Введение

Преэклампсия остается наиболее тяжелым осложнением беременности, заболеваемость составляет примерно 2—8% во всем мире. Единственным эффективным методом лечения преэклампсии является своевременное родоразрешение, без которого могут возникнуть тяжелые осложнения, угрожающие здоровью и жизни как матери, так и потомства [1, 2]. Более того, у пациенток с преэклампсией в анамнезе значительно повышена вероятность развития сердечно-сосудистой патологии, метаболических и психических расстройств, заболеваний почек, а потомство таких пациенток имеет высокие риски развития артериальной гипертензии, эндокринных нарушений метаболизма и ментальных дефицитов [3—5].

Патогенез преэклампсии до сих пор полностью не выяснен. Многочисленные исследования показывают, что преэклампсия ассоциирована с определенными генами предрасположенности: геном эндотелиальной NO-синтазы, генами белков ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), генами протромбина и фактора Лейдена, ингибитора активатора плазминогена, фактора роста сосудистого эндотелия, лептина и др. [6—10]. Кроме того, показана ассоциация между данной линейкой генов и повышением рисков развития сердечно-сосудистых, цереброваскулярных, метаболических заболеваний, хронической болезни почек, которые одновременно являются факторами риска развития преэклампсии [11—13]. Таким образом, исследования, посвященные изучению генетического профиля, продолжают оставаться актуальными, а разработанные на их основе технологии прогнозирования преэклампсии позволят рассчитывать индивидуальный риск развития этой патологии, своевременно начать профилактические мероприятия и улучшить исходы для матери и ребенка.

Цель исследования: изучить молекулярно-генетические особенности беременных с преэклампсией, выделить вероятные предикторы данной патологии.

Материал и методы

Проведено проспективное когортное обследование методом сплошной выборки 95 беременных, которые были родоразрешены в клинике ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» (ЮУГМУ) Минздрава России (г. Челябинск) в 2021 г. Критериями включения в исследование явились диспансерное наблюдение в женской консультации, наличие медицинской документации, согласие на участие в исследовании. Критериями исключения из исследования стали срок беременности менее 22 нед, наличие онкологических заболеваний, туберкулеза, тяжелой соматической патологии в стадии декомпенсации, ментальных расстройств и психических заболеваний, наркомании. План исследования соответствовал законодательству Российской Федерации, международным этическим нормам и нормативным документам о работе исследовательских организаций. Контрольную 1-ю группу составили 29 женщин, у которых течение беременности не осложнилось преэклампсией (ацетилсалициловую кислоту в сроке беременности 12—16 нед они не получали), в основную (2-ю) группу вошли 66 беременных с преэклампсией (32 наблюдения умеренной преэклампсии, 34 — тяжелой). Изучены семейный и личный анамнез пациенток, исходы беременности. Результаты получены методом анкетирования и анализа медицинской документации: диспансерной карты беременной, истории родов. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России (протокол №1 от 17.01.2020). Диагноз, нозологические формы акушерской патологии устанавливались согласно действующим клиническим рекомендациям (https://cr.minzdrav.gov.ru/clin_recomend). Молекулярно-генетическое исследование проведено с использованием реагентов на амплификаторе, детектирующим ДТ-прайм с изучением образцов ДНК, выделенных из периферической венозной крови 25 беременных 1-й группы и 62 пациенток 2-й группы: 30 наблюдений умеренной преэклампсии, 32 — тяжелой. Определены полиморфизмы следующих генов: rs1799963 (FII 20210 G>A, протромбин), rs6025 (FV 1691 G>A, проакцелерин, фактор Лейдена), rs6046 (FVII 10976 G>A, проконвертин), rs5985 (F13 103 G>T, фибриназа), rs1800790 (FGB (–455) G>A, фибриноген), rs1126643 (ITGA2 807 C >T, интегрин-альфа-2), rs5918 (ITGB3 1565 T>C, интегрин-бета-3), rs1799889 (PAI-1 (–675) 5G> 4G, SERPINE1, ингибитор активатора плазминогена-1), rs2010963 (VEGFA (–634) G>C, фактор роста сосудистого эндотелия A), rs4961 (ADD1 1378 G >T, аддуцин-1-альфа, rs699 (AGT 704 T >C, ангиотензиноген), rs4762 (AGT 521 C>T, ангиотензиноген), rs5186 (AGTR1 1166 A>C, рецептор 1-го типа к ангиотензину II (ATII), rs1403543 (AGTR2 1675 G>A, рецептор 2-го типа к ATII), rs1799998 (CYP11B2 (–344) C>T, альдостеронсинтаза), rs5443 (GNB 825 C>T, G-протеин бета-3), rs1799983 (NOS3 (–786) T>C, эндотелиальная NO-синтаза), rs1799983 (NOS3 894 G>T, эндотелиальная NO-синтаза). Распределение полиморфизмов оценивалось по закону Харди—Вайнберга.

