитии гипоксии и воспаления при преэклампсии.

Материал и методы

В соответствии с целью исследования обследована 241 беременная. Женщины были разделены на 5 групп: 1-я группа — 51 пациентка с преэклампсией, у которой определялся ГИФ-1α, 2-я группа — 40 пациенток с преэклампсией, у которых определялся эритропоэтин, 3-я группа — 50 пациенток, у которых определялся VEGF-А, 4-я группа — 40 пациенток с ПЭ с определением T₃, T₄, ТСГ. Пациентки с преэклампсией были разделены на подгруппы с умеренной и тяжелой формами. Контрольную, 5-ю группу, составили 60 соматически здоровых беременных с неотягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом и физиологическим течением беременности.

Диагноз преэклампсии ставили при выявлении сочетания уровня артериального давления 140/90 мм рт.ст. и выше и протеинурии 300 мг/сут и больше, не обусловленной заболеванием почек. В основу диагностики ПЭ положены критерии МКБ-10. Всем беременным проведено клинико-лабораторное обследование и ультразвуковое исследование. Одновренменно с этим в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа исследован ГИФ-1α с использованием наборов Human HIF-1 alpha ELISA kit, Ray Biotech. Inc., чувствительность 61 пг/мл.

Эритропоэтин определяли с использованием наборов «Вектор БЕСТ» (Новосибирск). Чувствительность 0,5 мМЕ/мл.

VEGF-А определяли с помощью Human VEGF A ELISA, Bender Med System GmbH, Invitrogen, чувствительность 7,9 пг/мл.

Мочевую кислоту (МК) определяли в сыворотке крови на аппарате AU-680 с помощью стандартных наборов.

Свободный T₃, T₄ и ТСГ определяли на Access 2 Immunoassay System с помощью стандартных наборов.

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни, программа Statistica, версия 10.0. Данные представлены в виде M±m. Достоверными считали различия при p≤0,05.

Результаты и обсуждение

У беременных контрольной группы уровень ГИФ-1α в сыворотке крови был немного более 400 пг/мл (рис. 1). При ПЭ в общей группе (умеренная и тяжелая преэклампсия) его уровень повышался примерно в 1,3 раза. Индивидуальные показатели при ПЭ были более гетерогенными, чем в контрольной группе. Более высокие уровни ГИФ-1α были при тяжелой форме ПЭ, чем при умеренной (см. рис. 1). Это указывает на то, что уровень гипоксии, оцениваемый по ГИФ-1α, был более выражен при тяжелой ПЭ. Значительный разброс индивидуальных показателей ГИФ-1α при ПЭ, несомненно, отражает гетерогенную сущность патогенеза ПЭ. Если взять за основу последнее предложение по разделению ПЭ на субклассы [4], согласно которому выделяют 3 субкласса ПЭ: классическую, иммунологическую и родительскую, то гетерогенность показателей ГИФ-1α хорошо вписывается в эти 3 субкласса. Известно также, что уровень ГИФ-1α повышается в плаценте при ПЭ [5]. Это подтверждает наличие гипоксии плаценты при ПЭ. Патогенетическая значимость повышения экспрессии ГИФ-1α в плаценте при ПЭ обусловлена тем, что ГИФ-1α регулирует такие ключевые функции, необходимые для успешного вынашивания беременности, как инвазия трофобласта и его ангиогенная функция [6]. В отношении повышения экспрессии ГИФ-1α в плаценте существует однозначный ответ: да, повышается. Однако механизм этого повышения не совсем понятен, так как это может рассматриваться как ответ на тканевую гипоксию или обусловлено нарушением деградации протеина. Данные, полученные S. McCraken и соавт. [7] в отношении ранней ПЭ, свидетельствуют в пользу второго варианта, хотя авторы не исключают и первый вариант, ссылаясь на гетерогенность ПЭ.

Рис. 1. Уровень ГИФ-1α в контрольной группе (а), при умеренной (б) и тяжелой (в) преэклампсии.

* — p<0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе.