Статистические методы исследования выполнены с помощью лицензионного статистического пакета программ SPSS Statistica for Windows 17.0. Категориальные переменные представлены в виде частот (%), различия оценивали с помощью критерия хи-квадрат (χ²) Пирсона, различия при p<0,05 принимали статистически значимыми. Для оценки вероятности возникновения события (преэклампсии) для каждого из факторов рассчитаны отношение шансов (ОШ) с указанием 95% доверительного интервала (ДИ).

Анализ межгенных взаимодействий при преэклампсии проводили методом многофакторного сокращения размерности (multifactor dimensionality reduction — MDR), реализованным в программном обеспечении MDR (https://sourceforge.net/projects/mdr) [14, 15]. Коррекцию на множественные сравнения осуществляли с помощью пермутационного теста в программном обеспечении MDRpt (https://sourceforge.net/projects/mdr/files/mdrpt) [14, 15]. Для визуализации ген-генных и генно-средовых взаимодействий, оценки характера этих взаимодействий (синергизм, аддитивное взаимодействие, антагонизм) и их силы (доля вклада в энтропию*) построены дендрограммы. Направленность взаимоотношений между представленными генами для визуализации фенотипа обозначена линиями разного цвета: красного — выраженный синергизм, оранжевого — умеренный синергизм, синего — выраженный антагонизм, зеленого — умеренный антагонизм, коричневого — аддитивное взаимодействие. Сила и направленность взаимодействий представлены в процентах энтропии¹.

Для оценки независимой ассоциации факторов с развитием преэклампсии (1/0) использовали метод множественной логистической регрессии с расчетом бета-стандартизованных коэффициентов (β) для изучения вклада каждого предиктора в прогнозирование события, и их стандартных ошибок (SE); точного значения уровня значимости p для модели в целом и для каждого из анализируемых факторов [16, 17].

Результаты

По результатам исследования (табл. 1) частота диагностики генотипов 5G/4G и 4G/4G, а также аллеля 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1 у женщин с преэклампсией оказалась достоверно выше, чем в контрольной группе. При этом частота выявления гомозиготных мутаций 4G/4G данного гена статистически значимо (p=0,047) преобладала при умеренной преэклампсии (40%).

Таблица 1. Результаты генотипирования по определению полиморфизмов генов

Следует отметить, что генотип A/A полиморфизма rs6046 гена FVII в изученной когорте мы не выявили (см. табл. 1). Отмечена отчетливая тенденция (p=0,067) к повышению частоты гетерозиготных вариантов rs6046 при умеренной преэклампсии (40%) по сравнению с таковым при тяжелой (18,8%).

Особенностей генотипов rs699 гена AGT у пациенток с преэклампсией мы не зарегистрировали, однако частота аллеля C полиморфизма AGT T704C у беременных с преэклампсией, чаще умеренной степени (40%; p=0,016), оказалась достоверно выше (p<0,016), чем в контрольной группе (см. табл. 1). Распространенность аллеля A полиморфизма G1675A (rs1403543) гена AGTR2 у беременных с преэклампсией, особенно тяжелой (78,1%; p=0,044), была статистически значимо выше, чем у беременных контрольной группы (p=0,003).

У пациенток с преэклампсией (см. табл. 1) отмечена отчетливая тенденция к увеличению частоты аллеля T полиморфизмов rs1799983 гена NOS3 (p<0,065).

При анализе частоты полиморфизма rs2010963 гена VEGFA статистически значимых различий в разных группах не выявлено (см. табл. 1). Однако патологический гомозиготный генотип C/C у пациенток с тяжелой преэклампсией встречался достоверно чаще, чем в контрольной группе (21,9% против 4%; p=0,039). Аналогичная тенденция отмечена и при умеренной преэклампсии (13,3%).

При этом у беременных основной группы выявлены статистически значимое увеличение частоты регистрации аллеля T полиморфизма rs1799998 гена CYP11B2 (p=0,007) и аллеля T полиморфизма rs4961 гена ADD1 (p=0,03), а также тенденция к увеличению распространенности аллеля C полиморфизма rs2070744 гена NOS3 (p=0,053) (см. табл. 1).

Кроме того, нами изучены генные полиморфизмы FII G20210A (rs1799963), FV G1691A (rs6025), F13 G103T (rs5985), FGB G(–455)A (rs1800790), ITGA2 C807T (rs1126643), ITGB3 T1565C (rs5918), AGT C521T (rs4762), AGTR1 A1166C (rs5186), GNB С825Т (rs5443), при этом статистически значимых особенностей не выявлено.

Для изучения межгенных взаимодействий при преэклампсии использован метод MDR, преимуществами которого являются одновременное обнаружение и описание нескольких генетических точек, связанных с клиническим маркером, отсутствие предполагаемой конкретной генетической модели (режим наследования указывать не нужно), сведение к минимуму ложноположительных результатов из-за многократного тестирования [14]. Дендрограмма энтропии (или дерево кластеризации) позволяет оценить взаимодействие полиморфизмов генов при преэклампсии (рис. 1).

Рис. 1. Дендрограмма межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов при преэклампсии.

Согласно результатам MDR (см. рис. 1) выделено 5 полиморфизмов генов-кандидатов при преэклампсии: VEGFA G(–634) C (rs2010963), ITGB3 T1565C (rs5918), CYP11B2 C(–344)T (rs1799998), PAI-1 5G(–675)4G (rs1799889), AGTR2 G1675A (rs1403543), наибольший процент энтропии зарегистрирован для полиморфизма PAI-1 5G(–675)4G (6,49%). В результате кластеризации сформированы две группы полиморфизмов: «Кластер 1» — VEGFA G(–634) C, ITGB3 T1565C; «Кластер 2» — CYP11B2 C(–344)T, PAI-1 5G(–675)4G, AGTR1 A1166C. Анализ дендрограммы межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов при преэклампсии позволяет сделать следующие выводы: для взаимодействия полиморфных локусов VEGFA G(–634) C и ITGB3 T1565C зарегистрирован выраженный синергизм (линии красного цвета); для взаимодействия полиморфных локусов PAI-1 5G(–675)4G и AGTR2 G1675A характерен выраженный антагонизм (линии синего цвета); все остальные взаимодействия имеют умеренный антагонистический или аддитивный эффекты.

Проанализированы вероятные эффекты ассоциированного взаимодействия полиморфизмов генов-кандидатов преэклампсии, результаты представлены на рис. 2 и 3.

Рис. 2. Вероятные эффекты ассоциированного взаимодействия полиморфизмов генов-кандидатов преэклампсии.

Рис. 3. Диаграмма модели ассоциированного взаимодействия полиморфизмов генов-кандидатов преэклампсии 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1/T полиморфизма rs1799998 гена CYP11B2.