Следует отметить, что биологические сигналы, регулирующие экспрессию ГИФ-1α, можно разделить на кислородзависимые и кислороднезависимые. В первом случае индукция ГИФ-1α осуществляется гипоксией, в то время как во втором — провоспалительными цитокинами и другими факторами, например, активными формами кислорода (АФК).

Недавно было показано, что мочевая кислота способна активировать ГИФ-1α [8, 9]. Нами изучен уровень МК в сыворотке крови при различных формах ПЭ. Показано, что в общей массе обследованных пациенток уровень МК при ПЭ повышен. Однако при дальнейшем изучении нами этого вопроса оказалось, что у ряда пациенток с этой патологией примерно в 23,3% наблюдений при умеренной ПЭ и в 18,03% наблюдений при тяжелой ПЭ не выявлено такого повышения. Данный факт мы расцениваем следующим образом и по отношению к ГИФ-1α предлагаем такое его объяснение. Гипоксия повышает уровень МК за счет метаболизма повышенного количества АТФ в сыворотке крови [10], конечным продуктом которого является МК. Два последних этапа этого процесса — конверсия гипоксантина в ксантин и ксантина в МК — осуществляются ферментом ксантиноксидазой. Побочными продуктами этой конверсии являются супероксид-анион и перекись водорода, которые вместе с другими факторами стабилизируют уровень ГИФ-1α. Этот путь активации ГИФ-1α мы обозначаем как ксантиноксидазазависимый. При нормальном уровне МК при ПЭ активация ГИФ-1α происходит, возможно, с вовлечением ядерного фактора каппа B (NF-κВ), который активируется через toll-подобные рецепторы, рецептор α-фактора некроза опухолей (TNF-α) 1-го типа. В пользу этого свидетельствует ранее найденное нами повышение уровня TNF-α при ПЭ [10]. Этот путь мы называем «ксантиноксидазанезависимый путь активации ГИФ-1α».

Отметим, что активация NF-κВ, ответственного за растормаживание экспрессии провоспалительных цитокинов, необходима для полной активации ГИФ-1α. В данном случае хорошо видна связь в цепи гипоксия —ГИФ-1α— NF-κВ—воспаление — центральных механизмов, представляющих патогенез ПЭ. При этом отметим, что NF-κВ также чувствителен к гипоксии. Важно, что гипоксия и воспаление взаимосвязаны через ось ГИФ-1α—NF-κВ. При обеих формах ПЭ есть гипоксия, но при ранней она первична, а при поздней вторична как следствие воспаления.

ГИФ-1α является главным фактором переключения с окислительного на гликолитический метаболизм. Это переключение происходит из-за того, что ГИФ-1α при гипоксии повышает экспрессию пируватдегидрогеназы-киназы-1 (PDK1) [11]. Этот энзим ингибирует митохондриальную пируватдегидрогеназу (PDH) посредством фосфорилирования, предотвращая конверсию пирувата в ацетил-коэнзим A, лимитируя тем самым его доступность для цикла трикарбоновых кислот. Это угнетает потребление кислорода митохондриями и перенаправляет пируват в лактат. Такое переключение с оксидативного на гликолитический метаболизм эффективно уменьшает потребление кислорода митохондриями. Это, с одной стороны, оказывает положительное влияние в виде снижения продукции митохондриями АФК, защищая клетки от повреждения [12]. Отрицательной стороной такого переключения является снижение синтеза АТФ, так как гликолиз в продукции АТФ на молекулу глюкозы менее эффективен, чем окислительный метаболизм. Для предотвращения биоэнергетического кризиса повышенный уровень ГИФ-1α усиливает вход глюкозы через глюкозные транспортеры 1-го и 3-го типов, экспрессируемые плацентой. Более того, ГИФ-1α повышает экспрессию всех гликолитических ферментов, обеспечивающих повышенный гликолиз. ГИФ-1α повышает экспрессию лактатдегидрогеназы А (ЛДГ А) [13] благодаря чему происходит конверсия пирувата в лактат и монокарбоксилатного транспортера 4-го типа (MCT-4), обеспечивающего выход лактата из клетки. Из этого хорошо видно, что ГИФ-1α влияет на все звенья гликолиза. Усиливает ГИФ-1α глютаминолиз и биосинтез глютатиона, который защищает клетки от окислительного стресса. Это происходит потому, что ГИФ-1α повышает экспрессию глютатионовых транспортеров. Внутри клетки глютамин конвертируется в глютамат, из которого образуется глютатион.