Таким образом, ассоциированными с повышенной вероятностью развития преэклампсии являются пары аллелей 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1/T полиморфизма rs1799998 гена CYP11B2 и 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1/C полиморфизма rs5186 гена AGTR1.

Дополнительно с целью улучшения качества раннего прогноза преэклампсии, построения прогностической модели развития преэклампсии использован метод логистической регрессии. Для математической обработки предложены параметры, содержащие анамнестические данные, результаты первичного осмотра в сроке беременности до 12 нед гестации (систолическое и диастолическое артериальное давление — САД и ДАД соответственно, антропометрические показатели) и молекулярно-генетические характеристики пациенток. Результаты логистической регрессии представлены в табл. 2 (предложены нами впервые).

Таблица 2. Прогностическая модель преэклампсии

Примечание. Exp(β) — оценка соотношения шансов.

Специфичность прогностической модели преэклампсии (умеренной/тяжелой) составила 84%, чувствительность — 95,2%, точность — 92%. Разработанное нами уравнение логистической регрессии G представлено ниже:

G2=(x1·2,829)+(x2·4,331)–(x3·3,524)– – x4·3,807)+(x5·22,422)–(x6·6,521)+ +(x7·3,104)–(x8·3,975)+(x9·2,685)–1,946, где

— ×1 — САД 120 мм рт.ст. и более (при первой явке): да = 1, нет = 0;

— ×2 — ДАД 80 мм рт.ст. и более (при первой явке): да = 1, нет = 0;

— ×3 — служащая: да = 1, нет = 0;

— ×4 — срочные роды в анамнезе: да = 1, нет = 0;

— ×5 — преэклампсия в анамнезе: да = 1, нет = 0;

— ×6 — AGT C521T (rs4762), генотип TT: да = 1, нет = 0;

— ×7 — AGTR2 G1675A (rs1403543), генотип AA: да = 1, нет = 0;

— ×8 — ITGB3 T1565C (rs5918), аллель C: да = 1, нет = 0;

— ×9 — PAI-1 5G(–675)4G (rs1799889), аллель 4G: да = 1, нет = 0;

При G ≥ 0 женщина относится к группе высокого риска развития преэклампсии.

Обсуждение

Изучение генетической архитектуры заболеваний человека очень важно для поиска высокоэффективных диагностических подходов, в том числе биомаркеров с высокой прогностической способностью. Современные эпидемиологические и генетические исследования указывают, что преэклампсия связана с некоторыми генами, однако имеющиеся данные о распространенности и клинической значимости генетических полиморфизмов часто противоречивы, а потенциальные механизмы остаются неясными из-за сложных этнических, географических и других факторов [7—10].

Преэклампсия характеризуется нарушениями про- и антикоагулянтных, фибринолитических процессов и изменениями функции, морфологии и количества тромбоцитов. Прогнозирование общего гемостатического баланса пациентки и, в частности, ее индивидуального риска развития тромбоза или кровотечения может быть сложной задачей [18]. По результатам нашего исследования, особенностей генных полиморфизмов тромбофилий FII G20210A (rs1799963) и FV G1691A (rs6025), а также протромботических вариантов полиморфизмов FGB G(–455)A (rs1800790), ITGA2 C807T (rs1126643), ITGB3 T1565C (rs5918) у пациенток с преэклампсией не установлено. При этом выявлена повышенная частота генотипов 5G/4G и 4G/4G, а также аллеля 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1 у беременных с преэклампсией, чаще умеренной. PAI-1 играет роль основного компонента системы фибринолиза, является ингибитором урокиназы, протеина C и тканевого активатора плазминогена, снижает активность апоптоза, а также изменяет баланс в сторону атерогенных липопротеинов. Согласно современным исследованиям полиморфизм гена rs1799889 PAI-1 ассоциирован с развитием преэклампсии, что согласуется с полученными нами результатами [7, 9, 19]. Кроме того, следует отметить наличие отчетливой тенденции (p=0,067) к повышению частоты гетерозиготных вариантов rs6046 гена FVII при умеренной преэклампсии в сравнении с тяжелой. Активированный фактор гена FVII (FVIIa) после повреждения эндотелия связывается с тканевым фактором (TF), что инициирует каскад коагуляции [20]. Мутация гена FVII в полиморфизме G10976A приводит к снижению активности фактора FVII, что определяет антикоагулянтные влияния данной трансверсии гена, а также обсуждаются протективные эффекты в отношении развития преэклампсии [21]. Нельзя исключить, что наличие гетерозиготной аллели гена FVII у пациенток с умеренной преэклампсией служит определенным защитным фактором в отношении развития тяжелой формы патологии.