Роль повышения концентрации ГИФ-1α в сыворотке крови при ПЭ, установленное нами, а также важность данных литературы, указывающих на повышение его в плаценте, заключаются еще и в том, что ГИФ-1α способен активировать Д3-дейодиназу, ответственную за метаболизм T₄, что создает состояние локального дефицита йодотиронинов при гипоксии [14]. Измерение уровней T₃ и T₄ при ПЭ в сыворотке крови выявило снижение уровня T₃ до 4,08±0,14 пмоль/л и до 4,85±0,1 пмоль/л в контрольной группе (p<0,001; n=33). В то же время содержание T₄ имело только тенденцию к снижению — 9,22±0,24 и 10,05±0,47 пмоль/л соответственно (p>0,05; n=33). Уровень ТСГ был повышен — соответственно 3,38±0,35 мМЕ/мл при ПЭ и 2,14±0,13 мМЕ/мл в контрольной группе (p<0,01). Приведенные данные указывают на субклинический гипотиреоз, развивающийся при ПЭ. В подтверждение этого положения можно привести результаты исследования S. Kalkunte и соавт. [15], показавших, что транстиретин — белок, переносящий тироксин, структурно и функционально нарушен при ПЭ и его уровень снижен в сыворотке крови, в то время как в плаценте обнаружены отложения его агрегированных форм. Особый интерес к транстиретину объясняется тем, что введение его агрегированной формы индуцирует ПЭ-подобные симптомы у беременных ИЛ-10-нокаутных мышей [15]. Локальный дефицит йодтиронинов T₄ и T₃ на уровне плаценты отрицательно влияет на транспорт L-аргинина в эндотелиальные клетки [16]. Другими словами, при ПЭ блокируется поступление в плаценту двух субстратов для генерации NO — L-аргинина и кислорода, при недостатке которых эндотелиальная NO-синтаза (eNO) начинает функционировать по нестандартному пути, генерируя АФК.

Гипоксический сигнал — важный компонент адаптации к гипоксии, однако он нарушается при ПЭ, что видно из наших данных по уровню эритропоэтина и VEGF-А — важнейших медиаторов, связанных с ГИФ-1α.

Уровень эритропоэтина (ЭПО) был повышен при умеренной ПЭ по сравнению с таковым в контрольной группе (рис. 2). Эритропоэтин входит в семейство ангиогенных факторов, которые регулируются ГИФ-1α [17]. И если в костном мозге он стимулирует эритропоэз, то в матке — ангиогенез.

Рис. 2. Уровни эритропоэтина: в контрольной группе (а), при средней (б), тяжелой (в) преэклампсии и при сочетании преэклампсии и анемии (г).

* — p<0,05 по сравнению с показателем в контрольной группе;

** — p<0,01 по сравнению с показателем в контрольной группе.

Статистически значимого повышения эритропоэза (а это видно по количеству эритроцитов: в контрольной группе 4,2±0,08·10¹²/л, при ПЭ — 3,9±0,21·10¹²/л) не наблюдалось при ПЭ по нескольким причинам. Во-первых, повышение ЭПО способно стимулировать эритропоэз при острой, но не хронической гипоксии [18]. Наши данные указывают в пользу того, что при ПЭ развивается хроническая гипоксия. Во-вторых, ЭПО повышает артериальное давление за счет стимуляции экспрессии эндотелина-1 эндотелиальными клетками [19]. В-третьих, ЭПО тормозит экспрессию ГИФ-1α, так необходимого при гипоксии [20]. Возможно, эти факторы являются главными, определяющими несоответствие между уровнем гипоксии при ПЭ и реакцией эритрона. ГИФ-1α позволяет адаптироваться клеткам к гипоксии. ГИФ-дефицитные клетки в условиях гипоксии гибнут за счет повышенной митохондриальной генерации АФК [11]. Важным моментом может быть и то, что данный уровень ЭПО не обеспечивает достаточную защиту от гипоксии.

Нами установлен также интересный факт, что при ПЭ, сопровождающейся анемией (Hb 92,66 (73—99 г/л); см. рис. 2), уровень ЭПО повышался более значительно, чем при ПЭ без анемии. Мы расцениваем это как адаптивный момент, направленный на то, что ЭПО в данных условиях в основном несет антигипоксическую функцию. Нарушение в оси ГИФ-1α—эритропоэтин—йодотиронины, найденное нами, подтверждается и данными литературы, показавшими, что ГИФ-1α и йодтиронины действуют синергично на экспрессию гена эритропоэтина [21].

Уровень VEGF-А в сыворотке был снижен при ПЭ по сравнению с таковым в контрольной группе (рис. 3).

Рис. 3. Уровень VEGF-А в контроле (а) и при преэклампсии (б).

* — p<0,01 по сравнению с показателем в контрольной группе.

В плаценте экспрессия VEGF-А также снижалась по сравнению с показателем в контрольной группе [22]. Классически связь ГИФ-1α—VEGF работает как положительная регуляция: повышение уровня ГИФ-1α приводит к повышению концентрации VEGF как фактора роста сосудов, необходимого для нивелирования гипоксии. Однако в данном случае мы видим обратную картину пониженного уровня VEGF на фоне высокого уровня ГИФ-1α. Снижение концентрации VEGF-А можно объяснить повышением экспрессии растворимого рецептора 1-го типа VEGF, который связывает VEGF-А, в результате чего обнаруживается его пониженный уровень в сыворотке крови.

Основным ограничением данного исследования является то, что определение разных показателей проводилось у разных непересекающихся между собой групп.

Заключение

Таким образом, гипоксия как один из патогенетических факторов ПЭ ведет к активации ГИФ-1α и связанных с ним генов. Однако их продукты, такие как ЭПО и VEGF-А, по-разному представлены при преэклампсии. Действие ЭПО и VEGF-А как ангиогенных факторов блокируется, в результате создаются условия, тормозящие адаптацию к гипоксии, особенно в условиях растущего плода. Ксантиноксидазный фактор, рассмотренный в этой статье, позволяет предположить, что эти данные, с одной стороны, имеют отношение к гетерогенности преэклампсии, с другой — указывают, что ингибирование одного механизма в целом может не влиять на течение ПЭ, так как компенсируется другими путями. А это имеет отношение к терапии ПЭ, предполагая ее многокомпонентность. Оптимальная концентрация йодтиронинов у матери, а также локальный и системный субклинический гипотиреоз, зарегистрированный нами, играют критическую роль в балансе воспалительного ответа при ПЭ, регулируя секрецию цитокинов и факторов роста в плаценте и децидуа.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Щербаков В.И., Поздняков И.М., Ширинская А.В.

Сбор и обработка материала — Щербаков В.И., Поздняков И.М., Ширинская А.В.

Статистическая обработка — Щербаков В.И., Поздняков И.М., Ширинская А.В.

Написание текста — Щербаков В.И., Поздняков И.М., Ширинская А.В.

Редактирование — Щербаков В.И., Поздняков И.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of the authors:

Concept and design of the study — Shcherbakov V.I., Pozdnyakov I.M., Shirinskaya A.V.

Data collection and processing — Shcherbakov V.I., Pozdnyakov I.M. Shirinskaya A.V.

Statistical processing of the data — Shcherbakov V.I., Pozdnyakov I.M. Shirinskaya A.V.

Text writing — Shcherbakov V.I., Pozdnyakov I.M., Shirinskaya A.V.

Editing — Shcherbakov V.I., Pozdnyakov I.M.

Authors declare lack of the conflicts of interests.

¹англ. interface — область контакта, взаимодействия.

² лат. ubique — повсюду, встречающийся повсюду.