Согласно современным представлениям основой для формирования преэклампсии является нарушение ремоделирования спиральных артерий миометрия, связанное с изменением взаимоотношений про- и антиангиогенных факторов, в частности, VEGFA, который участвует в имплантации плодного яйца, эмбриональном васкулогенезе и ангиогенезе, ремоделировании спиральных артерий эндо- и миометрия [22]. По результатам данного исследования отмечено, что патологический гомозиготный генотип C/C у пациенток с тяжелой преэклампсией встречался достоверно чаще, чем в группе контроля. Согласно метаанализу X. Wang и соавт. [8] полиморфизм –634G/C связан с риском развития преэклампсии у европейцев (C против G: ОШ 1,428; 95% ДИ 1,141—1,778; p=0,002), F. Keshavarzi и соавт. [23] зарегистрировали повышенную экспрессию мРНК плацентарного гена VEGF в плаценте пациенток с генотипом –634CC. Однако G. Ding и соавт. (2022) не выявили значимых связей мутации гена VEGF с развитием преэклампсии [24].

РААС является одним из основных регуляторов сосудистого тонуса, который поддерживает системное артериальное давление и электролитный гомеостаз. К главным представителям РААС относится ангиотензин II (ATII). Через рецептор ATII 1-го типа (ATR1) ATII способствует вазоконстрикции, росту сосудов, воспалительной реакции, а также увеличивает внутриклеточную концентрацию свободного Ca²⁺ и активность Rho/Rho-киназы в гладких мышцах сосудов. ATII через эндотелиальный рецептор ATII 2-го типа (ATIIR) активирует eNOS и увеличивает выработку оксида азота NO и простациклина (PGI₂), которые противостоят вызванной ATII вазоконстрикции. NO влияет на агрегацию тромбоцитов и сосудистый тонус, реологические свойства крови, передачу нервного импульса между нейронами, принимает участие в иммунных реакциях [25]. По данным литературы, наличие низкофункциональных аллелей полиморфизмов генов РААС связано с высоким риском развития артериальной гипертензии, в том числе во время беременности [26]. Действительно, в результате настоящего исследования при преэклампсии зарегистрированы высокая частота аллеля C полиморфизма AGT T704C и аллеля A полиморфизма AGTR2 G1675A, а также отчетливая тенденция к увеличению частоты аллеля T полиморфизмов rs1799983 гена NOS3. Сходные результаты получили E. Rokotyanskaya и соавт. [10]: наличие генотипа AGT 704C служит фактором риска развития преэклампсии, при этом гетерозиготный генотип AGTR2 1675G/A в сочетании с полиморфными вариантами аллеля NOS3 (–786)C был ассоциирован с высоким риском развития хронической артериальной гипертензии. G. Ding и соавт. [24] не выявили существенного влияния полиморфизма гена AGT на развитие преэклампсии.

Одновременно согласно результатам нашего исследования протективным в отношении преэклампсии оказалось наличие аллеля T полиморфизма rs4961 гена ADD1 и аллеля T полиморфизма rs1799998 гена CYP11B2, а также, вероятно, аллеля C полиморфизма rs2070744 гена NOS3. Указанные полиморфизмы генов по результатам ряда исследований отмечены как вероятные предикторы преэклампсии [10]. Ген ADD1 связан с белком аддуцином, который отвечает за внутриклеточный транспорт ионов калия и натрия. Измененный белок, кодируемый аллелем T гена ADD1, активирует (Na+, K+)-аденозинтрифосфотазу в почечных канальцах и тем самым способствует задержанию натрия в организме, что является пусковым механизмом развития гипертензии [27]. Однако в исследовании M. Azimi-Nezhad и соавт. [28] особенностей ADD1 G1378T при беременности, осложненной преэклампсией, не установлено, что согласуется с нашими результатами.

Ген CYP11B2 кодирует фермент альдостеронсинтазу, который участвует в синтезе альдостерона и реагирует на состояние электролитного баланса и объем плазмы [26, 29]. X. Wang и соавт. [29] по результатам метаанализа 73 исследований указывают, что при наличии аллеля CYP11B2 –344T снижался риск развития преэклампсии. Аналогичные данные представлены в исследовании M. Azimi-Nezhad и соавт. [28]: ОШ составило 0,71 (95% ДИ 0,28—1,79; p=0,025). Результаты этих исследований согласуются с полученными нами данными.

Согласно результатам применения MDR при кластеризации сформированы две группы полиморфизмов: «Кластер 1» — VEGFA G(–634) C (rs2010963), ITGB3 T1565C (rs5918): для этих полиморфизмов отмечен выраженный синергизм, и «Кластер 2» — CYP11B2 C(–344)T (rs1799998), PAI-1 5G (–675)4G (rs1799889), AGTR1 A1166C (rs1403543): для взаимодействия полиморфных локусов PAI-1 5G(–675)4G и AGTR2 G1675A характерен выраженный антагонизм. Выявлены ассоциированные пары аллелей полиморфизмов генов, связанных с повышенной вероятностью развития преэклампсии: аллели 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1/T полиморфизма rs1799998 гена CYP11B2 и 4G полиморфизма rs1799889 гена PAI-1/C полиморфизма rs5186 гена AGTR1.

На основании анамнестических данных и молекулярно-генетических характеристик беременных предложена модель раннего прогноза преэклампсии, специфичность которой составила 84%, чувствительность — 95,2%, точность — 92%.

Заключение

Дальнейшее понимание генетики преэклампсии имеет значение не только для исследователей фундаментальной науки, но и для клиницистов. Интегративные подходы к таким данным, как полигенные оценки риска, позволяют прогнозировать вероятность заболевания на основе панели генетических вариаций полиморфизмов, особенно в сочетании с другими клиническими маркерами, оцениваемыми во время беременности. Однако эффекты вариаций генетических полиморфизмов зачастую более тонкие, и их интерпретация становится все труднее, а эффективность технологий генотипирования заболеваний часто зависит от этнического и географического происхождения пациенток, а также других факторов, что определяет необходимость дальнейших исследований в этой области.

Таким образом, расчет индивидуальных рисков развития преэклампсии с использованием современных молекулярно-генетических технологий позволяет персонифицировать подход, своевременно выявить принадлежность беременных к группе высокого риска развития данной патологии и обеспечить раннюю профилактику заболевания.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сюндюкова Е.Г., Чулков В.С., Медведев Б.И.

Сбор и обработка материала — Рябикина М.Г., Наймушина Ю.В.

Статистическая обработка — Наймушина Ю.В.

Написание текста — Сюндюкова Е.Г., Чулков В.С., Медведев Б.И., Рябикина М.Г.

Редактирование — Сюндюкова Е.Г., Рябикина М.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Syundyukova E.G., Chulkov V.S., Medvedev B.I.

Data collection and processing — Naimushina Yu.V., Ryabikina M.G.

Statistical processing of the data — Naimushina Yu.V.

Text writing — Syundyukova E.G., Chulkov V.S., Medvedev B.I., Ryabikina M.G.

Editing — Syundyukova E.G., Ryabikina M.G.

Authors declare lack of the conflicts of interests.

¹ греч. entropium — поворот внутрь.